本發(fā)明屬于化學(xué)分析檢測(cè)領(lǐng)域，其是一種操作相對(duì)簡(jiǎn)便、毒性小、成本低、準(zhǔn)確性高、靈敏度高的定量檢測(cè)污泥中含硫氨基酸的方法。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，污水處理廠引發(fā)的惡臭問(wèn)題越來(lái)越引起人們的重視。其中，含硫物質(zhì)在導(dǎo)致惡臭的產(chǎn)生中起到重要作用。在污水處理廠中，厭氧消化過(guò)程中所產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)硫（VOSCs），如甲硫醇（MM）、二甲基硫醚（DMS）等，無(wú)機(jī)硫，如硫化氫（H2S）等已被確定為引起惡臭的最主要物質(zhì)。這類物質(zhì)臭閾值極低，且其產(chǎn)生的惡臭非常嚴(yán)重，即使微量的VOCS和H2S也能對(duì)惡臭污染產(chǎn)生極大的貢獻(xiàn)。研究表明，在市政污泥的厭氧消化階段，形成VOSCs的前體物質(zhì)主要為半胱氨酸（Cys）和甲硫氨酸（Met）。在厭氧條件下，這些含硫的前體物質(zhì)經(jīng)過(guò)一系列機(jī)制，如，生物還原、水解、甲基化、金屬催化氧化等轉(zhuǎn)化為VOSCs和H2S。Met會(huì)產(chǎn)生MM，MM經(jīng)過(guò)兩條途徑轉(zhuǎn)化為H2S：其一，不經(jīng)DMS過(guò)程直接由MM轉(zhuǎn)化為H2S；其二，先由MM氧化為DMS，DMS再通過(guò)產(chǎn)甲烷菌作用產(chǎn)生H2S。而Cys不參與中間VOSCs的形成，直接經(jīng)微生物作用產(chǎn)生H2S。因此，明確硫元素在厭氧消化過(guò)程中的物質(zhì)流，為后續(xù)控制惡臭過(guò)程提供理論依據(jù)，必需建立適當(dāng)?shù)姆椒ǘ繖z測(cè)污泥中的Cys和Met。含硫氨基酸的檢測(cè)主要有液相色譜法、離子色譜法、氣相色譜法、電化學(xué)法、毛細(xì)管電泳法等。其中，高效液相色譜法和離子色譜法較為常用。其中，由離子色譜原理制造的氨基酸分析儀是目前國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定使用的分析儀器。但由于氨基酸分析儀專屬性強(qiáng)、檢測(cè)成本高，故使用的普及率較低。目前針對(duì)含硫氨基酸的檢測(cè)主要集中于食品及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，針對(duì)復(fù)雜的環(huán)境樣品，如污水和污泥中含硫氨基酸的檢測(cè)尚未見報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明是為了彌補(bǔ)當(dāng)前污泥物料中含硫氨基酸檢測(cè)的空缺和技術(shù)問(wèn)題，提供一種切實(shí)可行、檢測(cè)成本低、靈敏度高、準(zhǔn)確性高、毒性小的定量檢測(cè)復(fù)雜環(huán)境樣品污泥中含硫氨基酸的方法。本發(fā)明提出的一種定量測(cè)定污泥中含硫氨基酸的方法，具體步驟如下：（１）將污泥樣品于冷干機(jī)冷干，用球磨機(jī)對(duì)冷干樣品進(jìn)行研磨，而后過(guò)篩，低溫保存；（２）將含（半）胱氨酸、蛋氨酸的污泥樣品經(jīng)過(guò)甲酸氧化，制備性質(zhì)穩(wěn)定的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜；（３）用濃鹽酸對(duì)污泥氧化液進(jìn)行水解，水解液經(jīng)3kD濾膜超濾，去除污泥中大分子雜質(zhì)，純化氨基酸；（４）將污泥中的氨基酸與衍生劑鄰苯二甲醛進(jìn)行衍生反應(yīng)，生成有熒光吸收的衍生產(chǎn)物；進(jìn)樣針吸取2.5μl，pH=10.2的硼酸緩沖鹽溶液，吸取0.5μl污泥氨基酸超濾液，吸取0.5μl鄰苯二甲醛衍生劑，吸取3μl空氣以最大速率混合6次；吸取32μl，pH=6.5的二水合磷酸二氫鈉稀釋液，吸取空氣18μl以最大速率混合2次，完成氨基酸衍生過(guò)程；（５）將衍生產(chǎn)物用高效液相色譜進(jìn)行分析，定量檢測(cè)污泥中的含硫氨基酸。本發(fā)明中，步驟（１）具體為：取污泥樣品40ml于50ml離心管于-20℃冷凍；將冷凍污泥置于冷干機(jī)中，在-40℃條件下冷干3天；將所得污泥冷干樣用球磨機(jī)于4500rmp條件下研磨10min；將研磨后的污泥樣品過(guò)200目篩，于-50℃冰箱保存。本發(fā)明中，步驟（２）具體為：取步驟（１）所得產(chǎn)物0.0500g于水解管中，加入過(guò)甲酸1.5ml，于50℃條件下，水浴氧化30min，得到污泥氧化液；向污泥氧化液中加0.4ml偏重亞硫酸鈉溶液，終止氧化反應(yīng)；所述過(guò)甲酸溶液是將30%的過(guò)氧化氫溶液與88%的甲酸溶液按照1：9的體積比混合，在常溫下放置1h制得，此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配；所述偏重亞硫酸鈉溶液是將33.6g偏重亞硫酸鈉加水定容至100ml制得。本發(fā)明中，步驟（３）具體為：向步驟（２）所得產(chǎn)物置于水解管中，加入5.1ml濃度為8.2mol/l的鹽酸溶液，向水解管中通氮?dú)?0s，密封水解管，將水解管置于105℃烘箱中水解22h；取出水解管，置于室溫冷卻，開啟水解管，將水解管內(nèi)污泥水解液移入茄形旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，并用1ml濃度為0.1mol/l鹽酸洗出殘留水解液，反復(fù)三次，將污泥水解液于40℃、-10bar條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；用0.1mol/l鹽酸將茄形旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中的氨基酸樣品溶出，并定容至10ml；取定容后的水解液400μl于3kD超濾離心管中，在13805g離心力下離心40min，制得污泥氨基酸超濾液；所述8.2mol/l鹽酸溶液是將純鹽酸683ml定容至1000ml制得；所述0.1mol/l鹽酸溶液是將純鹽酸8.3ml定容至1000ml制得。本發(fā)明中，步驟（４）中所述pH=10.2的硼酸緩沖鹽溶液，稱取2.50g硼酸，加水溶解，于100ml容量瓶定容得0.4mol/l硼酸溶液，用10mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)pH至10.2；所述10mol/l氫氧化鈉溶液，稱取40g氫氧化鈉，加水溶解，于100ml容量瓶定容制得；所述鄰苯二甲醛溶液，稱取80.0mg鄰苯二甲醛，加7ml硼酸緩沖液溶解，再加1ml乙腈、125μl巰基丙酸混勻；所述pH=6.5的二水合磷酸二氫鈉稀釋液，稱取6.2408g磷酸二氫鉀，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氫氧化鈉調(diào)pH為6.5，再加4ml磷酸。本發(fā)明中，步驟（５）中高效液相色譜分析中，所述流動(dòng)相A是將甲醇、乙腈、水按照體積比為45:45:10混合制得，使用前超聲脫氣30min；所述流動(dòng)相B是稱取2.6408g磷酸二氫鉀，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氫氧化鈉調(diào)pH為6.5制得，使用前過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，超聲脫氣30min；激發(fā)波長(zhǎng)Ex為340nm、發(fā)射波長(zhǎng)Em為460nm；所述流動(dòng)相梯度如表１所示：表１：本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明是將復(fù)雜環(huán)境樣品污泥冷干、過(guò)篩保存，檢測(cè)時(shí)將污泥樣品中的半胱氨酸（胱氨酸）、蛋氨酸經(jīng)過(guò)甲酸氧化，將其轉(zhuǎn)化為磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，再經(jīng)酸水解將氧化產(chǎn)物磺基丙氨酸和蛋氨酸砜從多肽和蛋白質(zhì)中釋放出來(lái)，污泥水解樣品經(jīng)超濾除雜提純，純化樣品與鄰苯二甲醛進(jìn)行在線衍生反應(yīng)，衍生產(chǎn)物經(jīng)色譜柱進(jìn)行高效液相色譜分析。無(wú)需使用價(jià)格昂貴的氨基酸分析儀，毒性小，切實(shí)可行、檢測(cè)成本低、靈敏度高、準(zhǔn)確性高。附圖說(shuō)明圖1本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)樣品分析圖譜。圖2本發(fā)明污泥樣品分突圖譜。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例１；1.儀器設(shè)備及試劑安捷倫1260G1321BFLD熒光檢測(cè)器，安捷倫1260G1311C四元泵，安捷倫1260G1329B標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)進(jìn)樣器，安捷倫1260G1316A柱溫箱，安捷倫ZORBAXEclipseAAA3.5μm×4.6mm×150mm，烘箱，水解管，電熱恒溫水浴鍋，3KMillipore超濾離心管，高速離心機(jī)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，樣品瓶，內(nèi)插管。半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品、磺基丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品及蛋氨酸砜標(biāo)準(zhǔn)品（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）、脫水污泥（上海嘉定污水處理廠）、30%過(guò)氧化氫、88%過(guò)甲酸、鹽酸（優(yōu)級(jí)純）、偏重亞硫酸鈉、硼酸、磷酸（HPLC級(jí)）、鄰苯二甲醛（HPLC級(jí)）、巰基丙酸（HPLC級(jí)）、二水合磷酸二氫鈉（HPLC級(jí)）等（除特殊說(shuō)明外，其它均為分析純）。2.檢測(cè)方法2.1方法原理污泥中的胱氨酸和半胱氨酸、蛋氨酸經(jīng)過(guò)甲酸氧化后，分別生成性質(zhì)穩(wěn)定的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，氧化產(chǎn)物在高溫酸水解下從蛋白質(zhì)和多肽中釋放出來(lái)，與鄰苯二甲醛發(fā)生衍生反應(yīng)生成帶熒光特性的衍生產(chǎn)物，衍生產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行定量分析。氧化反應(yīng)及衍生反應(yīng)方程式如下：氧化反應(yīng)方程式：衍生方程式：上述反應(yīng)方程式表明過(guò)甲酸可將胱氨酸的二硫鍵、半胱氨酸的巰基、蛋氨酸的硫醚鍵中的硫氧化為硫?；?，而不破壞氨基，鄰苯二甲醛在巰基丙酸的參與下與氨基發(fā)生衍生反應(yīng)，生成具有熒光吸收的衍生產(chǎn)物。2.2方法步驟按如下步驟進(jìn)行：a.取污泥40ml于50ml離心管于-20℃冷凍；將冷凍污泥置于冷干機(jī)中，在-40℃條件下冷干3天；將污泥冷干樣用球磨機(jī)于4500rmp條件下粉碎10min;將粉碎后的污泥樣品過(guò)200目篩，于-50℃冰箱保存。b.取上述a步驟的污泥樣品0.0500g于水解管中，加入過(guò)甲酸1.5ml，于50℃條件下，水浴氧化30min；向污泥氧化液中加0.4ml偏重亞硫酸鈉溶液，終止氧化反應(yīng)；所述過(guò)甲酸溶液是將30%的過(guò)氧化氫溶液與88%的甲酸溶液按照1：9（V：V）混合，在常溫下放置1h制得，此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配；所述偏重亞硫酸鈉溶液是將33.6g偏重亞硫酸鈉加水定容至100ml制得。c.向上述b步驟制得的污泥氧化液中加入5.1ml濃度為8.2mol/l的鹽酸溶液；向水解管中通氮?dú)?0s，密封水解管，將水解管置于105℃烘箱中水解22h；取出水解管，置于室溫冷卻，開啟水解管，將水解管內(nèi)污泥水解液移入茄形旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，并用1ml濃度為0.1mol/l鹽酸洗出殘留水解液，反復(fù)三次，將污泥水解液于40℃、-10bar條件下，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；用0.1mol/l鹽酸將茄形旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中的氨基酸樣品溶出，并定容至10ml。取定容后的水解液400μl于3kD超濾離心管中，于13805g離心力下離心40min制得污泥氨基酸超濾液；所述8.2mol/l鹽酸溶液是將純鹽酸683ml定容至1000ml制得；所述0.1mol/l鹽酸溶液是將純鹽酸8.3ml定容至1000ml制得。d.將上述c步驟所得的污泥氨基酸超濾液200μl加入內(nèi)插管中，依據(jù)如下程序步驟進(jìn)行在線衍生：進(jìn)樣針吸取2.5μlpH=10.2的硼酸緩沖鹽溶液，吸取0.5μl污泥氨基酸超濾液，吸取0.5μl鄰苯二甲醛衍生劑，吸取3μl空氣以最大速率混合6次；吸取32μlpH=6.5的二水合磷酸二氫鈉稀釋液，吸取空氣18μl以最大速率混合2次，完成氨基酸衍生過(guò)程；所述pH=10.2的硼酸緩沖鹽溶液，稱取2.50g硼酸，加水溶解，于100ml容量瓶定容得0.4mol/l硼酸溶液，用10mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)pH至10.2；所述10mol/l氫氧化鈉溶液，稱取40g氫氧化鈉，加水溶解，于100ml容量瓶定容制得；所述鄰苯二甲醛溶液，稱取80.0mg鄰苯二甲醛，加7ml硼酸緩沖液溶解，再加1ml乙腈、125μl巰基丙酸混勻；所述pH=6.5的二水合磷酸二氫鈉稀釋液，稱取2.6408g磷酸二氫鉀，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氫氧化鈉調(diào)pH為6.5，再加4ml磷酸。e.將衍生后的樣品進(jìn)行高效液相色譜分析，色譜流相及梯度是：動(dòng)相A、流動(dòng)相B、流速、洗脫梯度、激發(fā)波長(zhǎng)Ex=340nm、發(fā)射波長(zhǎng)Em=460nm；所述流動(dòng)相A是將甲醇、乙腈、水按照體積比為45:45:10混合制得，使用前超聲脫氣30min；所述流動(dòng)相B是稱取2.6408g磷酸二氫鉀，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氫氧化鈉調(diào)pH為6.5制得，使用前過(guò)0.22μm濾膜過(guò)濾，超聲脫氣30min；所述流動(dòng)相梯度如表1所示；3.檢測(cè)結(jié)果3.1磺基丙氨酸和蛋氨酸砜標(biāo)準(zhǔn)品分析檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確稱取磺基丙氨酸標(biāo)準(zhǔn)品42.3mg（濃度25nmol/μl）、蛋氨酸砜標(biāo)準(zhǔn)品45.3mg（濃度25nmol/μl），溶于水中，定容至10ml，制備25nmol/μl的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。使用時(shí)，將儲(chǔ)備液稀釋成系列梯度50、100、200、300、400、500pmol/μl，按2.2方法中d步驟、e步驟進(jìn)行處理，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；腔彼岷偷鞍彼犴繕?biāo)準(zhǔn)品（100pmol/μl）分離譜圖如圖1，圖中1為磺基丙氨酸；2為蛋氨酸砜；標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程、線性范圍、檢出限(三倍信噪比)及定量限（十倍信噪比）見表2：表23.2污泥樣品分析結(jié)果污泥樣品分析圖譜見圖2，圖中1為磺基丙氨酸（胱氨酸及半胱氨酸氧化產(chǎn)物）；2為蛋氨酸砜（蛋氨酸氧化產(chǎn)物）。污泥樣品中，磺基丙氨酸、蛋氨酸砜與周圍氨基酸分離效果好，其與左右氨基的分離度分別為（-）/13.1、（2.19）/5.6，均符合藥典中分離度大于1.5的規(guī)定。同一污泥樣品，一分為六，采用2.2所述方法連續(xù)處理6次，污泥中胱氨酸和蛋氨酸含量結(jié)果見表3：表3在同一污泥樣品，加入半胱氨酸和蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品，按2.2方法處理分析樣品，計(jì)算加標(biāo)回收率（n=3）。加標(biāo)回收率結(jié)果見表4：表4當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3