本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域，尤其涉及一種非診斷目的的檢測HCV抗體的方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus，HCV)是單股正鏈RNA病毒，屬黃病毒科嗜肝病毒屬。HCV經(jīng)過血液傳播，感染人類可引發(fā)肝炎，并易發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化、甚至肝癌。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告，全世界約有1.3～1.5億人感染HCV病毒，每年新增300～400萬例病毒感染病例，約50萬人死于HCV感染相關(guān)的肝病，HCV已成為嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題。因此，篩查部分人群尤其是高危人群的HCV抗體很有必要，選擇一種靈敏、準(zhǔn)確、及時(shí)、重復(fù)性好且窗口期短的HCV病毒檢測方法，對于HCV病毒的診療具有重要意義。

目前，臨床上監(jiān)測HCV感染的實(shí)驗(yàn)室方法有分子生物學(xué)方法檢測丙肝病毒核酸和血清學(xué)方法檢測血清HCV抗體，分子生物學(xué)方法試劑較為貴重，且操作復(fù)雜，而血清學(xué)方法檢測HCV抗體與之相比較，有著操作簡單、費(fèi)用低廉等好處，是目前應(yīng)用最廣泛的用于流行病學(xué)調(diào)查、臨床丙型肝炎患者的篩查和診斷的檢測項(xiàng)目，可為丙型肝炎的早發(fā)現(xiàn)和治療提供可靠依據(jù)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)是HCV抗體檢測最常用的方法。然而ELISA的檢測下限仍具有局限性，不能滿足感染早期低濃度的HCV抗體水平的檢測。

雜交鏈反應(yīng)(hybridization chain reaction，HCR)是一種新型高效的核酸擴(kuò)增方法，HCR可以在無酶的條件下實(shí)現(xiàn)DNA的擴(kuò)增。中國發(fā)明專利申請CN103940989A公開了一種基于HCR和單分子計(jì)數(shù)的免疫熒光技術(shù)檢測TNF-α。已有HCV抗體篩查方法仍存在諸多問題，需要建立檢測靈敏高、便捷的檢測方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種HCV抗體免疫檢測方法及試劑盒，以降低HCV抗體的檢測下限濃度，提高檢測靈敏度。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過HCR體系引入ELISA進(jìn)行信號放大來實(shí)現(xiàn)HCV抗體的檢測。該方法利用間接法ELISA捕獲血清中的HCV抗體，通過生物素-親和素系統(tǒng)引入HCR體系，HCR體系在常溫下進(jìn)行擴(kuò)增，形成DNA雙鏈聚合物。該聚合物標(biāo)記了生物素，可以和親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶結(jié)合，從而進(jìn)行顯色檢測。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種非診斷目的的HCV抗體免疫檢測方法，包括：

使HCV抗原特異性地捕獲檢測樣本中的HCV抗體，然后加入生物素標(biāo)記二抗，孵育形成抗原-抗體-生物素標(biāo)記二抗復(fù)合物；

在鏈霉親和素存在的條件下，加入生物素化引物Biotin-I，孵育使所述復(fù)合物與Biotin-I結(jié)合，然后加入生物素化的發(fā)卡鏈H1和發(fā)夾鏈Biotin-H2進(jìn)行雜交反應(yīng)；

加入親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，催化底物液顯色，通過測定吸光度進(jìn)行HCV抗體的定量檢測；

所述Biotin-I堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG CTC TAC TTT TT-biotin-3’；

所述H1堿基序列為5’-GTA GAG CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’；

所述Biotin-H2的堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG TTT TT-Biotin-3’。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，將HCV抗原包被于酶標(biāo)板上，用封閉液處理后，將含有HCV抗體的檢測樣本加入微孔板，36～38℃溫育，使HCV抗原特異性地捕獲HCV抗體；加入生物素化羊抗人IgG在36～38℃溫育，在微孔板上形成抗原-抗體-生物素標(biāo)記二抗復(fù)合物。

所述生物素標(biāo)記二抗可以為生物素化的羊抗人IgG或生物素化的鼠抗人IgG。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，H1和Biotin-H2先經(jīng)下述預(yù)處理：經(jīng)95～98℃水浴1～3min后，立即冰浴。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，免疫反應(yīng)之后，向微孔板中加入鏈霉親和素在36～38℃溫育，甩去孔中液體后拍干，加入Biotin-I在36～38℃溫育，使所述復(fù)合物與Biotin-I結(jié)合。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，加入H1和Biotin-H2，室溫下反應(yīng)1～3h，使H1和Biotin-H2打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)、交替雜交，形成有缺口的雙鏈DNA聚合物。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，加入親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶在36～38℃溫育后倒出液體，加入底物緩沖液及底物液在36～38℃溫育，再加入終止液，混勻后比色。

本發(fā)明還提供一種HCV抗體免疫檢測試劑盒，包括：

HCV抗原、生物素標(biāo)記二抗、鏈霉親和素、生物素化引物Biotin-I、生物素化的發(fā)卡鏈H1、發(fā)夾鏈Biotin-H2和親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶；

所述Biotin-I堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG CTC TAC TTT TT-biotin-3’；

所述H1堿基序列為5’-GTA GAG CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’；

所述Biotin-H2的堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG TTT TT-Biotin-3’。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述HCV抗原濃度為115～125ng/mL；

所述生物素標(biāo)記二抗?jié)舛葹?.5～2.2μg/mL；

所述鏈霉親和素濃度為1.3～1.6μg/mL；

所述Biotin-I濃度為8～12nM，配置時(shí)加入SPSC緩沖液；

所述H1和Biotin-H2濃度均為180～220nM，配置時(shí)加入SPSC緩沖液；

所述親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶濃度為22～28μg/mL。

在一個(gè)具體實(shí)施方式中，還包括包被液、封閉液、洗液、底物液、底物緩沖液和終止液；包被液為含115～125ng/mL HCV抗原的8～12mM PBS緩沖液；封閉液為含鮭魚精DNA 40～60μg/mL的0.8～1.2％BSA溶液。

本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)HCR是利用一組互補(bǔ)的、動(dòng)力學(xué)受限的發(fā)夾探針來實(shí)現(xiàn)雜交的鏈反應(yīng)，它是在等溫、無酶的條件下進(jìn)行的，穩(wěn)定而廉價(jià)。本發(fā)明將HCR引入了ELISA，本發(fā)明中抗體與酶是一對多的關(guān)系，在利用抗原抗體反應(yīng)保證檢測特異性的同時(shí)，利用HCR進(jìn)行信號放大，實(shí)現(xiàn)了HCV抗體的超靈敏檢測，檢測下限低至4.68pg/mL，比傳統(tǒng)ELISA至少提高2個(gè)數(shù)量級。

(2)本方法操作簡便，無需特殊儀器，且具有易于自動(dòng)化、穩(wěn)定性強(qiáng)、毒性低等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1是本發(fā)明HCR-ELISA檢測HCV抗體的原理示意圖；

圖2是傳統(tǒng)ELISA和HCR-ELISA定量檢測不同濃度HCV抗體的結(jié)果對比；

圖3是40例臨床標(biāo)本檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明所述“室溫”具有本領(lǐng)域公知的含義，具體是指20-30℃，優(yōu)選20-25℃。

圖1是本發(fā)明HCR-ELISA檢測HCV抗體的原理示意圖。HCV抗原包被于微孔板上，特異性地捕獲血清中的HCV抗體。加入生物素化的羊抗人IgG(免疫球蛋白G)后，在微孔板上形成了抗原-抗體-生物素羊抗人IgG復(fù)合物。在鏈霉親和素存在的條件下，通過生物素-親和素之間的作用，這些復(fù)合物可進(jìn)一步與生物素標(biāo)記的引發(fā)鏈I(Biotin-I)結(jié)合。加入發(fā)夾H1和Biotin-H2，引發(fā)鏈可催化H1和Biotin-H2打開發(fā)夾結(jié)構(gòu)，H1和Biotin-H2交替雜交，形成有缺口的雙鏈DNA聚合物，加入SA-HRP，該酶催化底物液顯色，使信號得以放大顯色。因此利用簡易的紫外分光光度計(jì)即可對血清中的抗體進(jìn)行定量檢測。

在一個(gè)具體的實(shí)施方式中，本發(fā)明的一種基于雜交鏈反應(yīng)的HCV抗體免疫檢測方法，包括以下步驟：

(1)間接法ELISA捕獲檢測樣本中的HCV抗體：將HCV抗原包被于微孔板上，冷藏過夜。加入封閉液室溫放置2～4h后棄去封閉液，拍干冷藏備用。將檢測樣本加入微孔板，36～38℃溫育0.5～1h，HCV抗原可特異性地捕獲血清中的HCV抗體。加入生物素化羊抗人IgG 36～38℃溫育0.5～1h后，在微孔板上形成抗原-抗體-生物素鼠抗人IgG復(fù)合物。每步反應(yīng)之后均用PBST洗液洗板，以除去未結(jié)合的試劑；

(2)基于HCR信號放大的免疫檢測技術(shù)：免疫反應(yīng)之后，向微孔板中加入的鏈霉親和素，36～38℃溫育20～40min。甩去孔中液體后拍干，加入Biotin-I，36～38℃溫育20～40min后洗板，加入H1和Biotin-H2，混勻，室溫下放置使其反應(yīng)1～3h。洗板除去未結(jié)合的發(fā)夾鏈；

(3)顯色及信號檢測：加入親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶，36～38℃溫育20～40min，洗板后充分拍干，加入底物緩沖液及底物液，36～38℃溫育20～40分鐘。加入終止液，混勻后比色。

其中，HCV抗原濃度為115～125ng/mL；生物素標(biāo)記二抗?jié)舛葹?.5～2.2μg/mL；鏈霉親和素(SA)濃度為1.3～1.6μg/mL；Biotin-I濃度為8～12nM，配置時(shí)加入SPSC緩沖液；H1和Biotin-H2濃度為180～220nM，配置時(shí)加入SPSC緩沖液；親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶(SA-HRP)的濃度為22～28μg/mL。

所述生物素化引物(Biotin-I)的堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG CTC TAC TTT TT-biotin-3’，如SEQ ID NO.1所示；

所述發(fā)卡鏈H1(H1)的堿基序列為5’-GTA GAG CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’如SEQ ID NO.2所示；

所述發(fā)夾鏈Biotin-H2的堿基序列為5’-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG TTT TT-Biotin-3’如SEQ ID NO.3所示。

步驟(2)中H1和Biotin-H2需如下預(yù)處理：經(jīng)95～98℃沸水浴1～3min后，立即冰浴，冷藏保存?zhèn)溆?。煮沸可使發(fā)夾結(jié)構(gòu)打開成為單鏈DNA。

需要特別說明的是，本發(fā)明方法之所以能夠用于HCV抗體的檢測，Biotin-I、發(fā)卡鏈H1和發(fā)夾鏈Biotin-H2的選擇至關(guān)重要。本發(fā)明人是經(jīng)大量的試驗(yàn)篩選、偶然得出SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的序列。特別的是，在該序列基礎(chǔ)上取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)核苷酸，均無法實(shí)現(xiàn)HCV抗體的檢測或并不能降低檢測下限濃度、提高檢測靈敏度。

下面結(jié)合附圖和一個(gè)具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例1

實(shí)施例中用到的各種溶液配方如下：

磷酸鈉-氯化鈉緩沖溶液(sodium phosphate-sodium chloride buffer solution，SPSC)(50mM Na₂HPO₄/1.0M NaCl)：17.9g的Na₂HPO₄·12Biotin-H2O，58.5g的NaCl加少許超純水溶解，用鹽酸調(diào)pH至7.5，定容至100mL。

10mM磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)(pH＝7.4)：8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄·12Biotin-H2O、0.24g KBiotin-H2PO₄溶解到1L超純水中，用鹽酸調(diào)節(jié)pH＝7.4，高壓滅菌后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

Biotin-I的配制：將按已知序列合成的3.3nmol Biotin-I用33μl超純水溶解至100μM，并用SPSC緩沖液稀釋至10nM。分裝，-20℃冷凍保存?zhèn)溆?，使用前避免反?fù)凍融。

H1和Biotin-H2的配制：將按已知序列合成的2.1nmol H1用21μl超純水溶解，2.2nmol Biotin-H2用21μl超純水溶解，用SPSC緩沖液稀釋至200nM。-20℃冷凍保存?zhèn)溆茫褂们氨苊夥磸?fù)凍融。

所用到的洗液、底物緩沖液、底物液和終止液，為ELISA的常用試劑。

本實(shí)施例的基于雜交鏈反應(yīng)的HCV抗體免疫檢測方法，具體步驟如下：

(一)間接法ELISA捕獲檢測樣本中的HCV抗體：

(1)H1和Biotin-H2預(yù)處理：200nM的H1和Biotin-H2經(jīng)98℃沸水浴2min后，立即冰浴，保存在4℃?zhèn)溆茫?/p>

(2)將120ng/mL的HCV抗原溶液(含有HCV抗原120ng/mL的10mM PBS溶液)注入96孔聚苯乙烯微孔板中，每孔200μL，4℃過夜；甩去包被液，每孔加入封閉液(含鮭魚精DNA 50μg/mL的1％BSA溶液)200μL，室溫放置2h后棄去封閉液，拍干4℃冷藏備用；

(3)將100μL含有不同濃度的HCV抗體的樣本加入微孔板，37℃水浴箱溫育1h；

(4)甩去孔中液體后，PBST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100μL 1.8μg/mL(1:4000)生物素化羊抗人IgG溶液，37℃水浴箱溫育1h；

(二)基于HCR信號放大的免疫檢測技術(shù)：

(5)甩去微孔中液體后，PBST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100μL 1.5μg/mL的SA，37℃水浴箱溫育30min；

(6)甩去孔中液體后拍干，加入100μL 10nM的Biotin-I，37℃溫育30min；

(7)甩去孔中液體后，常規(guī)洗液洗一遍，浸泡60s，拍干，加入200nM的H1和Biotin-H2各50μL，混勻，室溫下放置使其反應(yīng)1h；

(三)顯色及信號檢測：

(8)甩去孔中液體后，PBST洗板1次，浸泡60s，拍干，加入100μL 25μg/mL的SA-HRP，37℃溫育30min后倒出液體；

(9)將含2％的Tween 20的PBS洗液注滿各孔，靜置60s后棄去孔內(nèi)洗液，重復(fù)5次后拍干即可；

(10)加入底物緩沖液(含過氧化脲的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液)及底物液(含TMB的溶液)各50μL，輕輕振蕩混勻，置37℃水浴箱溫育30分鐘。再加入終止液(2mol/L硫酸溶液)50μL，混勻后比色；

(11)反應(yīng)溶液450nm處的吸光度值(OD)使用RT 6100微孔板分光光度計(jì)進(jìn)行測定。

對該實(shí)施例所建立方法進(jìn)行檢測性能考察，結(jié)果如下：

配制不同濃度的HCV抗體樣本，使?jié)舛确謩e為0、10^-11、10^-10、10^-9、10^-8g/mL，檢測方法同實(shí)施例1，考察450nm處OD值與HCV抗體濃度之間的關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)HCV抗體濃度在10^-11g/mL至10^-8g/mL的范圍時(shí)，HCV抗體濃度與450nm處吸光度的吸光度值呈擬線性關(guān)系(附圖2)。檢測下限為4.68pg/mL,，比傳統(tǒng)ELISA至少提高2個(gè)數(shù)量級。因此，HCR-ELISA法定量檢測HCV抗體具有較高的靈敏度。

采用本發(fā)明實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)步驟對40例臨床患者血清標(biāo)本進(jìn)行檢測，同時(shí)與商品化的HCV抗體ELISA檢測試劑盒(珠海麗珠試劑股份有限公司)進(jìn)行對比，結(jié)果如附圖3所示，兩種方法檢測結(jié)果基本一致，說明本發(fā)明檢測HCV抗體具有較好的準(zhǔn)確性。

作為對比試驗(yàn)，采用如下的序列檢測HCV抗體：

Biotin-I堿基序列為5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC TTT TTT TTT T-biotin-3’；

Biotin-H1堿基序列為5’-GTA GAG ATG CGG TGG TCC TTG AGA CAA AGT TCT CAA GGA CCA CCG CAT-biotin-3’；

H2的堿基序列為5’-TCT CAA GGA CCA CCG CAT CTC TAC ATG CGG TGG TCC TTG AGA ACT TTG-3’；

其他步驟和參數(shù)與實(shí)施例1相同，結(jié)果顯示，本發(fā)明所用序列所得檢測下限為4.68pg/mL,優(yōu)于對比序列的檢測下限8.42pg/mL。

SEQUENCE LISTING

<110> 中南大學(xué)

<120> 一種非診斷目的的HIV抗體免疫檢測方法及試劑盒

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agtctaggat tcggcgtgct ctacttttt 29

<210> 2

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtagagcacg ccgaatccta gactcaaagt agtctaggat tcggcgtg 48

<210> 3

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agtctaggat tcggcgtggg ttaacacgcc gaatcctaga ctactttgtt ttt 53