本發(fā)明屬于新型功能材料與生物傳感檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于TiO₂介晶納米材料的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器的制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

白細(xì)胞介素6（IL-6），簡(jiǎn)稱白介素6，參與了大量的生物活性過程，如雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)等。此外，IL-6是診斷疾病，包括糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、抑郁癥，阿爾茨海默病、癌癥等的潛在因素。各種分析方法已經(jīng)應(yīng)用于各種疾病中IL-6的檢測(cè)分析，包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定，表面等離子體共振，熒光芯片，化學(xué)發(fā)光免疫分析法，電化學(xué)免疫和電化學(xué)發(fā)光免疫分析。盡管這些分析方法具有許多優(yōu)點(diǎn)，尋找一種新的方法提高準(zhǔn)確性、選擇性和IL-6的檢測(cè)靈敏度，仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。因此在臨床研究上，發(fā)展一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏和低成本的IL-6的檢測(cè)方法有著巨大的需求及重要的意義。

電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器，利用抗原與抗體之間的特異性結(jié)合的一類生物傳感器，具有靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、易于小型化、可連續(xù)快速、自動(dòng)化檢測(cè)分析等優(yōu)點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明制備了一種基于TiO₂介晶納米材料的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器，并實(shí)現(xiàn)對(duì)白介素6的高靈敏檢測(cè)。銳鈦礦型TiO₂ 介籠材料（AMCs）和離子液體（CTIL），分別用于固定Ru(bpy)₃²⁺和IL-6抗體（Ab₁），作為信號(hào)探針和分子識(shí)別探針；八面體銳鈦礦型TiO₂介晶（OAMs）材料用于固定辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IL-6二抗（Ab₂）和酸性磷酸酶（ACP），其將通過典型的夾心型免疫反應(yīng)自組裝到電極表面，制得IL-6夾心型免疫傳感器。1-萘酚，傳感界面原位上催化水解1-萘磷酸（NPP）的產(chǎn)物，可被HRP及H₂O₂氧化，產(chǎn)生EC信號(hào)，EC信號(hào)與IL-6濃度在一定范圍內(nèi)顯示很寬的動(dòng)態(tài)線性范圍；另一方面，1-萘酚氧化產(chǎn)物可以猝滅Ru(bpy)₃²⁺的ECL，導(dǎo)致發(fā)光強(qiáng)度的下降，ECL強(qiáng)度與IL-6濃度在一定范圍內(nèi)顯示了一個(gè)寬的動(dòng)態(tài)線性范圍?；赥iO₂介晶納米材料優(yōu)異的生物相容性及離子液體的良好的電子傳導(dǎo)性，所制得的免疫傳感器具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好、檢測(cè)限低等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一是TiO₂介晶納米材料，構(gòu)建一種穩(wěn)定性好，靈敏度高的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器的制備。

本發(fā)明的目的之二是將該雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器應(yīng)用于白介素6的高靈敏檢測(cè)。

為實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1.一種基于TiO₂介晶納米材料的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器的制備方法：

（1） 玻碳電極（GCE）首先在鋪有氧化鋁粉末的麂皮上機(jī)械打磨拋光，用二次水洗去表面殘留粉末，再移入超聲水浴中清洗，直至清洗干凈，最后依序用乙醇，稀酸和水徹底洗滌；

（2） 滴加4μL銳鈦礦型TiO₂ 介籠（AMCs）/Ru(bpy)₃²⁺溶液于干凈的玻碳電極表面， 60°C下干燥20min，制得AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE電極；

（3） 滴加4μL 羧基化離子液體（CTIL）溶液于AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE修飾電極表面， 60°C下干燥20min，制得CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE電極；

（4） 將CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE修飾電極浸入濃度比為1:2的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDC）及N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）混合液中50min，再浸入5 μL濃度為2 mg/mL白介素6抗體（Ab₁)溶液中并在4°C冰箱中孵育45min，用去離子水洗去物理吸附的Ab₁，制得Ab₁/CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE電極；

（5） 將Ab₁/CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE修飾電極浸入0.5 wt.%的BSA溶液中并在4°C冰箱中孵育1 h，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，用去離子水沖洗電極表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中；

（6） 將步驟（5）得到的電極浸入不同濃度的白介素6（IL-6）標(biāo)準(zhǔn)溶液中并在4°C冰箱中孵育30 min，用pH7.5的 PBS緩沖溶液沖洗電極表面，制得IL-6/Ab₁/CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/ GCE電極；

（7） 將電IL-6/Ab₁/CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/ GCE極浸入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IL-6二抗（Ab₂）和酸性磷酸酶（ACP）及八面體銳鈦礦型TiO₂介晶（OAMs）（Ab₂-HRP/ACP/OAMs）復(fù)合物溶液并在4°C冰箱中孵育40 min，用pH7.5的 PBS緩沖溶液沖洗電極表面，制得Ab₂-HRP/ACP/OAMs/IL-6/Ab₁/CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE電極，并保存在4°C冰箱中。

2.上述銳鈦礦型TiO₂ 介籠（AMCs）/Ru(bpy)₃²⁺溶液由下述方法制備：500 μL 濃度為10mg/mL 的AMCs溶液 與 500 μL 濃度為 0.01mol/L的 Ru(bpy)₃²⁺ 溶液混合2 h，在10000 rpm轉(zhuǎn)速下離心 10 min，收集AMCs/Ru(bpy)₃²⁺沉淀物，在去離子水中重新分散以備使用。

3.上述銳鈦礦型TiO₂ 介籠（AMCs）材料由下述方法制備的：4.5g的十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解在150ml濃度為2 mol/L的鹽酸溶液中，攪拌5分鐘；加入4.5ml異丙醇（TIP）鈦（IV），在80°C下攪拌48 h，離心收集沉淀物并用蒸餾水徹底清洗；在60°C下烘干12 h，然后在空氣中400°C下煅燒30min，，以除去殘余的有機(jī)物，制得AMCs。

4.上述辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IL-6二抗（Ab₂）和酸性磷酸酶（ACP）及八面體銳鈦礦型TiO₂介晶（OAMs）（Ab₂-HRP/ACP/OAMs）復(fù)合物溶液由下述方法制備：1 mL OAMs 懸浮液 與40μL（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）試劑在室溫下攪拌12 h，離心收集氨基化的OAMs沉淀物并用蒸餾水徹底清洗去掉多余的APTES；將20ul濃度為10mg/ml HRP標(biāo)記的Ab₂溶液及濃度為1mg/ml ACP與10 μL 濃度為10 mM的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDC）及10 μL濃度為20 mM的 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）混合50 min，加入氨基功能化的 OAMs 溶液4℃放置12 h，在 10000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心 10 min 獲得Ab₂-HRP/ACP/OAMs復(fù)合物并分散在pH 7.4 PBS溶液中保存。

5.上述八面體銳鈦礦型TiO₂介晶（OAMs）材料由下述方法制備的：1.2克的銳鈦礦型TiO₂粉末溶解于60mL濃度為18mol/ml的 KOH溶液中，攪拌20分鐘后，將懸浮液移入一個(gè)100ml聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼高壓釜內(nèi)；密封反應(yīng)器， 170oC 下反應(yīng)72小時(shí)，冷卻到室溫；然后，用稀醋酸溶液洗滌沉淀至沉淀pH值為3.5，沉淀離心后在65oC下干燥12 小時(shí)得到產(chǎn)物鈦酸納米線.；取400mg前驅(qū)體鈦酸納米線分散在70ml稀醋酸中，于100聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜中200oC條件下反應(yīng) 48h，所得到的產(chǎn)物用蒸餾水和無水乙醇離心洗滌，60oC條件下烘干12 h并400oC下煅燒 30分鐘，以除去殘余的有機(jī)物，制得OAMs。

6.白介素6(IL-6)的檢測(cè)步驟如下：

（1）使用電化學(xué)工作站采用三電極體系進(jìn)行測(cè)定，以上述一種基于TiO₂介晶納米材料的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，在含有濃度為5×10^-3 mol/ml 1-萘磷酸（NPP） 和濃度為15×10^-3mol/ml H₂O₂的Ph7.5的 PBS緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試，采用差示脈沖伏安法（DPV），掃描電壓范圍為0.2V–0.6 V，掃描速率為100 mV/s，通過所得的氧化峰電流信號(hào)與IL-6標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制電化學(xué)工作曲線；

（2）使用電化學(xué)工作站采用三電極體系進(jìn)行測(cè)定，以上述一種基于TiO₂介晶納米材料的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，在含有濃度為5×10^-3 mol/ml 1-萘磷酸（NPP）和濃度為15×10^-3mol/ml H₂O₂的Ph7.5的 PBS緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試，采用循環(huán)伏安電壓，掃描電壓范圍為0V–1.3 V，掃描速率為100 mV/s，通過電致化學(xué)發(fā)光設(shè)備采集電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)，光電倍增管電壓為900V，通過所得的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與IL-6標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制電化學(xué)發(fā)光工作曲線；

（3）待測(cè)樣品溶液代替IL-6標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果通過工作曲線查得。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)為：

(1)所制備的銳鈦礦型TiO₂ 介籠材料（AMCs）和八面體銳鈦礦型TiO₂介晶（OAMs）具有大比表面積及良好的生物兼容性有利于發(fā)光試劑、酶和抗體本在電極表面的固定，可提高傳感器的靈敏度及穩(wěn)定性；

(2)通過酶催化反應(yīng)在傳感器界面原位生成電活性物質(zhì)，所制備的免疫傳感器具有較高的靈敏度；

(3)所制備的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器可產(chǎn)生電化學(xué)發(fā)光及電化學(xué)信號(hào)，具有較高的選擇性及靈敏度；

(4)本發(fā)明利用抗原、抗體的免疫反應(yīng)，提高了檢測(cè)方法的特異性。

附圖說明

圖1為一種基于TiO₂介晶納米材料的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器的制備過程示意圖。

圖2A為AMCs材料的電子發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）圖。

圖2B及圖2C為AMCs材料的透射電子顯微鏡（TEM）圖。

圖2C插圖為AMCs 納米片的高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）及選區(qū)電子衍射（SAED）圖。

圖2D為OAMs材料的電子發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）圖。

圖2E及圖2F為OAMs材料的透射電子顯微鏡（TEM）圖。

圖2F插圖為OAMs納米片的高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）及選區(qū)電子衍射（SAED）圖。

圖3為雙響應(yīng)夾心型免疫傳感電極的電化學(xué)信號(hào)及電化學(xué)發(fā)光響應(yīng)信號(hào)與白介素6標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的線性關(guān)系圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明用下列實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下列實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種基于TiO₂介晶納米材料的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器的制備（如圖1所示）：

（1） 玻碳電極（GCE）首先在鋪有氧化鋁粉末的麂皮上機(jī)械打磨拋光，用二次水洗去表面殘留粉末，再移入超聲水浴中清洗，直至清洗干凈，最后依序用乙醇，稀酸和水徹底洗滌；

（2） 滴加4μL銳鈦礦型TiO₂ 介籠（AMCs）/Ru(bpy)₃²⁺溶液于干凈的玻碳電極表面， 60°C下干燥20min，制得AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE電極；

（3） 滴加4μL 羧基化離子液體（CTIL）溶液于AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE修飾電極表面，60°C下干燥20min，制得CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE電極；

（4） 將CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE修飾電極浸入濃度比為1：2的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDC）及N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）混合液中50min，再浸入5 μL濃度為2 mg/mL白介素6抗體（Ab₁)溶液中并在4°C冰箱中孵育45min，用去離子水洗去物理吸附的Ab₁，制得Ab₁/CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE電極；

（5） 將Ab₁/CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE修飾電極浸入0.5 wt.%的BSA溶液中并在4°C冰箱中孵育1 h，以封閉電極表面上非特異性活性位點(diǎn)，用去離子水沖洗電極表面洗去物理吸附，并保存在4°C冰箱中；

（6） 將步驟（5）得到的電極浸入不同濃度的白細(xì)胞介素6（IL-6）標(biāo)準(zhǔn)溶液中并在4°C冰箱中孵育30 min，用pH7.5的 PBS緩沖溶液沖洗電極表面，制得IL-6/Ab₁/CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/ GCE電極；

（7） 將IL-6/Ab₁/CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/ GCE修飾電極浸入固定化辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IL-6二抗（Ab₂）和酸性磷酸酶（ACP）及八面體銳鈦礦型TiO₂介晶（OAMs）（Ab₂-HRP/ACP/OAMs）復(fù)合物溶液并在4°C冰箱中孵育40 min，用pH7.5的 PBS緩沖溶液沖洗電極表面，制得Ab₂-HRP/ACP/OAMs/IL-6/Ab₁/CTIL/AMCs/Ru(bpy)₃²⁺/GCE，并保存在4°C冰箱中。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IL-6二抗（Ab₂）和酸性磷酸酶（ACP）購于上海領(lǐng)潮生物科技有限公司。

實(shí)施例2

上述實(shí)施例1的羧基化離子液體（CTIL）的制備：

3.3g甲基咪唑與5.7g 氯乙酸在20ml的甲苯中回流24h, 重結(jié)晶純化得到羧基化離子液體。

實(shí)施例3

上述實(shí)施例1的銳鈦礦型TiO₂ 介籠（AMCs）/Ru(bpy)₃²⁺溶液的制備：

4.5g十二烷基硫酸鈉（SDS）溶解在150ml濃度為2 mol/L的鹽酸溶液中，攪拌5分鐘；加入4.5ml四異丙醇鈦（IV），在80°C下攪拌48 h，離心收集沉淀物并用蒸餾水徹底清洗；在60°C下烘干12 h，然后在空氣中400°C下煅燒30min，，以除去殘余的有機(jī)物，制得銳鈦礦型TiO₂介籠（AMCs）。AMCs的電子發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）圖、透射電子顯微鏡（TEM）圖、高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）及選區(qū)電子衍射（SAED）圖，如圖2A、圖2B、圖2C及圖2C插圖所示，表明AMCs的形成。

500 μL 濃度為10mg/mL 的AMCs溶液 與 500 μL 濃度為 0.01mol/L的 Ru(bpy)₃²⁺ 溶液混合2 h，在10000 rpm轉(zhuǎn)速下離心 10 min，收集AMCs/Ru(bpy)₃²⁺沉淀物，在去離子水中重新分散以備使用。

實(shí)施例4

上述實(shí)施例1的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的IL-6二抗（Ab₂）酸性磷酸酶（ACP）及八面體銳鈦礦型TiO₂介晶（OAMs）（Ab₂-HRP/ACP/OAMs）復(fù)合物溶液的制備：

1 mL OAMs 懸浮液 與40μL（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES）試劑在室溫下攪拌12 h，離心收集氨基化的OAMs沉淀物并用蒸餾水徹底清洗去掉多余的APTES；將20ul濃度為10mg/ml HRP標(biāo)記的Ab₂溶液及濃度為1mg/ml ACP與10 μL 濃度為10 mM的（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）（EDC）及10 μL濃度為20 mM的 N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）混合50 min, 加入氨基功能化的 OAMs 溶液4℃放置12 h，在 10000 rpm 轉(zhuǎn)速下離心 10 min 獲得Ab₂-HRP/ACP/OAMs復(fù)合物并分散在pH 7.4 PBS溶液中保存。

實(shí)施例5

上述實(shí)施例4的八面體銳鈦礦型TiO₂介晶（OAMs）材料的制備：

1.2克的銳鈦礦型TiO₂粉末溶解于60mL濃度為18mol/ml 的KOH溶液中，攪拌20分鐘后，將懸浮液移入一個(gè)100ml聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼高壓釜內(nèi)；密封反應(yīng)器， 170oC 下反應(yīng)72小時(shí)，冷卻到室溫；然后，用稀醋酸溶液洗滌沉淀至沉淀pH值為3.5，沉淀離心后在65oC下干燥12 小時(shí)得到產(chǎn)物鈦酸納米線.；取400mg前驅(qū)體鈦酸納米線分散在70ml稀醋酸中，于100聚四氟乙烯高壓反應(yīng)釜中200oC條件下反應(yīng) 48h，所得到的產(chǎn)物用蒸餾水和無水乙醇離心洗滌，60oC條件下烘干12 h并400oC下煅燒 30分鐘，以除去殘余的有機(jī)物，制得OAMs。其中銳鈦礦型TiO₂粉末購于青島德固賽化學(xué)有限公司。OAMs的電子發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）圖、透射電子顯微鏡（TEM）圖、高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）及選區(qū)電子衍射（SAED）圖，如圖2D、圖2E、圖2F及圖2F插圖所示，表明OAMs的形成。

實(shí)施例6

白介素6(IL-6)的檢測(cè)步驟：

（1）使用電化學(xué)工作站采用三電極體系進(jìn)行測(cè)定，以上述實(shí)施例制備的基于TiO₂介晶納米材料的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，在含有濃度為5×10^-3 mol/ml 1-萘磷酸（NPP） 和濃度為15×10^-3mol/ml H₂O₂的Ph7.5的 PBS緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試，采用差示脈沖伏安法（DPV），掃描電壓范圍為0.2V–0.6 V，掃描速率為100 mV/s，通過所得的氧化峰電流信號(hào)與IL-6標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制電化學(xué)工作曲線，如圖3所示；

（2）使用電化學(xué)工作站采用三電極體系進(jìn)行測(cè)定，以上述實(shí)施例制備的一種基于TiO₂介晶納米材料的雙響應(yīng)夾心型免疫傳感器為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，在含有濃度為5×10^-3 mol/ml 1-萘磷酸（NPP） 和濃度為15×10^-3mol/ml H₂O₂的Ph7.5的 PBS緩沖溶液中進(jìn)行測(cè)試，采用循環(huán)伏安電壓，掃描電壓范圍為0V–1.3 V，掃描速率為100 mV/s，通過電致化學(xué)發(fā)光設(shè)備采集電致化學(xué)發(fā)光信號(hào)，光電倍增管電壓為900V，通過所得的電致化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與IL-6標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度之間的關(guān)系，繪制電化學(xué)發(fā)光工作曲線，如圖3所示；

（3）待測(cè)樣品溶液代替IL-6標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的結(jié)果通過工作曲線查得。