本發(fā)明涉及體外診斷免疫檢測領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明提供了一種胰島細(xì)胞抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
胰島細(xì)胞抗體（isletcellantibody，ica）是一種對胰島細(xì)胞的胞漿成分起作用的特異性抗體，屬igg免疫球蛋白。血清中的ica可與β細(xì)胞起反應(yīng)而產(chǎn)生細(xì)胞毒作用。
胰島素依賴型糖尿?。╥nsμlin-dependentdiabetesmellitus，iddm）或稱ⅰ型糖尿病是一種漸進(jìn)的慢性損傷疾病，它能損害胰島素的產(chǎn)生與分泌，以及改變血糖代謝機(jī)制。胰島素是由胰島細(xì)胞或者langarhans細(xì)胞合成并分泌的一種激素。而在iddm患者中，其體內(nèi)的自身抗體會引起胰島細(xì)胞的免疫性損傷，從而破壞了胰島素的正常合成功能，此類正常的自身免疫性疾病可由遺傳以及有毒物質(zhì)接觸，病毒感染和各種精神壓力所引發(fā)。
ica是診斷胰島素依賴性糖尿病的高敏感性、高特異性指標(biāo)。正常人群抗ica抗體的陽性率僅為0.5%，在ⅰ型糖尿病新發(fā)患者中陽性率高達(dá)60～90%，高滴度的抗ica抗體預(yù)示疾病進(jìn)展的高危險(xiǎn)性。此外，血清檢測ica是iddm早期診斷的重要手段，同時(shí)也為糖尿病的正確治療，療效觀察及預(yù)后判斷提供有價(jià)值的指標(biāo)。μlμl臨床檢測胰島細(xì)胞抗體的常見方法有放射性免疫法、酶聯(lián)免疫吸附法，但這些方法都存在著一些不足之處。
一、放射性免疫法
該方法的基本原理是先用放射性的i125標(biāo)記重組胰島細(xì)胞抗原，血清中的特異性抗體先與抗原結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，加入二抗后孵育形成抗原-抗體-二抗復(fù)合物，離心后檢測放射性強(qiáng)弱從而判斷血清中特異性抗體的含量。該方法技術(shù)較成熟，但是其不足也很明顯：
（1）放射性對操作者身體有影響；
（2）操做相對較復(fù)雜，需要離心機(jī)和發(fā)射性檢測裝置，很多基層醫(yī)院難以推廣；
（3）本底高，特異性不好；
二、酶聯(lián)免疫吸附法
酶聯(lián)免疫吸附法(elisa)被廣泛應(yīng)用，但該方法也存在著下述的不足之處：
(1)使用12×8型、6×8型、8×12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨(dú)立的、單人份的檢測；
(2)定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時(shí)都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，加注試劑的操作也極為繁瑣；
(3)缺少對檢測信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；
(4)檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；
(5)檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯(cuò)，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
目前胰島細(xì)胞抗體檢測技術(shù)存在以下缺點(diǎn)：檢測成本高、檢測靈敏度低、重現(xiàn)性低、操作復(fù)雜等。
本發(fā)明正是為了克服以上所述缺點(diǎn)，公開了一種檢測成本低、靈敏度高、重現(xiàn)性高、操作簡單的胰島細(xì)胞抗體試劑盒及其制備方法。本發(fā)明首先制備化學(xué)發(fā)光免疫分析試劑盒，主要包括：胰島細(xì)胞抗原包被的磁微粒、吖啶酯標(biāo)記的抗人igg以及胰島細(xì)胞抗體定標(biāo)品；然后利用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀對定標(biāo)品進(jìn)行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，內(nèi)置于電腦軟件，測試實(shí)際樣本，根據(jù)樣本發(fā)光值計(jì)算樣本濃度；最后對胰島細(xì)胞抗體全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)進(jìn)行性能（靈敏度、線性、精密度、干擾性）的評價(jià)。
本發(fā)明與目前技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)：
1、本發(fā)明選擇吖啶酯作為標(biāo)記材料，并應(yīng)用于化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)，該發(fā)光體系為直接化學(xué)發(fā)光，與傳統(tǒng)的酶促化學(xué)發(fā)光相比，該反應(yīng)不需要酶的參與，更加節(jié)約成本；
2、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)檢測靈敏度高，能夠達(dá)到0.06u/ml，相比其它的胰島細(xì)胞抗體檢測方法靈敏度至少提高了15倍；
3、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)線性范圍寬，能達(dá)到5-300u/ml，其它的胰島細(xì)胞抗體化學(xué)發(fā)檢測方法的檢線性范圍為10-200u/ml；
4、本發(fā)明選用的吖啶酯化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)重復(fù)性高，批內(nèi)及批間差均在5%以內(nèi)，這是其它化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)難以達(dá)到的；
5、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)樣本的定量，通過內(nèi)置標(biāo)準(zhǔn)曲線到測試軟件，只需測試樣本就可直接得到樣本的濃度值；
6、本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)已實(shí)現(xiàn)全自動化，試劑及樣本的添加全有儀器完成，操作更加簡便，減少了人為的誤差。
附圖說明
圖1為實(shí)施例3得到的胰島細(xì)胞抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：胰島細(xì)胞抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒制備方法
（1）胰島細(xì)胞抗原包被的納米磁珠制備：
取50mg羧基化的磁微粒（粒徑為0.05-1um）懸浮液，磁分離去上清，用0.02m，ph為5.5mes緩沖液重懸，加入0.5-2ml新配置的10mg/ml的edc水溶液，活化磁珠表面羧基，加入3-5mg胰島細(xì)胞抗原，室溫下混懸2-10h，磁分離，去除上清，用含2%bsa的0.1mph為8.0的tris緩沖液重懸到1mg/ml，得到胰島細(xì)胞抗原的磁微粒，每瓶5ml分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（2）吖啶酯標(biāo)記的鼠抗人igg的制備：
取50μl25mg/ml的鼠抗人igg，加入150μl0.1-0.2mph9.0-9.5的碳酸鹽緩沖液，混勻，然后加入1-2μl5mg/ml的吖啶酯混勻，室溫下避光反應(yīng)，1-2h后取出，用2ml的zeba離心脫鹽柱脫鹽處理，脫鹽過程中首先分別用純凈水及tbs緩沖液進(jìn)行處理，最后加入得到的胰島細(xì)胞記的吖啶酯溶液，收集離心管中的液體至保存管得到胰島細(xì)胞標(biāo)記的吖啶酯，每瓶5ml分裝保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>
（3）胰島細(xì)胞抗體定標(biāo)品的制備：
用標(biāo)準(zhǔn)品緩沖液（40mmtris-hcl，0.5%bsa，1%nacl，ph8.0）將胰島細(xì)胞抗體配置成濃度為5u/ml、20u/ml、80u/ml、200u/ml、800u/ml、2000u/ml，每瓶0.5ml，分裝凍干，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(4)化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入80μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的雙氧水(h2o2)、1.0克疊氮化鈉、1.5克吐溫20，搖勻后避光存放。
(5)化學(xué)發(fā)光激發(fā)液的配制：
量取1.0升純化水，依次加入0.6克氫氧化鈉、0.5克pc300、0.5g疊氮化鈉、1.5克triton405，搖勻后避光存放。
實(shí)施例2：胰島細(xì)胞抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法：
本發(fā)明以全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀為檢測工具，本發(fā)明的方法學(xué)模式為間接法。先將血清/血漿樣本1：50倍稀釋，取稀釋后的樣本50μl，、50μl的胰島細(xì)胞包被的磁微粒微粒孵育10min后，進(jìn)行磁分離清洗，再加入100μl鼠抗人igg（20ng/ml），孵育10min，然后進(jìn)行磁分離清洗。儀器將磁分離后的反應(yīng)混合物送入暗室，依次加入50μl化學(xué)發(fā)光預(yù)激發(fā)液、50μl化學(xué)發(fā)光激發(fā)液進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)，最后記錄發(fā)光強(qiáng)度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測樣品的胰島細(xì)胞抗體含量。
實(shí)施例3：胰島細(xì)胞抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒性能評價(jià)
檢測曲線見附圖1。
分析靈敏度的檢測：
參照clsiep17-a文件推薦實(shí)驗(yàn)方案，計(jì)算胰島細(xì)胞抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的分析靈敏度，求得的分析靈敏度為0.06。
線性的檢測：
對濃度為5u/ml、20u/ml、40u/ml、80u/ml、150u/ml、300u/ml標(biāo)準(zhǔn)品做線性分析，計(jì)算線性相關(guān)系數(shù)，r=0.9786，另外，該試劑盒對胰島細(xì)胞抗體樣品檢測的線性范圍為5-300u/ml。
精密度測定：
取濃度20u/ml和150u/ml為兩個(gè)胰島細(xì)胞抗體樣品，每個(gè)樣本每個(gè)濃度各做3個(gè)平行，用三批試劑盒進(jìn)行檢測，計(jì)算試劑盒批內(nèi)及批間差，結(jié)果表明該試劑盒批內(nèi)及批間差均小于5%。
干擾性實(shí)驗(yàn)：
取混合血清分別添加干擾物包括：膽紅素、血紅蛋白、抗壞血酸、甘油酯，添加比例按照1:20進(jìn)行，分別測定混合血清及添加了各種干擾物后混合血清的測值，計(jì)算二者之間的偏差，以±10%為可接受范圍。結(jié)果表明，干擾性均達(dá)到nccls的文件標(biāo)準(zhǔn)，可用于臨床實(shí)驗(yàn)室胰島細(xì)胞抗體準(zhǔn)確評估。
實(shí)施例4:胰島細(xì)胞抗體化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒的分析靈敏度對比實(shí)驗(yàn)
分別用化學(xué)發(fā)光檢測方法和傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法對濃度為0iu/ml的樣本稀釋液進(jìn)行檢測，重復(fù)測定20次，得出20次測量結(jié)果的rlu值（相對發(fā)光值），計(jì)算其平均值（m）和標(biāo)準(zhǔn)差（sd），得出m+2sd，將該發(fā)光值代入校準(zhǔn)曲線計(jì)算得到相應(yīng)的濃度值。采用化學(xué)發(fā)光檢測方法得到的濃度值為0.06u/ml，相對于傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附法分析靈敏度0.91iu/ml，提高了約15倍。