本發(fā)明涉及的一種方法，尤其涉及一種建立膿腫分枝桿菌RUO數(shù)據(jù)庫和構(gòu)建亞型的超級圖譜的方法。

背景技術(shù)：

膿腫分枝桿菌感染近年來呈明顯的上升態(tài)勢。過去的十幾年中，盡管全球范圍內(nèi)結(jié)核病的防治已使其傳播和流行有所控制，但非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)感染的發(fā)病率卻迅速增長，尤其是免疫功能低下，以及內(nèi)鏡、手術(shù)、移植等侵入性操作增加，患者NTM感染率上升，成為臨床不可忽視的疾病。NTM分為快速生長型(rapidly growing mycobacteria，RGM)和緩慢生長型，其中RGM被認(rèn)為是更重要的人類致病菌。RGM感染中約65-80％是由膿腫分枝桿菌感染引起的。

美國的研究顯示超過80％的RGM是由膿腫分枝桿菌引起，臺灣地區(qū)、韓國NTM臨床分離菌株中膿腫分枝桿菌在RGM中居首。膿腫分枝桿菌感染主要包括肺部和皮膚軟組織感染。另外淋巴結(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)和骨關(guān)節(jié)感染也有報道。更為嚴(yán)重的是膿腫分枝桿菌可以導(dǎo)致手術(shù)后傷口的暴發(fā)感染，以及肺囊性纖維化患者的移植后播散性感染，2004年至2008年間，巴西政府報道了約2000名患者手術(shù)部位膿腫分枝桿菌感染，一度出現(xiàn)膿腫分枝桿菌暴發(fā)流行。

膿腫分枝桿菌不僅致病性和播散性極強，也是RGM中耐藥性最強的病原體，被稱為“抗生素的噩夢(antibiotic nightmare)”，它對大多數(shù)一線抗生素耐藥，對抗結(jié)核藥物天然耐藥，一度缺乏有效的治療手段。

新一代的大環(huán)內(nèi)酯類藥物克拉霉素是目前較為公認(rèn)的膿腫分枝桿菌感染治療的核心藥物，也是唯一證明口服有效的抗生素，2007年美國胸科醫(yī)師協(xié)會(American Thoracic Society，ATS)關(guān)于膿腫分枝桿菌感染的治療指南中，克拉霉素被推薦作為治療膿腫分枝桿菌感染聯(lián)合用藥的基礎(chǔ)，如克拉霉素聯(lián)合阿米卡星、頭孢西丁、利奈唑胺等。因此在膿腫分枝桿菌復(fù)合耐藥機制當(dāng)中，對大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的耐藥性尤其值得注意。

目前的研究表明，膿腫分枝桿菌對以克拉霉素為代表的大環(huán)內(nèi)酯類的獲得性耐藥往往與23SrRNA基因的突變有關(guān)，而其對克拉霉素的天然耐藥則主要與紅霉素甲基化酶(erythromycin methylase，erm)基因相關(guān)。因此目前認(rèn)為其相關(guān)基因表達決定了其藥物敏感性，而膿腫分枝桿菌復(fù)合群的抗生素耐藥與它的生物分類學(xué)密切相關(guān)。

膿腫分枝桿菌復(fù)合群可被分為3個亞型，分別為：膿腫分枝桿菌馬賽亞種，膿腫分枝桿菌bolletii亞種，和膿腫分枝桿菌膿腫亞種。在基因方面，3個亞種間最值得關(guān)注的區(qū)別在于，膿腫亞種和bolletii亞種具有完整的erm基因，而馬賽亞種所具有的erm基因在兩個位置發(fā)生了276bps的缺失突變，使它的erm基因相較另2個亞種是不完整的。在藥物敏感性方面，3個亞種都會因為23S rRNA基因A2085位置的突變而產(chǎn)生獲得性克拉霉素耐藥，這一突變在馬賽亞種中更為常見。然而，馬賽亞種由于其具有的不完整而無法被激活的erm基因，不會在應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類抗生素后產(chǎn)生誘導(dǎo)性耐藥，而膿腫亞種則會在暴露于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素一段時間后發(fā)生誘導(dǎo)性耐藥。因此，對于不同的亞種所導(dǎo)致的肺部疾病，應(yīng)用以大環(huán)內(nèi)酯類抗生素為基礎(chǔ)的治療方案會取得截然不同的治療效果。由此可知，在膿腫分枝桿菌的治療策略的制定中，深入到亞種層面的菌種鑒定和體外藥敏實驗同樣非常重要。

但是，目前為止，將膿腫分枝桿菌復(fù)合群鑒定到亞種層面依舊是個頗具爭論性的議題。雖然現(xiàn)在使用PCR方法對erm基因進行擴增，已經(jīng)可以將馬賽亞種與膿腫亞種和bolletii亞種區(qū)分開來，但仍然需要應(yīng)用各種分子學(xué)方法對幾個管家基因，如rpoB基因、hsp65基因等進行序列分析。

這些以基因分析為基礎(chǔ)的分子學(xué)分型方法，都比較昂貴且需要較長的時間得出結(jié)果，所以在一般的微生物實驗室中顯得不是非常實用且難以普及。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題，提供一種建立膿腫分枝桿菌RUO(研究用)數(shù)據(jù)庫和構(gòu)建亞型的超級圖譜的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：建立膿腫分枝桿菌RUO數(shù)據(jù)庫和構(gòu)建亞型的超級圖譜的方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟1：膿腫分枝桿菌菌株收集和DNA抽提

1-1、膿腫分枝桿菌菌株的收集

收集膿腫分枝桿菌菌株300株，菌株由痰標(biāo)本和肺泡灌洗液中分離并收集；

從患者處獲得的檢測樣本在經(jīng)過NaOH簡化處理后，被接種到斜面羅氏培養(yǎng)基上，生長出的菌落在顯微鏡下確認(rèn)為抗酸桿菌；

接下來，篩選出的陽性菌落轉(zhuǎn)接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，并在37℃條件下培養(yǎng)3至7天；

1-2、DNA抽提

將10微升生長在羅氏培養(yǎng)基上的菌環(huán)轉(zhuǎn)移到含有1毫升TE【即10毫摩爾的三(羥甲基)氨基甲烷與1毫摩爾的乙二胺四乙酸組成的混合液】和玻璃念珠的離心管中；將離心管置于漩渦振蕩機上振蕩10分鐘使細(xì)菌充分懸?。晃?00微升的細(xì)菌懸液至新的離心管中，加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，在溫度為37℃的環(huán)境下過夜；

加入70微升十二烷基硫酸鈉和10微升蛋白分解酶，在溫度為65℃的環(huán)境下孵育20分鐘，加入100微升十六烷基三甲基溴化銨和氯化鈉的混合物，然后迅速加入100μ微升氯化鈉；

吹打懸液至牛奶狀，然后在溫度為65℃的環(huán)境下孵育10分鐘；加入750微升氯仿-異戊醇(24:1)的混合液，漩渦振蕩，室溫13000轉(zhuǎn)離心5分鐘；

吸取上清至新的離心管中，加入0.6倍體積的異戊醇，在-20℃孵育20分鐘，然后13000轉(zhuǎn)離心15分鐘；棄上清，用乙醇洗滌，13000轉(zhuǎn)離心5分鐘；

用200微升TE溶解沉淀，使用微量分光光度計對DNA進行定量，OD260/280值在1.8～2.0區(qū)間，濃度>6ug的DNA用來擴增使用；

步驟2：基因文庫制備和illumina HiSeq(illumina是公司名字，HiSeq是高通量測序的簡寫，代表測序平臺，這兩個在一起就代表這個公司的測序平臺)測序

至少3μg DNA用來Illumina雙末端測序的文庫制備，據(jù)Illumina標(biāo)準(zhǔn)的基因DNA文庫制備流程，400bp長度的DNA片段用來雙末端測序；

利用樣品處理系統(tǒng)將DNA剪切成需要的DNA小片段；然后對DNA片段的3’末端添加一個“A”，兩端加接頭；DNA片段可以通過凝膠電泳提純，并且通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴增以達到上樣量；最后，對定量的Illumina雙末端文庫進行Illumina Hiseq測序；

步驟3：基因組建立與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

計算實驗菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的基因差異；菌種的系統(tǒng)生成樹則應(yīng)用非加權(quán)組平均法構(gòu)建而成；通用標(biāo)準(zhǔn)株序列ATCC19977、CIP18297和CIP108541作為膿腫分枝桿菌亞型的參照序列，而H37Rv則作為其他菌種的參照序列；

步驟4：樣本準(zhǔn)備和對菌株的檢測

吸取1微升含分枝桿菌的羅氏培養(yǎng)基至含有800微升乙醇和250微升玻璃念珠的微量離心管中；

將混懸液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，13000轉(zhuǎn)離心5分鐘；移除上清，干燥10分鐘，用10微升甲酸溶解沉淀，室溫孵育2到5分鐘；加入10微升乙腈，10000轉(zhuǎn)離心3分鐘；吸取1微升上清液至目標(biāo)板上，充分干燥，并用1微升CHCA(α-氰基-4-羥基肉桂酸)基質(zhì)液覆蓋；

每一塊樣本板在進行檢測之前，都提前使用大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株進行儀器參數(shù)校準(zhǔn)和器械調(diào)整；在收集到質(zhì)譜圖信號后，數(shù)據(jù)即由收集站傳輸至分析系統(tǒng)，數(shù)據(jù)由此以峰值信號的形式展現(xiàn)出來；收集到的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)與RUO數(shù)據(jù)庫進行比對后，生成菌種的鑒定結(jié)果；

在收集到的臨床菌株質(zhì)譜數(shù)據(jù)中，經(jīng)過挑選的40株膿腫亞種和20株馬賽亞種的圖譜數(shù)據(jù)分別按照亞種分組并輸入RUO數(shù)據(jù)庫中；在數(shù)據(jù)庫原有的微生物分類樹中的膿腫分枝桿菌下新建了2個亞種的文件夾，并分別將導(dǎo)入的質(zhì)譜數(shù)據(jù)加入新建的文件夾中；

隨后，分別在2個亞種間，挑選出40個100％出現(xiàn)在亞種圖譜數(shù)據(jù)之內(nèi)的峰值信號， 以此為基礎(chǔ)創(chuàng)建了2個亞種的超級圖譜，所有新導(dǎo)入的圖譜數(shù)據(jù)和新構(gòu)建的超級圖譜都被激活以用于隨后的鑒定工作；

步驟5：準(zhǔn)確性的確認(rèn)

更新后的數(shù)據(jù)庫，包括了新導(dǎo)入的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)組和2個新創(chuàng)建的超級圖譜，準(zhǔn)確性的評估由余下的240株臨床菌株的盲測完成；此300株臨床菌株樣本，包括已導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫的60株和240株盲測菌株，都通過WGS(全基因組測序)鑒定到亞種層面。

本發(fā)明通過分析明確膿腫分枝桿菌亞種；通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測亞種信息，建立RUO數(shù)據(jù)庫和構(gòu)建出的超級圖譜，并通過菌株盲測檢驗其敏感性和特異性，制定用于亞種層面實驗室鑒定的操作流程及診斷標(biāo)準(zhǔn)，并加入微生物標(biāo)準(zhǔn)體外診斷流程的工作鏈，提高了各微生物實驗室對膿腫分枝桿菌亞型鑒定的效率。

具體實施方式

為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、技術(shù)特征、發(fā)明目的與技術(shù)效果易于明白了解，下面進一步闡述本發(fā)明。

建立膿腫分枝桿菌RUO數(shù)據(jù)庫和構(gòu)建亞型的超級圖譜的方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟1：菌株收集和DNA抽提

1.1菌株收集

收集膿腫分枝桿菌菌株300株，菌株由痰標(biāo)本和肺泡灌洗液中分離并收集。

收集的臨床菌株均以MGIT960培養(yǎng)基和對硝基甲苯酸(PNB)試驗篩選為非結(jié)核分枝桿菌，所有樣本均通過rpoB基因測序分析進一步堅定為膿腫分枝桿菌復(fù)合群。

從患者處獲得的檢測樣本在經(jīng)過4％NaOH簡化處理后，被接種到斜面羅氏培養(yǎng)基(L-J medium)上，生長出的菌落在顯微鏡下確認(rèn)為抗酸桿菌。

接下來，篩選出的陽性菌落轉(zhuǎn)接種于改良羅氏培養(yǎng)基上，并在37℃條件下培養(yǎng)3至7天，用于隨后的DNA抽提分析和MALDI-TOF MS鑒定檢測。

1.2DNA抽提

將10微升生長在羅氏培養(yǎng)基(L-J培養(yǎng)基)上的菌環(huán)轉(zhuǎn)移到含有1毫升TE(10mMTris10,1mMEDTA[pH 8.0])和250微升0.5mm玻璃念珠的離心管中。

將離心管置于漩渦振蕩機上振蕩10分鐘使細(xì)菌充分懸浮。

吸取400微升的細(xì)菌懸液至新的離心管中，加入溶菌酶至終濃度1mg/ml，37°過夜。

加入70微升10％十二烷基硫酸鈉和10微升蛋白分解酶K(10mg/ml)，65°孵育20分鐘。加入100微升,十六烷基三甲基溴化銨(10％CTAB)和氯化鈉(0.7M)的混合物，然后迅速加入100μ微升氯化鈉(0.5M)。

吹打懸液至牛奶狀，然后65°孵育10分鐘。加入750微升氯仿-異戊醇(24:1)的混合液，漩渦振蕩，室溫13000轉(zhuǎn)離心5分鐘。

吸取上清至新的離心管中，加入0.6倍體積的異戊醇。-20°孵育20分鐘，然后13000轉(zhuǎn)離心15分鐘。棄上清，用70％乙醇洗滌，13000轉(zhuǎn)離心5分鐘。

用200微升TE(10mMTris 10,1mMEDTA[pH 8.0])溶解沉淀。使用微量分光光度計(NanoDrop？2000/2000c Spectrophotometers(Thermo Fisher Scientific.,Delaware,USA))對DNA進行定量。OD260/280值在1.8～2.0區(qū)間，濃度>6ug的DNA用來擴增(350to450bp)使用。

步驟2：基因文庫制備和illumina HiSeq測序

至少3μgDNA用來Illumina雙末端測序的文庫制備。根據(jù)Illumina標(biāo)準(zhǔn)的基因DNA文庫制備流程，400bp長度的DNA片段用來雙末端測序。

利用高性能樣品處理系統(tǒng)將DNA剪切成需要的DNA小片段，用T4DNA聚合酶 將DNA鏈突出末端平滑化。然后對平滑化的DNA片段的3’末端添加一個“A”，兩端加接頭。DNA片段可以通過凝膠電泳提純，并且通過PCR擴增以達到上樣量。最后，對定量的Illumina雙末端文庫進行Illumina Hiseq測序(150*2)。

步驟3：基因組建立與系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用相關(guān)軟件計算實驗菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株之間的基因差異。菌種的系統(tǒng)生成樹則應(yīng)用非加權(quán)組平均法(UPGMA)構(gòu)建而成。通用標(biāo)準(zhǔn)株序列ATCC19977、CIP18297和CIP108541作為膿腫分枝桿菌亞型的參照序列，而H37Rv則作為其他菌種的參照序列。

步驟4：基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)

4.1樣本準(zhǔn)備

首先制備樣本，吸取1微升含分枝桿菌的羅氏培養(yǎng)基(L-J培養(yǎng)基)至含有800微升70％乙醇和250微升玻璃念珠的微量離心管中。漩渦振蕩15分鐘，然后室溫孵育10分鐘，漩渦振蕩10s。將混懸液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，13000轉(zhuǎn)離心5分鐘。移除上清，干燥10分鐘，用10微升70％甲酸溶解沉淀，室溫孵育2到5分鐘。加入10微升乙腈，10000轉(zhuǎn)離心3分鐘。吸取1微升上清液至目標(biāo)板上，充分干燥，并用1微升CHCA基質(zhì)液覆蓋。

4.2采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)對菌株的檢測對菌株的檢測

使用Vitek MS Plus system(bioMérieux SA,Marcy l’Etoile,France)系統(tǒng)進行檢測。Vitek MS系統(tǒng)應(yīng)用50Hz線性正離子模式的激光收集2000至20000m/z的圖譜數(shù)據(jù)。每一塊樣本板在進行檢測之前，都提前使用大腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)株ACTT8739進行儀器參數(shù)校準(zhǔn)和器械調(diào)整。在收集到質(zhì)譜圖信號后，數(shù)據(jù)即由Vitek MS收集站傳輸至SARAMIS分析系統(tǒng)，數(shù)據(jù)由此以峰值信號的形式展現(xiàn)出來。收集到的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)與SARAMIS 4.12research use only(RUO)數(shù)據(jù)庫進行比對后，生成菌種的鑒定結(jié)果。

4.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫的更新

質(zhì)譜圖的分析應(yīng)用research-use-only(RUO)Saramis Knowledge Base(bioMérieuxSA) database V.4.12數(shù)據(jù)庫完成。在收集到的臨床菌株質(zhì)譜數(shù)據(jù)中，經(jīng)過挑選的40株膿腫亞種和20株馬賽亞種的圖譜數(shù)據(jù)分別按照亞種分組并輸入RUO數(shù)據(jù)庫中。我們在數(shù)據(jù)庫原有的微生物分類樹中的膿腫分枝桿菌下新建了2個亞種的文件夾，并分別將導(dǎo)入的質(zhì)譜數(shù)據(jù)加入新建的文件夾中。隨后，我們分別在2個亞種間，挑選出40個100％出現(xiàn)在亞種圖譜數(shù)據(jù)之內(nèi)的峰值信號，以此為基礎(chǔ)創(chuàng)建了2個亞種的超級圖譜(Superspectrum)。所有新導(dǎo)入的圖譜數(shù)據(jù)和新構(gòu)建的超級圖譜都被激活以用于隨后的鑒定工作。

步驟5：準(zhǔn)確性確認(rèn)

更新后的數(shù)據(jù)庫，包括了新導(dǎo)入的質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)組和2個新創(chuàng)建的超級圖譜，準(zhǔn)確性的評估由余下的240株臨床菌株的盲測完成。此300株臨床菌株樣本，包括已導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫的60株和240株盲測菌株，都通過WGS鑒定到亞種層面。

本發(fā)明通過分析明確膿腫分枝桿菌亞種；通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測亞種信息，建立RUO數(shù)據(jù)庫和構(gòu)建出的超級圖譜，并通過菌株盲測檢驗其敏感性和特異性，制定用于亞種層面實驗室鑒定的操作流程及診斷標(biāo)準(zhǔn)，并加入微生物標(biāo)準(zhǔn)體外診斷流程的工作鏈，提高了各微生物實驗室對膿腫分枝桿菌亞型鑒定的效率。

綜上所述僅為本發(fā)明較佳的實施例，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化及修飾，皆應(yīng)屬于本發(fā)明的技術(shù)范疇。