本發(fā)明屬于生化分析與生物傳感技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種二維液相比色免儀器定量分析方法。

背景技術(shù)：

液相比色分析法具有操作簡(jiǎn)單、成本經(jīng)濟(jì)、可實(shí)現(xiàn)目視定性或半定量檢測(cè)等突出優(yōu)點(diǎn)，長(zhǎng)期以來(lái)備受分析工作者的青睞。目前絕大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道的液相比色分析法通常使用有機(jī)染料、酶底物、貴金屬納米顆粒等作為比色探針，將目標(biāo)物的濃度轉(zhuǎn)換成均相反應(yīng)溶液的顏色強(qiáng)度進(jìn)行分析。由于顏色強(qiáng)度僅是最終反應(yīng)溶液的一維信息，現(xiàn)有的絕大多數(shù)液相比色分析方法可統(tǒng)稱(chēng)為一維液相比色分析法。盡管一維液相比色分析法具有前述諸多優(yōu)點(diǎn)，它們的美中不足之處主要在于必須借助紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)等光學(xué)儀器才能進(jìn)行分析物的定量檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中絕大多數(shù)液相比色分析方法的不足，提供一種二維液相比色免儀器定量分析方法。

本發(fā)明的思路：利用糖化酶可催化水解水溶性較低的淀粉分子生成葡萄糖等水溶性良好的產(chǎn)物，結(jié)合具有優(yōu)異水溶性或水中分散性的彩色檢測(cè)試劑在不同水溶性的反應(yīng)溶液中可擴(kuò)散不同距離的簡(jiǎn)單機(jī)制，提出一種二維液相比色免儀器定量分析新方法?！岸S”是指在利用該彩色檢測(cè)試劑在反應(yīng)溶液里的顏色強(qiáng)度作為“第一維”定性信息的同時(shí)，引入其在反應(yīng)溶液中擴(kuò)散的彩色長(zhǎng)度作為“第二維”定量信息。換言之，與現(xiàn)有的絕大多數(shù)液相比色分析方法中最后得到顏色均一的反應(yīng)溶液不同的是，新方法最后得到的是雙色反應(yīng)溶液——溶液的上部和下部分別呈現(xiàn)彩色和無(wú)色。反應(yīng)溶液中彩色部分的長(zhǎng)度隨著糖化酶濃度的增高而增大。因此，僅憑肉眼觀察，通過(guò)使用價(jià)格極低的直尺代替紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)等光學(xué)儀器簡(jiǎn)單量測(cè)反應(yīng)溶液中彩色溶液的擴(kuò)散長(zhǎng)度，或直接讀取所使用的透明容器自身與該彩色擴(kuò)散長(zhǎng)度相關(guān)的刻度，即可實(shí)現(xiàn)糖化酶分析物或與糖化酶濃度相關(guān)的目標(biāo)分析物（即以糖化酶為酶標(biāo)記探針）的定量檢測(cè)，從而顯著降低分析成本。

具體步驟為：

步驟一，在透明容器中將淀粉溶液與含有糖化酶的溶液充分混合，進(jìn)行糖化酶催化水解淀粉的反應(yīng)，制得具有良好水溶性的二級(jí)產(chǎn)物反應(yīng)溶液。

步驟二，在步驟一制得的反應(yīng)溶液的液面位置加入彩色檢測(cè)試劑溶液，量測(cè)反應(yīng)溶液中彩色檢測(cè)試劑溶液的擴(kuò)散長(zhǎng)度，該擴(kuò)散長(zhǎng)度與溶液中糖化酶的濃度呈正相關(guān)，即完成目標(biāo)分析物的二維液相比色免儀器定量分析。

所述透明容器為玻璃材質(zhì)和塑料材質(zhì)中的一種，且透明容器本身沒(méi)有刻度或本身自帶刻度，當(dāng)透明容器本身沒(méi)有刻度時(shí)，使用直尺在透明容器外壁量測(cè)反應(yīng)溶液中彩色檢測(cè)試劑溶液的擴(kuò)散長(zhǎng)度，當(dāng)透明容器本身自帶刻度時(shí)，直接讀取透明容器自身刻度量測(cè)反應(yīng)溶液中彩色檢測(cè)試劑溶液的擴(kuò)散長(zhǎng)度。

所述淀粉為低水溶性的直鏈淀粉和支鏈淀粉中的一種。

所述目標(biāo)分析物為糖化酶自身或者與糖化酶濃度相關(guān)的物質(zhì)即以糖化酶為酶標(biāo)記探針。

所述彩色檢測(cè)試劑為具有良好水溶性的彩色墨水、染料、色素及具有良好水中分散性的彩色納米材料和微米材料中的一種。

與現(xiàn)有的絕大多數(shù)液相比色分析方法相比，本發(fā)明的突出優(yōu)點(diǎn)在于：1）檢測(cè)過(guò)程極為簡(jiǎn)單，未經(jīng)專(zhuān)業(yè)技能培訓(xùn)的操作人員也能開(kāi)展實(shí)驗(yàn)；2）僅憑肉眼觀察或簡(jiǎn)單使用價(jià)格低廉的直尺代替紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)等光學(xué)儀器進(jìn)行定量信號(hào)讀取，顯著降低了分析成本；3）可直接推廣應(yīng)用于臨床診斷、醫(yī)學(xué)研究、食品安全、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域中各種樣本中糖化酶分析物或使用糖化酶為酶標(biāo)記探針的目標(biāo)物的簡(jiǎn)單低成本二維液相比色免儀器定量檢測(cè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1和實(shí)施例2中二維液相比色免儀器定量分析方法的原理示意圖。圖中標(biāo)記：1-1—無(wú)色緩沖溶液；1-2—糖化酶；2—外壁有刻度的透明塑料檢測(cè)容器（微量注射器）；2-1—檢測(cè)容器外壁刻度；2-2—檢測(cè)容器內(nèi)部活塞；3-1—超純水；3-2—直鏈淀粉；4—糖化酶催化水解淀粉的產(chǎn)物（葡萄糖）；5—彩色檢測(cè)試劑（紅墨水）；6—主要含甲酰胺的下層溶液；7—主要含彩色檢測(cè)試劑（紅墨水）的上層溶液；8—肉眼。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中使用二維液相比色免儀器定量分析方法分別檢測(cè)0.64 U/mL糖化酶樣本溶液和空白樣（不含分析物的緩沖溶液）所得的與紅墨水流動(dòng)長(zhǎng)度相關(guān)的刻度值的比較。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2中使用二維液相比色免儀器定量分析方法檢測(cè)一系列不同活性濃度的糖化酶樣本溶液所得的與紅墨水流動(dòng)長(zhǎng)度相關(guān)的刻度值與糖化酶活性濃度的Log值（LogC_糖化酶）之間的工作曲線(xiàn)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明予以進(jìn)一步的說(shuō)明，但并不因此而限制本發(fā)明。

實(shí)施例1:

使用二維液相比色免儀器定量分析方法分別檢測(cè)0.64 U/mL糖化酶樣本溶液和空白樣（不含分析物的緩沖溶液）。

如圖1所示，本實(shí)施例的具體步驟為：步驟一，在50 μL透明塑料微量注射器中依次吸入15 μL糖化酶溶液（由20 mM的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制，pH 6.0）和15 μL直鏈淀粉溶液（由電阻率為18.2 MΩ·cm的超純水加熱配制，冷卻到室溫后使用），充分混合后置于37℃下反應(yīng)40 min，制得反應(yīng)溶液；步驟二，在上述反應(yīng)溶液的液面位置繼續(xù)抽吸加入3 μL紅墨水溶液（將墨水原液用電阻率為18.2 MΩ·cm的超純水稀釋20倍后制得），紅墨水溶液在反應(yīng)溶液中流動(dòng)5 min后，肉眼直接讀取注射器外壁表面與溶液中紅色流動(dòng)長(zhǎng)度相關(guān)的刻度值，即完成目標(biāo)分析物的二維液相比色免儀器定量分析。

根據(jù)相同的步驟，分析空白樣，即20 mM的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液（pH 6.0），并使用肉眼直接讀取注射器外壁表面與溶液中紅色流動(dòng)長(zhǎng)度相關(guān)的刻度值。從圖2可以看出，與檢測(cè)空白樣所得的刻度值相比，檢測(cè)0.64 U/mL糖化酶樣本溶液所得的刻度值有了顯著增長(zhǎng)。這是因?yàn)樘腔阜治鑫锟梢愿咝实卮呋獾退苄缘矸鄯肿由删哂辛己盟苄缘钠咸烟钱a(chǎn)物，整個(gè)反應(yīng)溶液的疏水性因此降低，導(dǎo)致水溶性紅墨水溶液在設(shè)定的時(shí)間內(nèi)可以流動(dòng)較長(zhǎng)的距離。圖2中的對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，基于二維液相比色法的糖化酶活性免儀器定量檢測(cè)切實(shí)可行。

實(shí)施例2:

使用二維液相比色免儀器定量分析方法檢測(cè)活性濃度范圍為0.01~0.64 U/mL的糖化酶樣本溶液。

如圖1所示，本實(shí)施例中分析每個(gè)糖化酶樣本溶液的具體步驟為：在50 μL透明塑料微量注射器中依次吸入15 μL糖化酶溶液（由20 mM的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液配制，pH 6.0）和15 μL直鏈淀粉溶液（由電阻率為18.2 MΩ·cm的超純水加熱配制，冷卻到室溫后使用），充分混合后置于37℃下反應(yīng)40 min，制得反應(yīng)溶液；步驟二，在上述反應(yīng)溶液的液面位置繼續(xù)抽吸加入3 μL紅墨水溶液（將墨水原液用電阻率為18.2 MΩ·cm的超純水稀釋20倍后制得），紅墨水溶液在反應(yīng)溶液中流動(dòng)5 min后，肉眼直接讀取注射器外壁表面與溶液中紅色流動(dòng)長(zhǎng)度相關(guān)的刻度值。最后并將從所有樣本得到的刻度值對(duì)糖化酶活性濃度的Log值（LogC_糖化酶）作圖（圖3），即完成糖化酶活性的二維液相比色法定量檢測(cè)。

由圖3可知，隨著糖化酶活性濃度的增加，相應(yīng)的刻度值逐漸增大。這是因?yàn)?，?dāng)樣本中糖化酶活性濃度較大時(shí)，被水解的低水溶性的直鏈淀粉也會(huì)越多。此時(shí)，水溶性良好的葡萄糖產(chǎn)物的數(shù)量也越多，使得紅墨水檢測(cè)試劑溶液在其中的流動(dòng)長(zhǎng)度（刻度值）也更大。此外，圖3顯示，利用本發(fā)明量測(cè)所得的刻度值與糖化酶活性濃度的Log值在0.01~0.64 U/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系。