本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)工程領(lǐng)域，更具體涉及一種采用蛋白質(zhì)條帶比對(duì)進(jìn)行栝樓籽品種鑒定的方法，適用于栝樓籽品種鑒定。

背景技術(shù)：

栝樓籽又名栝樓仁，為葫蘆科植物栝樓(trichosantheskirilowiimaxim.)或雙邊栝樓(trichosanthesrosthorniiharms)的干燥成熟種籽。秋季采摘成熟果實(shí)，剖開，取出種籽，洗凈，曬干。

栝樓籽具潤肺化痰，滑腸通便之功效，用于燥咳痰粘，腸燥便秘?，F(xiàn)在藥理研究表明，它具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，增加冠脈流量，保護(hù)缺血心肌，抗炎，抗腫瘤和瀉下、抗血栓與動(dòng)脈硬化、調(diào)節(jié)血糖等功效，具有較強(qiáng)的抗血小板凝集作用。栝樓籽的主要有效成分包括油脂和有機(jī)酸類、甾醇類和萜類、氨基酸和蛋白質(zhì)以及微量元素和礦物質(zhì)，可見栝樓籽具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。近年休閑食品栝樓籽在大中城市得到普通認(rèn)可，可作為常用大宗中藥材和可口的炒食，每公斤售價(jià)達(dá)到60－80元，位于瀏陽生物醫(yī)藥園的食品企業(yè)鹽津鋪?zhàn)鸭庸よ闃亲?，且銷路很好，是天然的綠色休閑保健食品，產(chǎn)品在市場供不應(yīng)求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供了一種采用蛋白質(zhì)比對(duì)鑒定栝樓籽的方法，通過采用蛋白質(zhì)條帶比對(duì)，操作簡便，省時(shí)省力的鑒定，該方法易行，操作簡便，節(jié)省檢測時(shí)間。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種采用蛋白質(zhì)比對(duì)鑒定栝樓籽的方法，其步驟是：

a、栝樓籽蛋白質(zhì)提?。悍Q取0.5g栝樓籽樣本(去種皮)，倒入預(yù)冷研缽，在液氮中研磨成粉末(至少一百目，附：液氮研磨的鮮樣是無法過篩的)，以研磨到奶粉狀為宜。

b、將粉末轉(zhuǎn)入到離心管中，加入2－4倍體積蛋白提取液，所述的蛋白質(zhì)提取液為500mmtris，50mmedta,700mm蔗糖，100mmkcl,ph8.0，振蕩28－32min，混勻。

c、加入等體積的tris-飽和酚，冰浴，振蕩28－32min，使之充分混勻。

d、樣品(樣品就是包括栝樓籽粉末以及蛋白質(zhì)提取液，以及tris-飽和酚溶液的離心管)放入低溫離心機(jī)(eppendorfcentrifuge5424r)4℃，12000rpm離心28－32min，取酚相(上層液)。余下的沉淀和液體再加入tris-飽和酚，重復(fù)本步驟1－2次，酚相收集到同一離心管中。

e、向酚相中加入2－4倍體積的0.1m乙酸銨甲醇溶液，充分混勻，立即可見白色絮狀沉淀，并在-20℃沉淀過夜后樣品放入低溫離心機(jī)(eppendorfcentrifuge5424r)4℃，12000rpm離心28－32min，棄上清。沉淀用0.1m乙酸銨甲醇溶液洗滌4℃，12000rpm離心14－16min，棄上清，重復(fù)本步驟1－2次。沉淀用預(yù)冷丙酮洗滌4℃，12000rpm離心14－16min，棄上清，重復(fù)本步驟1－2次，將樣品離心管敞口，室溫(20－25℃，以下相同)下放置約28－32min，使丙酮揮發(fā)。最終得到的沉淀冷凍干燥后置-80℃下保存?zhèn)溆茫@得蛋白質(zhì)干粉。

f、栝樓籽蛋白質(zhì)電泳：將得到的樣本蛋白質(zhì)干粉，加入等量的裂解液(8m尿素，2m硫脲，4％chaps，65mmdtt，2％bio-lyte)進(jìn)行裂解后，采用bradford法(bradfordmm.arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding[j].analyticalbiochemistry,1976,72(1-2):248-254.)測定每個(gè)樣本的蛋白質(zhì)含量，按照等量的蛋白量在預(yù)制好的蛋白質(zhì)電泳膠上上樣，80v電泳至電泳條帶進(jìn)入分離膠，120v至顯色液跑出分離膠。并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，并脫色，采集圖像，通過比較分析蛋白膠圖像進(jìn)行栝樓籽鑒定。

g、栝樓籽鑒定：通過對(duì)比栝樓籽的特有蛋白質(zhì)帶：45kd－66kd之間的蛋白條帶，30kd－45kd之間的蛋白條帶，以及20kd－30kd之間的兩個(gè)蛋白條帶為栝樓籽特點(diǎn)蛋白質(zhì)條帶，以此來鑒定栝樓籽。

本發(fā)明主要對(duì)已收集的不同品系的栝樓籽進(jìn)行蛋白質(zhì)的比較分析，通過栝樓蛋白質(zhì)電泳圖譜，以此來鑒定栝樓籽。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果：

對(duì)于栝樓籽鑒定這一個(gè)領(lǐng)域還沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)，本發(fā)明為栝樓籽的鑒定提供了可行的方法。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：實(shí)驗(yàn)操作簡單，不需要通過精密儀器進(jìn)行深入檢測，僅需要通過比較蛋白質(zhì)條帶，并找到栝樓籽特征條帶，就能鑒定栝樓籽，既節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本，又節(jié)省了鑒定時(shí)間。

附圖說明

圖1為一種不同品種的栝樓籽蛋白質(zhì)電泳圖。

圖2為一種不同來源的栝樓籽蛋白質(zhì)電泳圖。

從圖1，圖2可以看到，在45kd－66kd之間的蛋白條帶，30kd－45kd之間的蛋白條帶，以及20kd－30kd之間的兩個(gè)蛋白條帶，均有栝樓籽特點(diǎn)蛋白質(zhì)條帶。

上述附圖為蛋白膠通過考馬斯亮藍(lán)染色后均為藍(lán)紫色。

具體實(shí)施方式

為了能更加清楚的說明本發(fā)明的方法，下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法做以詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1：

一種采用蛋白質(zhì)比對(duì)鑒定栝樓籽的方法，其步驟是：

(1)蛋白質(zhì)提?。?.5g栝樓籽(去皮)，液氮研磨至細(xì)粉；

(2)加入蛋白質(zhì)提取液，所述的蛋白質(zhì)提取液為500mmtris，50mmedta,700mm蔗糖，100mmkcl,ph8.0；

(3)加入等體積的tris-飽和酚，冰浴，振蕩30min，使之充分混勻。

(4)樣品放入低溫離心機(jī)(eppendorfcentrifuge5424r)4℃，12000rpm離心30min，取酚相(上層液)。余下的沉淀和液體再加入tris-飽和酚，重復(fù)本步驟2次，酚相收集到同一離心管中。

(5)向酚相中加入34倍體積的0.1m乙酸銨甲醇溶液，充分混勻，立即可見白色絮狀沉淀，并在-20℃沉淀過夜后樣品放入低溫離心機(jī)(eppendorfcentrifuge5424r)4℃，12000rpm離心30min，棄上清。沉淀用0.1m乙酸銨甲醇溶液洗滌4℃，12000rpm離心15min，棄上清，重復(fù)本步驟2次。沉淀用預(yù)冷丙酮洗滌4℃，12000rpm離心15min，棄上清，重復(fù)本步驟2次，將樣品離心管敞口，室溫下放置約30min，使丙酮揮發(fā)。最終得到的蛋白質(zhì)沉淀冷凍干燥后置-80℃下保存?zhèn)溆?，獲得蛋白質(zhì)干粉。

(6)蛋白膠準(zhǔn)備：參照分籽克隆手冊(cè)制備sds-page電泳膠，15％[含有15％丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺(29.1:0.9,m:m)電泳溶液]的分離膠及6％[含有6％丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺(29.1:0.9,m:m)電泳溶液]的濃縮膠，備用。

(7)蛋白質(zhì)含量測定：采用bradford法測定每個(gè)樣本的蛋白質(zhì)含量，統(tǒng)一每個(gè)樣本的上樣量。

(8)蛋白質(zhì)電泳：將不同品種的栝樓籽蛋白質(zhì)樣品上樣，80v電泳至電泳條帶進(jìn)入分離膠，120v至顯色液跑出分離膠。并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，并脫色，采集圖像，通過比較分析蛋白膠蛋白條帶進(jìn)行栝樓籽鑒定。

由此可見：不同品種的栝樓籽，都有以下特有蛋白質(zhì)條帶：45kd－66kd之間的蛋白條帶，30kd－45kd之間的蛋白條帶，以及20kd－30kd之間的兩個(gè)蛋白條帶為栝樓籽特征蛋白質(zhì)條帶。

實(shí)施例2：

一種采用蛋白質(zhì)比對(duì)鑒定栝樓籽的方法，其步驟是：

(1)蛋白質(zhì)提取：0.5g栝樓籽(去皮)，液氮研磨至細(xì)粉，加入蛋白質(zhì)提取液，所述的蛋白質(zhì)提取液為500mmtris，50mmedta,700mm蔗糖，100mmkcl,ph8.0，加入等體積的tris-飽和酚，冰浴，振蕩30min，使之充分混勻。樣品放入低溫離心機(jī)(eppendorfcentrifuge5424r)4℃，12000rpm離心30min，取酚相(上層液)。余下的沉淀和液體再加入tris-飽和酚，重復(fù)本步驟2次，酚相收集到同一離心管中。向酚相中加入3倍體積的0.1m乙酸銨甲醇溶液，充分混勻，立即可見白色絮狀沉淀，并在-20℃沉淀過夜后樣品放入低溫離心機(jī)4℃，12000rpm離心30min，棄上清。沉淀用0.1m乙酸銨甲醇溶液洗滌4℃，12000rpm離心15min，棄上清，重復(fù)2次。沉淀用預(yù)冷丙酮洗滌4℃，12000rpm離心15min，棄上清，重復(fù)2次，將樣品離心管敞口，室溫下放置約30min，使丙酮揮發(fā)。最終得到的蛋白質(zhì)沉淀冷凍干燥后置-80℃下保存?zhèn)溆?，獲得蛋白質(zhì)干粉。

(2)蛋白膠準(zhǔn)備：參照分籽克隆手冊(cè)制備sds-page電泳膠，15％[含有15％丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺(29.1:0.9,m:m)電泳溶液]的分離膠及6％[含有6％丙烯酰胺:甲叉雙丙烯酰胺(29.1:0.9,m:m)電泳溶液]的濃縮膠，備用。

(3)蛋白質(zhì)含量測定：采用bradford法測定每個(gè)樣本的蛋白質(zhì)含量，統(tǒng)一每個(gè)樣本的上樣量。

(4)蛋白質(zhì)電泳：將不同來源的栝樓籽蛋白質(zhì)樣品上樣，80v電泳至電泳條帶進(jìn)入分離膠，120v至顯色液跑出分離膠。并進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，并脫色，采集圖像，通過比較分析蛋白膠蛋白條帶進(jìn)行栝樓籽鑒定。

由此可見：不同來源的栝樓籽，都有以下特有蛋白質(zhì)條帶：45kd－66kd之間的蛋白條帶，30kd－45kd之間的蛋白條帶，以及20kd－30kd之間的兩個(gè)蛋白條帶為栝樓籽特征蛋白質(zhì)條帶。