本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物技術(shù)與分子診斷領(lǐng)域，具體地，涉及一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蒽環(huán)類化療藥血藥濃度的時(shí)間分辨免疫檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：蒽環(huán)類藥物(Anthracyclines)是一類常用的廣譜抗腫瘤藥物，主要包括多柔比星、表柔比星、吡柔比星、柔紅霉素和米托蒽醌等，廣泛地用于治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤和實(shí)體瘤，其中，多柔比星和表柔比星是乳腺癌輔助化療方案的首選藥物。但由于蒽環(huán)類藥物普遍存在心肌毒性和腎毒性，初次使用蒽環(huán)類藥物即可造成心臟損傷，隨著藥物累積劑量的增加毒性更明顯且不可逆，嚴(yán)重的毒副作用和心肌毒性使其用藥受限。為了更好發(fā)揮蒽環(huán)類藥物的抗腫瘤作用，盡可能避免此藥物不良反應(yīng)對(duì)機(jī)體的損害，因此早期監(jiān)測(cè)蒽環(huán)類藥物引起的心臟毒性并及早干預(yù)顯得尤為重要。另外，大多數(shù)抗腫瘤藥物具有治療指數(shù)低、毒性大的特點(diǎn)，體內(nèi)吸收、分布、代謝、排泄過程存在廣泛的差異；腫瘤病人中肝、腎損害常見，即使給予相同劑量的抗癌藥物，血藥濃度可相3～10倍；同時(shí)抗腫瘤藥物作用存在滯后性。大多數(shù)藥物的療效與該藥到作用部位的濃度或相關(guān)受體濃度密切相關(guān)，而藥物在受體部位的濃度直接與血藥濃度有關(guān)，兩者呈現(xiàn)平行關(guān)系，因此，血藥濃度的測(cè)定可作為間接衡量藥物在作用部位或受體濃度的指標(biāo)。而且，等同體重給藥(mg/kg)或體表面積給藥(mg/m2)下的穩(wěn)態(tài)血藥濃度在個(gè)體間存在顯著差異，僅僅根據(jù)體表面積給藥，大部分患者未能達(dá)到最優(yōu)的藥物暴露量。而基于的藥物劑量選擇，將穩(wěn)態(tài)血藥濃度維持在一定水平，能夠使患者在療效和毒性之間獲得最佳平衡。因此，需要建立一套簡(jiǎn)便即時(shí)的血藥監(jiān)測(cè)方法來控制有效藥物濃度。目前，蒽環(huán)類化療藥血藥監(jiān)測(cè)手段主要有紫外-高效液相色譜檢測(cè)(UV-HPLC)、高效液相色譜法(HPLC)、和液質(zhì)聯(lián)用色譜(LC-MS/MS)以及利用蒽環(huán)結(jié)構(gòu)自身熒光半定量的紫外分光光度法。色譜質(zhì)譜定量所需血清樣本量大，且檢測(cè)前須對(duì)樣本前處理，操作復(fù)雜繁瑣，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，不符合即時(shí)監(jiān)測(cè)及難以推廣其應(yīng)用。紫外分光光度法同樣樣品需求量大、靈敏度低、抗干擾能力差、專屬性差，臨床普及意義不大，已逐漸被淘汰。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蒽環(huán)類化療藥血藥濃度的時(shí)間分辨免疫檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明需要對(duì)試劑盒所使用的原料進(jìn)行制備與篩選，從而確定最佳原料，這一過程包括人工抗原的合成及偶聯(lián)比的確定，多克隆抗體的制備，標(biāo)記物和抗體的比例，包被抗體的濃度，標(biāo)記物的稀釋度，包被板的吸附性能和變異大小等。通過反復(fù)摸索和比對(duì)，確定了小分子人工抗原標(biāo)記和純化的最佳條件。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的。一種蒽環(huán)類化療藥血藥濃度的時(shí)間分辨熒光檢測(cè)試劑盒，包括校準(zhǔn)品、校準(zhǔn)品稀釋液、銪標(biāo)DOX-OVA抗原、抗DOX/EPI多抗、洗滌液、增強(qiáng)液、分析緩沖液、羊抗鼠IgG包被反應(yīng)板。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)使用DOX作為統(tǒng)一檢測(cè)蒽環(huán)類化療藥的半抗原，能夠?qū)⒋蠖鄶?shù)的蒽環(huán)類化療藥都能檢測(cè)出來，而如果用其他的蒽環(huán)類化療藥作為統(tǒng)一檢測(cè)蒽環(huán)類化療藥的半抗原的話，能檢出的蒽環(huán)類化療藥種類比較少，不具有普遍適用性。優(yōu)選地，所述銪標(biāo)DOX-OVA中DOX-OVA與Eu3+標(biāo)記物的質(zhì)量比為5:1，所述DOX-OVA中DOX與OVA的偶聯(lián)質(zhì)量比為12:1。優(yōu)選地，所述抗DOX/EPI多抗制備使用的抗原為DOX-KLH，所述DOX-KLH中DOX與KLH偶聯(lián)摩爾比為1:5。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，上述校準(zhǔn)品的制備步驟如下：用校準(zhǔn)品稀釋液，將DOX校準(zhǔn)品配制成0、10、50、100、1000及2000ng/mL系列濃度的校準(zhǔn)溶液，按每瓶1mL分裝凍干，4℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，校準(zhǔn)品稀釋液成分包括2mg/mlBSA及0.1％NaN3的50mM,pH7.8Tris-HCl緩沖液根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，包被反應(yīng)板為按每孔0.5ug羊抗鼠IgG，100ul包被緩沖液加入96孔透明微孔板，并封閉凍干制備而成。其中封閉液成分為50mMTris-HCl，0.1％BSA、4％海藻糖、0.05％NaN3，pH7.2。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，多柔比星人工合成抗原的制備是通過DOX上的氨基與經(jīng)過EDC/NHS活化的載體蛋白(KLH/OVA)偶聯(lián)并純化得到，DOX與OVA的最佳偶聯(lián)比為12:1。銪標(biāo)記抗CEA抗體的制備步驟為：選用DOX-OVA作檢測(cè)抗原進(jìn)行Eu3+標(biāo)記，抗原與Eu3+標(biāo)記物的比例為5:1(質(zhì)量比)為最佳比例。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，抗DOX/EPI多抗以DOX-KLH偶聯(lián)物作完全抗原免疫Balb/c小鼠制備得到，純化后抗DOX/EPI多抗用磷酸鹽緩沖液(0.1M,pH7.4)稀釋濃度為1mg/ml，每瓶100ul分裝，真空冷凍干燥。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，分析緩沖液配方為：Tris-HCl(50Mm,pH7.8)、PEG6000(1.5％)、BSA(0.2％)、Proclin300(0.1％)、牛IgG(0.02％)、Tween20(0.1％)和NaCl(0.84％)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，洗滌液配方為：Tris-HCl(1.25mmol/L,pH7.8)、Tween20(2.5％)和NaCl(21％)。根據(jù)本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，增強(qiáng)液配方由β2二酮體、三辛基氧化磷(TOPO)、Triton200、醋酸和鄰苯二甲酸氫鉀(pH2.0～3.2)組成。根據(jù)本發(fā)明所述的抗DOX/EPI鼠源多克隆抗體的制備步驟如下：(1)DOX-KLH完全抗原的制備:將5mg血藍(lán)蛋白(KLH)溶解于0.5ml磷酸鹽緩沖液中(pH7.2,0.1M),分別配制10mg/mlEDC和NHS溶液，往KLH溶液中加入10ulEDC溶液和6.7ulNHS溶液，室溫條件下活化30min。配制2mg/mlDOX水溶液，取1mg的DOX加入活化的KLH中，37℃避光反應(yīng)過夜。反應(yīng)后，用磷酸鹽緩沖液(pH7.2,0.1M)透析24小時(shí)?？乖?mg分裝凍干，-20℃貯存。DOX-OVA完全抗原的制備同上。(2)小鼠免疫:將DOX-KLH完全抗原，用1ml純水溶解，免疫方式采用皮下多點(diǎn)注射免疫，每只Balb/c小鼠接種劑量為50μg，三周后同樣用1ml純水溶解DOX-KLH完全抗原凍干粉，對(duì)小鼠皮下多點(diǎn)注射，每只小鼠接種劑量為50μg，加強(qiáng)免疫2次。(3)血清效價(jià)測(cè)定：取小鼠尾靜脈血，9000rpm，離心10min，將上清轉(zhuǎn)入新的EP管中，對(duì)小鼠血清的效價(jià)測(cè)定采用時(shí)間分辨熒光免疫分析法，將DOX-OVA抗原溶于包被液中，配成5ug/ml包被液，每孔加入100μl，37℃振蕩孵育1小時(shí)。棄液，拍干，加入封閉液，每孔200μl，4℃封閉過夜。次日，棄液，拍干。往包被好的反應(yīng)孔內(nèi)加入倍比稀釋好的小鼠血清100μl/孔，并設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，37℃孵育2小時(shí)。用洗滌液洗4次，加入用分析緩沖液以1:10000倍稀釋銪標(biāo)羊抗鼠IgG，100μl/孔，置37℃孵育1小時(shí)。用洗滌液洗6次，加入增強(qiáng)液，200μl/孔，37℃孵育5min，測(cè)值。(4)血清效價(jià)高于1/10000時(shí)，收集小鼠血清，分裝，-20℃貯存。根據(jù)本發(fā)明所述的銪標(biāo)記DOX-OVA合成抗原的制備步驟如下：(1)抗原純化和濃縮：1mgDOX-OVA合成抗原，用市售的帶有濾膜的G-10離心管9000rpm離心5min，棄濾液，并加入200ul標(biāo)記緩沖液(50mmol/L,Na2CO3,pH9.0)重復(fù)洗滌6次，倒轉(zhuǎn)G-10離心管，1500rpm離心2min收集抗原。(2)抗原標(biāo)記：往純化好的DOX-OVA抗原中加入0.2mgEu3+標(biāo)記試劑，充分混勻，25℃振蕩過夜。(3)上樣與洗脫：用SephadexG-50層析柱(1×30cm)分離純化,洗脫液(含0.9％NaCl的50mmol/LTris-HCl)洗脫，同時(shí)收集流出液(1ml/管)，逐管測(cè)量吸光度(A280),合并峰管，測(cè)蛋白含量并計(jì)算標(biāo)記率。(4)確定稀釋度：并管后的銪標(biāo)記物，進(jìn)行稀釋度摸索，選擇線性較好，靈敏度較好的稀釋度；優(yōu)選稀釋度為1/200，以此為基準(zhǔn)稀釋并管后的標(biāo)記物。(5)分裝標(biāo)記物：分裝體積為1.0ml/瓶，真空冷凍干燥。(6)保存：凍干后在2～8℃條件下保存。本發(fā)明的試劑盒的工作原理如下：羊抗鼠二抗包被的96孔微孔板，作為反應(yīng)中的固相介質(zhì)，通過包被抗體捕獲鼠源抗多柔比星多克隆抗體，通過競(jìng)爭(zhēng)的反應(yīng)模式，銪標(biāo)記的多柔比星人工抗原與多柔比星校準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗蒽環(huán)類藥物的鼠源多抗，洗滌后，加入增強(qiáng)液解離銪原子增大熒光信號(hào)，用時(shí)間分辨熒光檢測(cè)儀測(cè)值。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的試劑盒是以血清樣本作為檢測(cè)樣本，以多柔比星與KLH完全抗原進(jìn)行免疫，自制針對(duì)蒽環(huán)結(jié)構(gòu)特異性多克隆抗體，能識(shí)別互為同分異構(gòu)體的DOX和EPI，而在化療用藥組合中蒽環(huán)類藥物是單一選擇配伍其他類型化療藥物，且蒽環(huán)類藥物屬于外源性物質(zhì)，體內(nèi)物質(zhì)對(duì)其檢測(cè)的影響小。因此，本試劑盒可分別測(cè)定蒽環(huán)類藥物中代表藥物DOX和EPI的血藥濃度。利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)范圍寬、無放射性污染等特點(diǎn)，適合用于臨床蒽環(huán)類藥物血藥監(jiān)測(cè)，指導(dǎo)臨床用藥。附圖說明圖1為多柔比星與表柔比星結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為本試劑盒多柔比星的劑量反應(yīng)曲線(雙對(duì)數(shù)擬合)。圖3為本發(fā)明的試劑盒與液質(zhì)聯(lián)用色譜方法(LC-MS/MS)測(cè)定臨床樣本多柔比星測(cè)值的相關(guān)性分析(回歸分析)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作出進(jìn)一步地詳細(xì)闡述，所述實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。實(shí)施例1一種實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蒽環(huán)類化療藥血藥濃度的時(shí)間分辨免疫檢測(cè)試劑盒，試劑盒的組成為：(1)校準(zhǔn)品1套，分別編號(hào)A-F；(2)銪標(biāo)抗原1瓶，為凍干品；(3)抗DOX/EPI鼠源多克隆抗體1瓶，為凍干品，(4)洗滌液1瓶，50ml，(5)增強(qiáng)液1瓶，50ml，(6)分析緩沖液1瓶，50ml，(7)羊抗鼠IgG包被的反應(yīng)板1塊，96孔/塊，(8)封片3片，(9)說明書1份。其中，抗DOX/EPI鼠源多克隆抗體的制備步驟如下：DOX-KLH完全抗原的制備：將5mg血藍(lán)蛋白(KLH)溶解于0.5ml磷酸鹽緩沖液中(pH7.2,0.1M)，分別配制10mg/ml的EDC和NHS溶液，往KLH溶液中加入10ulEDC溶液和6.7ulNHS溶液，室溫條件下活化30min。配制2mg/mlDOX水溶液，取1mg的DOX加入活化的KLH中，37℃避光反應(yīng)過夜。反應(yīng)后，用磷酸鹽緩沖液(pH7.2,0.1M)透析24小時(shí)?？乖?mg分裝凍干，-20℃貯存。小鼠免疫：將DOX-KLH完全抗原，用1ml純水溶解，免疫方式采用皮下多點(diǎn)注射免疫，每只Balb/c小鼠接種劑量為50μg，三周后同樣用1ml純水溶解DOX-KLH完全抗原凍干粉，對(duì)小鼠皮下多點(diǎn)注射，每只小鼠接種劑量為50μg，加強(qiáng)免疫2次。血清效價(jià)測(cè)定：取小鼠尾靜脈血，9000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)入新的EP管中，對(duì)小鼠血清的效價(jià)測(cè)定采用時(shí)間分辨熒光免疫分析法，將DOX-OVA抗原溶于包被液中，配成5ug/ml包被液，每孔加入100μl，37℃振蕩孵育1小時(shí)。棄液，拍干，加入封閉液，每孔200μl，4℃封閉過夜。次日，棄液，拍干。往包被好的反應(yīng)孔內(nèi)加入倍比稀釋好的小鼠血清100μl/孔，并設(shè)陽性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，37℃孵育2小時(shí)。用洗滌液洗4次，加入用分析緩沖液以1:10000倍稀釋的銪標(biāo)羊抗鼠IgG，100μl/孔，置37℃孵育1小時(shí)。用洗滌液洗6次，加入增強(qiáng)液，200μl/孔，37℃孵育5min，測(cè)值。血清效價(jià)高于1/10000時(shí)，收集小鼠血清，分裝，-20℃貯存。DOX-OVA抗原的制備：將5mg卵清白蛋白(OVA)溶解于0.5ml磷酸鹽緩沖液中(pH7.2,0.1M)，分別配制10mg/ml的EDC和NHS溶液，往OVA溶液中加入10ulEDC溶液和6.7ulNHS溶液，室溫條件下活化30min。配制2mg/mlDOX水溶液，取1mg的DOX加入活化的OVA中，37℃避光反應(yīng)過夜。反應(yīng)后，用磷酸鹽緩沖液(pH7.2,0.1M)透析24小時(shí)。抗原1mg分裝凍干，-20℃貯存。銪標(biāo)記DOX-OVA抗原的制備步驟如下：(1)抗原純化和濃縮：1mgDOX-OVA合成抗原，用市售的帶有濾膜的G-10離心管9000rpm離心5min，棄濾液，并加入200ul標(biāo)記緩沖液(50mmol/L,Na2CO3,pH9.0)重復(fù)洗滌6次，倒轉(zhuǎn)G-10離心管，1500rpm離心2min收集抗原。(2)抗原標(biāo)記：往純化好的DOX-OVA抗原中加入0.2mg的Eu3+標(biāo)記試劑，充分混勻，25℃振蕩過夜。(3)上樣與洗脫：用SephadexG-50層析柱(1×30cm)分離純化,洗脫液(含0.9％NaCl的50mmol/LTris-HCl)洗脫，同時(shí)收集流出液(1ml/管)，逐管測(cè)量吸光度(A280),合并峰管，測(cè)蛋白含量并計(jì)算標(biāo)記率。(4)確定稀釋度：并管后的銪標(biāo)記物，進(jìn)行稀釋度摸索，選擇線性較好，靈敏度較好的稀釋度；優(yōu)選稀釋度為1/200，以此為基準(zhǔn)稀釋并管后的標(biāo)記物。(5)分裝標(biāo)記物：分裝體積為1.0ml/瓶，真空冷凍干燥。(6)保存：凍干后在2-8℃條件下保存。試劑盒的使用方法如下：樣本收集：采靜脈血1～2ml于凝血管中，4℃放置2小時(shí)以上，待血清析出后取25ml血清即可。血清樣品在2～8℃可以保存7天，如果需要長(zhǎng)期保存，請(qǐng)?jiān)?20℃保存，避免反復(fù)凍融。樣品需要在含干冰的保溫瓶或其它裝置條件下運(yùn)輸。試劑的準(zhǔn)備：洗滌液：將50ml的25×洗滌液和1200ml去離子水混合，作為工作洗滌液。銪標(biāo)抗原工作液：使用前一小時(shí)將每瓶銪標(biāo)抗原用1ml無菌去離子水溶解，用分析緩沖液按1:25倍稀釋作為銪標(biāo)工作液?？贵w工作液：抗DOX/EPI多抗凍干品，用100ul去離子水重溶，按測(cè)試用量以分析緩沖液1/2000稀釋，作為抗體工作液。校準(zhǔn)品使用前用1ml去離子水溶解，4℃保存。具體操作步驟如下：(1)首先將包被反應(yīng)板置室溫平衡(23～28℃，30min)，然后往反應(yīng)孔中每孔加入100ul抗體工作液，室溫振蕩孵育1小時(shí)。(2)洗滌液洗4次，拍干。(3)依次分別加入校準(zhǔn)品A-F，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，每孔50ul，然后每孔加入銪標(biāo)抗原工作液50ul，37℃振蕩孵育1小時(shí)。(4)洗滌液洗6次，拍干(5)每孔加入200ul增強(qiáng)液，37℃振蕩孵育5分鐘(6)使用時(shí)間分辨免疫熒光檢測(cè)儀，在激發(fā)波長(zhǎng)340nm，發(fā)射波長(zhǎng)613nm是測(cè)定銪的熒光值。分別以校準(zhǔn)品中DOX濃度的Log值為橫坐標(biāo)，測(cè)定的熒光值扣除本底后的Log值為縱坐標(biāo)，繪制DOX/EPI的劑量-反應(yīng)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)方程，帶入測(cè)值計(jì)算出血樣中DOX/EPI的具體濃度。實(shí)施例2按照本領(lǐng)域中常規(guī)的制造和檢定規(guī)程對(duì)通過上述制備的試劑盒進(jìn)行檢定，結(jié)果如下：分析靈敏度和線性范圍：以零參考標(biāo)準(zhǔn)品當(dāng)作樣品測(cè)量10次，計(jì)算其熒光值及標(biāo)準(zhǔn)差。以該點(diǎn)熒光測(cè)定平均值減去2倍標(biāo)準(zhǔn)差所得的熒光值代入標(biāo)準(zhǔn)方程計(jì)算得出的濃度值為其分析靈敏度，經(jīng)測(cè)定本試劑分析靈敏度為3.8ng/ml。將抗原稀釋成不同濃度進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為3.8～2000ng/ml。精密度(CV％)：用本發(fā)明的試劑盒對(duì)自制DOX質(zhì)控品(質(zhì)控品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，預(yù)期濃度分別為10、100、1000ng/ml)進(jìn)行測(cè)定，各設(shè)10個(gè)復(fù)孔。結(jié)果本發(fā)明試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)(CV％)為3.5％～6.5％和批間變異系數(shù)(CV％)為5.4％～8.8％。表1批內(nèi)精密度測(cè)試結(jié)果(n＝10)表2批間精密度測(cè)試結(jié)果(三批，n＝3*10)測(cè)定值DOX(ng/mL)CV％質(zhì)控品I9.89±0.616.1質(zhì)控品II102.62±5.625.4質(zhì)控品III989.47±87.208.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：取一批本發(fā)明的試劑盒，分別在37℃條件下放置7天或者在4℃條件下放置三個(gè)月，觀察各階段試劑的物理外觀，鑒定保存期間標(biāo)準(zhǔn)品活性變化，評(píng)價(jià)其最低檢測(cè)量、準(zhǔn)確度、線性、精密度指標(biāo)。測(cè)定結(jié)果表明，各項(xiàng)指標(biāo)均符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，試劑盒穩(wěn)定可靠。實(shí)施例3本發(fā)明的試劑盒與液質(zhì)聯(lián)用色譜法(LC-MS/MS)臨床血樣測(cè)值比較用本發(fā)明的試劑盒和液質(zhì)聯(lián)用色譜法(LC-MS/MS)同時(shí)對(duì)220份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)。以本發(fā)明方法測(cè)定血樣的DOX濃度結(jié)果為橫坐標(biāo)，以LC-MS/MS法測(cè)定的DOX濃度結(jié)果為縱坐標(biāo)做回歸分析，相關(guān)方程為：Y＝2.606+0.986X，相關(guān)系數(shù)r＝0.996(圖3)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果表明，本發(fā)明方法與LC-MS/MS法臨床血樣測(cè)值均具有顯著相關(guān)性。當(dāng)前第1頁1 2 3