本發(fā)明涉及水處理領(lǐng)域，特別涉及污泥臭氧處理過程中活菌含量和組成的檢測方法。

背景技術(shù)：

剩余污泥是污水生物處理系統(tǒng)的副產(chǎn)物，其處理和處置費(fèi)用占到污水廠運(yùn)行費(fèi)用的50％以上，因此需要開發(fā)有效的污泥減量方法。臭氧氧化是一種新興的污泥減量方法，并且目前已有研究將臭氧污泥處理與生物脫氮除磷工藝結(jié)合：活性污泥臭氧處理后，處理后污泥回流至厭氧池或缺氧池，補(bǔ)充碳源以促進(jìn)脫氮除磷效果。臭氧是一種強(qiáng)氧化劑，進(jìn)行污泥處理時(shí)污泥細(xì)菌細(xì)胞膜首先被破壞導(dǎo)致細(xì)胞損傷，損傷后細(xì)菌胞內(nèi)物質(zhì)(三磷酸腺苷(ATP)、蛋白和DNA等大分子物質(zhì))流失，臭氧可以進(jìn)一步氧化和溶解釋放的大分子有機(jī)質(zhì)，從而導(dǎo)致污泥減量。活性污泥主要由擬桿菌、變形菌、不動(dòng)桿菌等種類繁多的細(xì)菌組成，不同的細(xì)菌具有不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致它們具有不同的臭氧氧化耐性。同時(shí)，一些活性污泥中的功能細(xì)菌類群，如反硝化菌、硝化細(xì)菌和聚磷菌等具有重要的水質(zhì)凈化功能，當(dāng)臭氧污泥減量工藝與脫氮除鱗工藝結(jié)合時(shí)，這部分功能細(xì)菌沒有必要被殺滅。因此，探明活性污泥中不同細(xì)菌在臭氧處理過程中的耐受性對于臭氧污泥減量工藝的優(yōu)化具有重要指導(dǎo)意義。但是，目前對于污泥臭氧減量處理大家主要關(guān)注污泥總量的消減效果，很少關(guān)注內(nèi)在的微生物響應(yīng)機(jī)制。

如前所述，臭氧污泥處理主要通過細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致污泥細(xì)菌滅活。因此，通過活菌檢測可以判斷不同活性污泥細(xì)菌對臭氧氧化的耐受性。傳統(tǒng)的活菌檢測主要使用營養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行異樣菌的篩選，再通過菌種鑒定進(jìn)行活菌組成的解析。但是，活性污泥中超過90％的細(xì)菌是不可培養(yǎng)的，傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法無法全面解析活菌群落組成與變化。同時(shí)，傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法需要至少兩天的檢測時(shí)間，無法及時(shí)解析活菌總量變化，從而無法及時(shí)指導(dǎo)臭氧工藝運(yùn)行優(yōu)化。

ATP是活細(xì)胞內(nèi)能量傳遞的重要介質(zhì)，單細(xì)胞死亡后ATP不再產(chǎn)生，殘留的ATP也會(huì)很快消耗掉，因此ATP含量與活細(xì)胞總量具有良好的一致性。同時(shí)，ATP依賴性的熒火蟲發(fā)光素酶(Firefly Luoiferase)催化熒火蟲發(fā)光素(Firefly Luciferin)氧化發(fā)光反應(yīng)可作為活菌的標(biāo)志快速檢測ATP含量，總體檢測時(shí)間少于<3min?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，通過檢測活性污泥中ATP總量可以快速檢測污泥中活菌總量。ATP方法可以快速檢測臭氧處理中活性污泥中活菌總量變化，從而及時(shí)對臭氧運(yùn)行狀況進(jìn)行檢測和評價(jià)。但是，ATP檢測方法無法給出活菌群落具體組成信息，從而無法解析不同活性污泥細(xì)菌對臭氧氧化的耐受性。疊氮溴化丙錠(PMA)是一種新型的DNA染料，其可以進(jìn)入死菌細(xì)胞內(nèi)并與DNA結(jié)合，在強(qiáng)光照射下可以與DNA進(jìn)行不可逆結(jié)合，從而抑制后續(xù)的PCR反應(yīng)。因此，通過將PMA處理、PCR擴(kuò)增及測序技術(shù)結(jié)合可以選擇性的擴(kuò)增活菌的16s rRNA基因，從而實(shí)現(xiàn)活性污泥中活菌群落分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種快速和全面解析污泥臭氧處理過程中污泥中活菌數(shù)量和組成變化的檢測方法，該方法通過ATP檢測不同臭氧處理過程中污泥中活菌總量變化，對于有意義的臭氧處理污泥進(jìn)行PMA輔助的PCR測序分析，完成臭氧處理后污泥中活菌組成分析。本檢測方法可以快速分析不同臭氧處理?xiàng)l件下污泥中活菌殺滅效果，從而用于臭氧運(yùn)行效果評價(jià)和優(yōu)化；同時(shí)，可以進(jìn)行活菌組成分析進(jìn)行污泥臭氧氧化處理的微生態(tài)響應(yīng)機(jī)制研究。

(1)對活性污泥和臭氧處理后污泥進(jìn)行均一化處理，用10倍體積的Ringer1/4溶液進(jìn)行稀釋，1ml針管吹打10次；然后再用10倍體積的Ringer1/4溶液稀釋于玻璃管中，超聲波清洗機(jī)加入超純水，超聲45s，渦旋10s，共9個(gè)循環(huán)，據(jù)能量密度計(jì)算，控制消耗能量在16000J·L^-1。

(2)根據(jù)固體物質(zhì)含量進(jìn)行適當(dāng)稀釋后進(jìn)行ATP檢測:將步驟(1)處理好的污泥樣品和ATP提取劑分別置于38℃水浴中至少1min；在500μl污泥樣品中加入50μlATP提取液后，在水浴保持100s，立即測定熒光值，得到總ATP熒光值；用0.1μm無菌濾膜過濾上述測定測總ATP熒光值之后的樣品，測量濾液ATP熒光值，得到胞外ATP熒光值；活菌ATP熒光值＝總ATP熒光值-胞外ATP熒光值從而得到污泥臭氧處理過程中活菌含量；采用ATP依賴性的熒火蟲發(fā)光素酶(Firefly Luoiferase)催化熒火蟲發(fā)光素(Firefly Luciferin)氧化發(fā)光反應(yīng)可作為活菌的標(biāo)志快速檢測ATP含量；

(3)基于ATP檢測結(jié)果，針對步驟(2)臭氧處理前后ATP含量有變化的污泥，加入PMA并在強(qiáng)光照條件下處理：對步驟(1)對應(yīng)均一化處理后的污泥使用磷酸鹽緩沖液稀釋至1000mg/L，取1ml稀釋后污泥加入PMA染料至PMA終濃度為50uM，冰上暗育10min，然后650瓦強(qiáng)光照射下反應(yīng)10min，照射過程降溫保證反應(yīng)溫度<5℃；處理污泥，使用試劑盒進(jìn)行總DNA提取，并進(jìn)行16srRNA基因PCR擴(kuò)增，并對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，對于測序結(jié)果使用質(zhì)控和群落組成分析，然后得出污泥臭氧處理過程中活菌組成。

采用本發(fā)明的方法很容易直接得出或評價(jià)污泥臭氧處理過程中活菌含量和組成。且方法簡單，重復(fù)性好，準(zhǔn)確性高，不受污泥濃度的影響。本檢測方法可以快速分析不同臭氧處理?xiàng)l件下污泥中活菌殺滅效果，從而用于臭氧運(yùn)行效果評價(jià)和優(yōu)化；同時(shí)，可以進(jìn)行活菌組成分析進(jìn)行污泥臭氧氧化處理的微生態(tài)響應(yīng)機(jī)制研究。

附圖說明

圖1為實(shí)例不同臭氧消耗量的活菌ATP濃度；

圖2不同臭氧消耗量的胞外ATP濃度；

圖3不同臭氧殺菌率；

圖4為實(shí)例PMA檢測不同臭氧消耗量的活菌DNA拷貝數(shù)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施案例對本發(fā)明作進(jìn)一步具體的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例1

1.臭氧處理活性污泥的活菌檢測

固定臭氧投入量分別為：0、51.99、114.38、135.15、155.94、207.90、259.89、311.89mg.g^-1，污泥濃度2000mg/L。

2、ATP快速檢測活菌含量

(1)取1ml污泥樣品用Ringer1/4溶液1:10稀釋，1ml針管吹打10次；用Ringer1/4溶液1:10稀釋于玻璃管中，超聲波清洗機(jī)加入12.7L超純水，超聲45s，渦旋10s，共9個(gè)循環(huán)(據(jù)能量密度計(jì)算，控制消耗能量在16000J·L-1)。

(2)將處理好的污泥樣品和ATP提取劑分別在38℃水浴中至少1min；500μl體積樣品中加入50μlATP提取液后，水浴時(shí)間100s，快速測定熒光值，得到總ATP熒光值；用0.1μm無菌濾膜過濾污泥樣品，測量濾液ATP熒光值，得到胞外ATP熒光值；活菌ATP熒光值＝總ATP-胞外ATP。

3、基于ATP檢測結(jié)果，選擇ATP含量有明顯變化的污泥，加入PMA并在強(qiáng)光照條件下處理，處理污泥使用試劑盒進(jìn)行總DNA提取，并進(jìn)行16s rRNA基因PCR擴(kuò)增，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。

隨臭氧投加量的增加，活菌DNA的拷貝數(shù)開始減少，當(dāng)消耗量達(dá)到135.2mg的時(shí)候，活菌DNA的拷貝數(shù)量變化明顯，殺菌效果明顯；之后隨臭氧消耗量的增加，活菌DNA的拷貝數(shù)量的變化趨于持平，當(dāng)臭氧消耗量達(dá)311.9mg時(shí)，DNA拷貝數(shù)又有一個(gè)明顯下降，與ATP檢測結(jié)果相符。

PMA濃度對活菌DNA的擴(kuò)增的影響

取1ml濃度為1000mg/l活菌污泥樣品，分別用PMA處理，使PMA終濃度分別為0μM、50μM、70μM、100μM，提取DNA，進(jìn)行q-PCR鑒定，結(jié)果如圖所示，在0、50、70μM濃度的PMA作用下，DNA的拷貝數(shù)變化差別并不明顯，當(dāng)PMA終濃度達(dá)到100Μm時(shí)，DNA拷貝數(shù)少量下降，說明PMA終濃度在70Μm以內(nèi)時(shí)，PMA對活菌DNA的擴(kuò)增并無明顯影響,當(dāng)PMA終濃度達(dá)到100Μm時(shí),對活菌DNA的擴(kuò)增有抑制作用。

表1不同時(shí)間取樣的臭氧消耗量

ATP檢測結(jié)果：

ATP檢測結(jié)果如圖所示，隨臭氧投加量的增加，活菌數(shù)量開始減少，當(dāng)消耗量達(dá)到135.15mg的時(shí)候，活菌數(shù)量變化明顯，殺菌效果明顯，殺菌效率達(dá)70.89％；之后隨臭氧消耗量的增加，活菌數(shù)量的變化趨于持平，當(dāng)臭氧消耗量達(dá)311.89mg時(shí)，殺菌率達(dá)87.96％。根據(jù)ATP檢測結(jié)果選取臭氧消耗量為0mg.g^-1、114.3mg.g^-18、135.15mg.g^-1、311.88mg.g^-1的樣品進(jìn)行基因定量分析和活菌種群分析。

PMA檢測結(jié)果

PMA檢測結(jié)果如圖所示，隨臭氧投加量的增加，活菌DNA的拷貝數(shù)開始減少，當(dāng)消耗量達(dá)到135.2mg的時(shí)候，活菌DNA的拷貝數(shù)量變化明顯，殺菌效果明顯；之后隨臭氧消耗量的增加，活菌DNA的拷貝數(shù)量的變化趨于持平，當(dāng)臭氧消耗量達(dá)311.9mg時(shí)，DNA拷貝數(shù)又有一個(gè)明顯下降，與ATP檢測結(jié)果相符。

上述實(shí)例表明，利用ATP結(jié)合PMA-qPCR方法，操作過程簡單，可以快速分析不同臭氧處理?xiàng)l件下污泥中活菌殺滅效果，從而用于臭氧運(yùn)行效果評價(jià)和優(yōu)化；同時(shí)，可以進(jìn)行活菌組成分析進(jìn)行污泥臭氧氧化處理的微生態(tài)響應(yīng)機(jī)制研究。