本發(fā)明涉及測(cè)定方法，具體地說(shuō)是采用固相微萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定花生葉片茉莉酸含量的方法。

背景技術(shù)：

目前，農(nóng)藥價(jià)格昂貴，并且過(guò)度使用農(nóng)藥會(huì)使害蟲的抗藥性增加，害蟲天敵的數(shù)量不斷減少甚至滅絕，還會(huì)造成環(huán)境的嚴(yán)重污染，農(nóng)藥的使用必然受到極大的限制，促使科學(xué)家找到一種方法，將農(nóng)藥用量降到最小化的同時(shí)達(dá)到抗蟲的最佳效果，使農(nóng)作物高產(chǎn)，高質(zhì)，高營(yíng)養(yǎng)。

茉莉酸類物質(zhì)是一類新型植物激素，能使植物引起多種生理反應(yīng)，能夠通過(guò)植物體直接或間接誘導(dǎo)產(chǎn)生并積累，能夠促進(jìn)相關(guān)基因表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生各種有特殊功能的有機(jī)物，例如某些蛋白質(zhì)，達(dá)到抗擊病蟲害的目的。

茉莉酸是茉莉酸類化合物及其衍生物的前體，是一種內(nèi)源信號(hào)分子，建立一種靈敏、穩(wěn)定的花生葉中茉莉酸定量分析方法十分重要，利用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對(duì)花生葉樣品進(jìn)行分析，找出穩(wěn)定的前處理純化方法，建立起高效、穩(wěn)定的花生葉內(nèi)源茉莉酸的定量檢測(cè)方法，并對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化，找到不同基因改造處理后花生葉中茉莉酸含量規(guī)律，對(duì)花生研究抗蟲具有重要的科學(xué)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種測(cè)定花生葉片茉莉酸含量的方法。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采用的技術(shù)方案是：一種測(cè)定花生葉片茉莉酸含量的方法，包括以下步驟：

(1)花生葉片樣品制備；(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備；(3)制備流動(dòng)相以及茉莉酸、二氫茉莉酸甲醇溶液；(4)樣品的萃取與富集；(5)LC-MS檢測(cè)條件的建立；(6)樣品檢測(cè)。

作為優(yōu)選，本發(fā)明包括以下步驟：

(1)取1g花生葉，加入內(nèi)標(biāo)200ngDHJA，用液氮研磨；

研磨物用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡過(guò)夜，之后在0-4℃、9000-13000rpm/min離心5-20分鐘，用移液槍移取2.5-5mL上清液于15ml離心管中；

殘?jiān)?mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡過(guò)夜，之后在0-4℃、9000-13000rpm/min離心5-20分鐘，用移液槍移取2.5-5mL上清液于10ml離心管中，重復(fù)此過(guò)程1-3次；

合并以上浸提的上清液，于4℃條件下氮?dú)獯蹈桑ㄈ苡?ml 80％甲醇中。

(2)取1g花生葉，加入內(nèi)標(biāo)200ngDHJA，再用10ul注射器分別加入5ng/g、10ng/g、20ng/g、50ng/g、100ng/g、200ng/g、500ng/g、1000ng/g的JA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品；將標(biāo)準(zhǔn)樣品用液氮研磨，再用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡過(guò)夜，之后于4℃、9000-13000rpm/min離心5-20分鐘，然后用移液槍移取2.5mL上清液于15ml離心管中；

殘?jiān)?mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡過(guò)夜，于4℃、9000-13000rpm/min離心5-20分鐘，用移液槍移取2.5mL上清液于10ml離心管中，重復(fù)2-3次；

合并上述浸提的上清液，于4℃條件下氮?dú)獯蹈?，將其定溶?ml 80％甲醇中。

(3)配置流動(dòng)相：95％乙腈+5％水、95％水+5％乙腈以及1‰甲酸+5％乙腈+水的制備，分別制備1ppm、100ppm、1000ppm二氫茉莉酸甲醇溶液，制備10ppm茉莉酸、二氫茉莉酸甲醇溶液，制備500ppb茉莉酸、二氫茉莉酸甲醇溶液混標(biāo)；

(4)樣品的萃取與富集；

(5)質(zhì)譜條件的建立：使用二氫茉莉酸作為茉莉酸的內(nèi)標(biāo)物；

色譜條件的建立：使用上述配置的流動(dòng)相作為分析所用的色譜條件；

(6)樣品檢測(cè)：用1ppm茉莉酸和1ppm二氫茉莉酸進(jìn)行碎片離子掃描，確定其特征子離子，利用三重四級(jí)桿獲取茉莉酸母離子209m/z的色譜圖，然后加入標(biāo)準(zhǔn)品50ng，進(jìn)行檢測(cè)。

更進(jìn)一步的是：所述樣品檢測(cè)還包括定量及回收率測(cè)定，包括以下步驟：使用內(nèi)標(biāo)法，以DHJA作為內(nèi)標(biāo)物，每份樣品加入內(nèi)標(biāo)200ngDHJA，用濃度分別為：5ppb(ng/g)、10ppb、20ppb、50ng/g、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb的茉莉酸甲醇溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

分別設(shè)定5ppb、10ppb、100ppb三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品添加水平，進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)，計(jì)算回收率。

更進(jìn)一步的是，所述樣品的萃取與富集包括以下步驟：

加2mL超純水于5mL樣瓶中，將樣品轉(zhuǎn)移到50mL樣瓶中，加入帶有磁性的ZZ-SBSE-04-1型PES涂層固相微萃取攪拌棒攪拌1.5h；

在2mL樣瓶中加入內(nèi)套管，并加入250μL丙酮，將上述固相微萃取攪拌棒放入并封口，然后放入超聲儀中超聲20min進(jìn)行解吸。取丙酮解吸液待測(cè)。

上述中，本發(fā)明還包括花生葉干樣處理過(guò)程，包括以下步驟：

第一步：向試管中的樣品加入1mL甲醇，充分震蕩使其溶解；

第二步：用移液槍轉(zhuǎn)移至2mL PC管中；

第三步：用離心機(jī)13000r離心10分鐘；

第四步：用移液槍吸取上清液，裝于2mL樣瓶中；

第五步：用封口膜封口，放在零下20攝氏度保存。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明測(cè)試方法穩(wěn)定性高，數(shù)據(jù)精確，檢測(cè)結(jié)果可靠，化合物分離度較好。本發(fā)明方法能夠快速檢測(cè)花生葉中的茉莉酸含量，操作快速，效率高。通過(guò)檢測(cè)花生葉中茉莉酸含量，科研人員對(duì)花生的抗蟲能力、生長(zhǎng)過(guò)程中農(nóng)藥用量、產(chǎn)量甚至環(huán)境的保護(hù)、恢復(fù)生態(tài)平衡、保護(hù)生物多樣性等進(jìn)行系統(tǒng)的研究，其具有重要的科學(xué)意義。

附圖說(shuō)明

圖1采用流動(dòng)相體系(a)時(shí)的液相色譜圖；

圖2茉莉酸標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖3 JH1012ck濃度-時(shí)間曲線；

圖4 JH1012han濃度-時(shí)間曲線；

圖5 J11han濃度-時(shí)間曲線；

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明提供的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

本實(shí)施例使用安捷倫公司生產(chǎn)的型號(hào)為(Agilent)1290-6430.的液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀；Thermo公司生產(chǎn)的2.1mm×150mm×5μm Accucore XL C18色譜柱；安捷倫生產(chǎn)的2.1mm×100mm×1.8μm ZORBAX SB-Aq色譜柱；Mettle-toledo公司生產(chǎn)的型號(hào)為EL204-IC的電子天平；sigma公司生產(chǎn)的型號(hào)為1-14的小型離心機(jī)；90014-S-B手套；eppendorf、smartpipette型移液槍；江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠生產(chǎn)的型號(hào)為CJJ-931的數(shù)顯四聯(lián)恒溫磁力攪拌器；上海思博明生產(chǎn)的Vortex-Genie-2型小型漩渦振蕩器；昆山生產(chǎn)的5200E單頻超聲波清洗器。固相微萃取攪拌棒采用青島貞正分析儀器有限公司生產(chǎn)的ZZ-SBSE-04-1型PES涂層固相微萃取攪拌棒。

選用兩種花生品種，分別為J11、JH1012，利用兩種不同的基因改造方法，對(duì)花生進(jìn)行基因改造，分別編號(hào)為J11han、JH1012han、JH1012ck，每個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)樣品。通過(guò)本發(fā)明檢測(cè)J11han，JH1012han，JH1012ck實(shí)驗(yàn)樣品中的茉莉酸含量。

1.1樣品制備及分析方案：

第一步：取1g花生葉(每份樣品做3份平行實(shí)驗(yàn))，加入內(nèi)標(biāo)200ngDHJA(用10ul注射器加入2ul的100ug/ml內(nèi)標(biāo)溶液)。

第二步：用液氮研磨。

第三步：研磨液用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡過(guò)夜，4℃、13000rpm/min離心10分鐘，用移液槍移取2.5mL上清液于15ml離心管中。

第四步：殘?jiān)?mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡過(guò)夜，4℃、13000rpm/min離心10min，用移液槍移取2.5mL上清液于10ml離心管中，此過(guò)程重復(fù)1次。

第五步：合并第三、四步3次浸提的上清液，4℃條件下氮?dú)獯蹈伞?/p>

第六步：定溶于1ml 80％甲醇中。

1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品制備、分析方案：

第一步：取1g花生葉(每份樣品做3份平行實(shí)驗(yàn))，加入內(nèi)標(biāo)200ngDHJA(用10ul注射器加入2ul的100ug/ml內(nèi)標(biāo)溶液)，用10ul注射器分別加入不同量的JA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，得到不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品：

5ng/g標(biāo)準(zhǔn)樣品(加入1ug/ml，5ul)

10ng/g標(biāo)準(zhǔn)樣品(加入1ug/ml，10ul)

20ng/g標(biāo)準(zhǔn)樣品(加入10ug/ml，2ul)

50ng/g標(biāo)準(zhǔn)樣品(加入10ug/ml，5ul)

100ng/g標(biāo)準(zhǔn)樣品(加入10ug/ml，10ul)

200ng/g標(biāo)準(zhǔn)樣品(加入100ug/ml，2ul)

500ng/g標(biāo)準(zhǔn)樣品(加入100ug/ml，5ul)

1000ng/g標(biāo)準(zhǔn)樣品(加入100ug/ml，10ul)

第二步：液氮研磨。

第三步：用3mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡過(guò)夜，4℃、13000rpm/min離心10分鐘，用移液槍移取2.5mL上清液于15ml離心管中。

第四步：殘?jiān)?mL冷80％甲醇于4℃冰箱中浸泡過(guò)夜，4℃、13000rpm/min離心10min，用移液槍移取2.5mL上清液放入10ml離心管中，此過(guò)程重復(fù)1次。

第五步：合并第三、四步3次浸提的上清液，4℃條件下氮?dú)獯蹈伞?/p>

第六步：定溶于1ml 80％甲醇中。

1.3制備流動(dòng)相

95％乙腈+5％水：

第一步：用500ml量筒取475ml乙腈于流動(dòng)相瓶中。

第二步：用100ml量筒取25ml娃哈哈純凈水于流動(dòng)相瓶中，充分震蕩后放入超聲波清洗器中超聲20min。

95％水+5％乙腈

第一步：用500ml量筒取475ml娃哈哈純凈水于流動(dòng)相瓶中。

第二步：用100ml量筒取25ml乙腈于流動(dòng)相瓶中，充分震蕩后再用超聲波清洗器中清洗二十分鐘。

1‰甲酸+5％乙腈+水：

用移液槍取0.5mL甲酸，用100ml量筒取25ml乙腈，用500ml量筒取474.5ml娃哈哈純凈水于流動(dòng)相瓶中，充分震蕩后再用超聲波清洗器中清洗二十分鐘。

制備完成流動(dòng)相后將量筒晾干，倒置，防止污染。

1.4制備茉莉酸和/或二氫茉莉酸甲醇溶液

制備1000ppm二氫茉莉酸甲醇溶液

第一步：用電子天平稱取10μgH2JA于100mL量筒中。

第二步：用甲醇定容，小型漩渦振蕩器充分震蕩后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中。

第三步：封口放于-20℃保存。

制備100ppm二氫茉莉酸甲醇溶液

第一步：用移液槍移取1000ppm二氫茉莉酸溶液于20ml樣瓶中(分9次，每次1ml甲醇等比例稀釋)，用振蕩器混勻。

第二步：用移液槍移取1ml裝入2ml樣瓶中小型漩渦振蕩器充分震蕩后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中。

第三步：封口放于-20℃保存。

制備10ppm茉莉酸、二氫茉莉酸甲醇溶液

方法同上，封口膜封口，-20℃保存。

制備1ppm二氫茉莉酸甲醇溶液

方法同上，封口膜封口，-20℃保存。

制備500ppb茉莉酸、二氫茉莉酸甲醇溶液混標(biāo)

方法同上，封口膜封口，-20℃保存。

1.5樣品的萃取與富集

采用固相微萃取攪拌棒進(jìn)行萃取富集。方法如下：

第一步：加2mL超純水于5mL樣瓶中。

第二步：將樣品轉(zhuǎn)移到50mL樣瓶中。

第三步：加入固相微萃取攪拌棒攪拌1.5h。

第四步：在2mL樣瓶中加入內(nèi)套管，并加入250μL丙酮，將第四步攪拌棒放入，封口。

第五步：放入超聲儀中超聲20min，進(jìn)行解吸，解吸液待測(cè)

1.6質(zhì)譜條件的建立

試驗(yàn)使用二氫茉莉酸作為茉莉酸的內(nèi)標(biāo)物。分別使用10ppm茉莉酸和二氫茉莉酸，再分別于正、負(fù)電離模式下，分別確定茉莉酸和二氫茉莉酸的母離子分子量，并選擇定量子離子。

1.7色譜條件的建立

比較流動(dòng)相系統(tǒng)，選出上述配置的流動(dòng)相中能使茉莉酸、二氫茉莉酸出峰效果最好的流動(dòng)相系統(tǒng)作為分析所用的色譜條件。

1.8樣品的定性檢測(cè)

用1ppm茉莉酸和1ppm二氫茉莉酸進(jìn)行碎片離子掃描，確定它們的特征子離子。在已經(jīng)確定的離子模式(負(fù)離子模式)條件下，利用三重四級(jí)桿獲取茉莉酸母離子209m/z的色譜圖，確定分離效果。

然后加入標(biāo)準(zhǔn)品50ng，高效液相色譜檢測(cè)，確定保留時(shí)間，同時(shí)用質(zhì)譜得到特征子離子。

1.9定量及回收率測(cè)定

定量使用內(nèi)標(biāo)法，以DHJA作為內(nèi)標(biāo)物，每份樣品加入內(nèi)標(biāo)200ngDHJA，用濃度分別為：5ppb(ng/g)、10ppb、20ppb、50ppb、100ppb、200ppb、500ppb、1000ppb的茉莉酸甲醇溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

分別設(shè)定5ppb、10ppb、100ppb三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品添加水平，進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)，計(jì)算回收率。

本實(shí)驗(yàn)添加二氫茉莉酸為內(nèi)標(biāo)，為排除花生葉中原本存在二氫茉莉酸形成干擾，設(shè)置六個(gè)空白花生葉樣品進(jìn)行HPLC-MS檢測(cè)。

2.0實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析

2.0.1多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)參數(shù)優(yōu)化

采用Optimizer軟件自動(dòng)優(yōu)化MS檢測(cè)條件，結(jié)果見(jiàn)表1：

表1 MRM檢測(cè)參數(shù)設(shè)置

本實(shí)施例檢測(cè)使用超高壓液相色譜柱(Agilent ZORBAX SBAQ C18，2.1mm×100mm×1.8μm)分離，可將茉莉酸與相鄰干擾峰完全分離。本實(shí)施例質(zhì)譜用負(fù)離子模式對(duì)茉莉酸(JA)和二氫茉莉酸(DHJA)檢測(cè)，靈敏度較高，而且干擾峰少。

流動(dòng)相的選擇

由于茉莉酸和二氫茉莉酸為酸性化合物，采用C18色譜柱進(jìn)行分離，通常在流動(dòng)相加入0.1％甲酸，用于增加目標(biāo)組分在色譜柱固定相上的保留時(shí)間，從而改善分離度。

采用超高壓液相色譜柱(Agilent ZORBAX SBAQ C18 2.1mm×100mm×1.8μm)，對(duì)比流動(dòng)相體系(a)A：水相(含0.1％甲酸和5％乙腈)，B：乙腈相(含5％水)和流動(dòng)相體系(b)A：水相(含5％乙腈)，B：乙腈相(含5％水)的分離效果，如圖1所示。結(jié)果表明：(1)采用流動(dòng)相體系(a)時(shí)，JA和DHJA的保留時(shí)間均較流動(dòng)相體系(b)有所增加，然而采用流動(dòng)相體系(b)時(shí)，JA和DHJA也可以達(dá)到基線分離；(2)采用流動(dòng)相體系(a)時(shí)，JA和DHJA的靈敏度有所下降，原因?yàn)楫?dāng)MS采用負(fù)離子檢測(cè)模式時(shí)，流動(dòng)相體系(a)中的甲酸會(huì)降低JA和DHJA的離子化效率，導(dǎo)致靈敏度下降。綜合考慮，本檢測(cè)采用不加甲酸的流動(dòng)相體系(b)。

從圖1中得出流動(dòng)相梯度最佳為：0～8分鐘，A:B比值變化情況為4:1～1:9；8～13分鐘，A:B＝1:9；13～14分鐘，A:B比值變化情況為1:9～4:1；14～20分鐘，A:B＝4:1。

2.0.2標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

利用八種不同濃度加內(nèi)標(biāo)的茉莉酸樣品，以JA濃度為橫坐標(biāo)，JA峰面積與DHJA峰面積平均值之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，R²達(dá)到0.9988。

本發(fā)明方法評(píng)價(jià)結(jié)果，以信噪比(S/N)為3確定茉莉酸的檢出限(LOD)如表2所示：

表2 方法評(píng)價(jià)結(jié)果

數(shù)據(jù)明顯呈線性相關(guān)，可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)花生葉樣品中的茉莉酸進(jìn)行定量。

2.0.3加標(biāo)回收率

設(shè)置5ppb、10ppb、100ppb三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品添加水平，花生葉內(nèi)源茉莉酸的平均添加回收率在83.26％～92.57％，表明本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的可靠性較高。

2.0.4實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

空白樣品檢測(cè)結(jié)果

對(duì)六個(gè)空白樣品進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果，其MRM色譜圖顯示出空白樣品中均不含有二氫茉莉酸，此方法適合用于花生葉的檢測(cè)，并且大大降低了檢測(cè)成本。

本實(shí)施例樣品檢測(cè)結(jié)果

分別對(duì)JH1012ck，JH1012han，J11han三種類型共48個(gè)樣品編號(hào)進(jìn)樣檢測(cè)，測(cè)得每個(gè)樣品中茉莉酸的實(shí)際濃度，并計(jì)算平均濃度，結(jié)果見(jiàn)表3：

表3 實(shí)際花生葉中茉莉酸檢測(cè)結(jié)果

圖3是JH1012ck濃度-時(shí)間曲線圖，由圖3可知經(jīng)過(guò)此種基因處理方法處理花生葉---JH1012ck中的茉莉酸含量，從12小時(shí)開始遞減，36小時(shí)達(dá)到最低濃度，之后又逐漸升高。圖4是JH1012han濃度-時(shí)間曲線圖，由圖4可知經(jīng)過(guò)此種基因處理方法處理花生葉—JH1012han中茉莉酸含量，隨處理時(shí)間變化沒(méi)有明顯規(guī)律，但在處理12小時(shí)時(shí)達(dá)到最低濃度，幾乎為零，之后逐漸升高。圖5是J11han濃度-時(shí)間曲線，由圖5可知經(jīng)過(guò)此種基因處理方法處理花生葉—J11han中茉莉酸含量，先隨處理時(shí)間的增長(zhǎng)而減少，在處理12小時(shí)時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，幾乎為零，之后逐漸升高。對(duì)比以上兩種處理的樣品可知，JH1012han和J11han花生葉中茉莉酸含量在處理12小時(shí)左右會(huì)達(dá)到最低值。

表4所示，為本實(shí)施例1、2、3以及對(duì)照組的數(shù)據(jù)對(duì)比數(shù)據(jù)。其本實(shí)施例1、2、3的不同之處僅僅是樣品處理中的固相微萃取攪拌棒涂層種類的不同，其余步驟及試劑均相同。而對(duì)照組沒(méi)有選擇萃取的過(guò)程。以上的最低檢出限經(jīng)過(guò)測(cè)量最高為4，最低為0.5。而對(duì)照組的最低檢出限是40，與實(shí)施例對(duì)比明顯。

表4 最低檢出限數(shù)據(jù)比較

通過(guò)對(duì)上述花生葉片中的茉莉酸含量，科研人員可進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及結(jié)果推算，給科研人員帶來(lái)極大的方便。并且，采用上述檢測(cè)方法，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，檢測(cè)方法科學(xué)合理。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。