本發(fā)明涉及一種測定分子間相互作用的方法，具體是一種基于表面電荷變化測定分子間相互作用的方法。

背景技術(shù)：

與生物分子相關(guān)的相互作用，其中包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與小分子(DNA)、以及蛋白質(zhì)與納米顆粒之間的相互作用對具有生命活動的研究具有重要的意義。目前常用的定量測定蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與小分子、以及蛋白質(zhì)與納米顆粒之間相互作用的方法主要有親和毛細(xì)管電泳法、表面等離子體共振法、熒光光譜法、以及石英晶體微天平法等。如上的方法需要對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行標(biāo)記、固定，而對蛋白質(zhì)分子進(jìn)行標(biāo)記或者固定會影響蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)，從而對蛋白質(zhì)分子固有的活性造成影響，同時如上的方法也存在測定時間長等問題。流動電勢法作為一種表征表面電荷的手段，研究人員利用流動電勢法對蛋白質(zhì)在表面的吸附動力學(xué)以及吸附后表面電荷的變化做了大量的研究，在′差分流動電勢測量在蛋白質(zhì)吸附及非標(biāo)記定量分析中的應(yīng)用′以及′微通道流動電勢差分測量技術(shù)的優(yōu)化、應(yīng)用及微型芯片電泳熒光檢測器的制作′中已經(jīng)對流動電勢法作為一種表征表面電荷以及作為一種非標(biāo)記的手段測定蛋白質(zhì)分子在表面的吸附做了詳盡的描述，但是利用流動電勢法快速、非標(biāo)記、在自由溶液中研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與小分子、以及蛋白質(zhì)與納米顆粒之間的相互作用的工作還未有報道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服上述不足，提供一種快速、非標(biāo)記、自由溶液中測定與生物分子相關(guān)的相互作用的方法。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種基于表面電荷變化測定分子間相互作用的方法，通過流動電勢法測定和生物分子相關(guān)的相互作用，根據(jù)生物分子與對應(yīng)分子在表面吸附作用的變化對相互作用進(jìn)行定量表征，其中通過流動電勢法測定微通道表面電荷的變化是基于微通道表面雙電層在壓力作用下產(chǎn)生的滑動層電勢的變化，流動電勢和zeta電勢之間可以通過H-S方程進(jìn)行計(jì)算。含有蛋白質(zhì)分子的緩沖溶液通過微通道時，蛋白質(zhì)分子會在微通道表面發(fā)生吸附作用，而初始階段蛋白質(zhì)分子在微通道表面的吸附作用和蛋白質(zhì)分子的大小，蛋白質(zhì)分子的表面電荷相關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用時，混合溶液中蛋白質(zhì)分子的大小以及蛋白質(zhì)分子的電荷均會發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)在表面的吸附作用發(fā)生變化，最明顯的體現(xiàn)在初始階段表面電荷的改變速率上，同樣地，也適用于蛋白質(zhì)與小分子以及蛋白質(zhì)與納米顆粒之間相互作用測定機(jī)理的解釋。

該方法包括混合法和順序吸附法，其中混合法包括以下步驟：

步驟1、用緩沖沖洗空白微通道，使微通道表面電荷達(dá)到平衡；

步驟2、向步驟1中的微通道中通入A分子的緩沖溶液，并測定A分子在空白微通道表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到A分子與空白微通道作用的初始速率值；

步驟3、沖洗步驟2中的微通道，使微通道表面的電荷恢復(fù)；

步驟4、向步驟3中的微通道中通入B分子的緩沖溶液，測定B分子在空白微通道表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到B分子與空白微通道作用的初始速率值；

步驟5、沖洗步驟4中的微通道，接著用緩沖沖洗微通道，使微通道表面電荷達(dá)到平衡；

步驟6、向步驟5中電荷達(dá)到平衡后的微通道中通入A分子和B分子的混合溶液，得到混合溶液與空白微通道作用的初始速率值；

步驟7、根據(jù)步驟2、步驟4和步驟6得到的數(shù)據(jù)計(jì)算出A分子和B分子之間相互作用的常數(shù)。

順序吸附法包括以下步驟：

步驟1、用緩沖沖洗空白微通道，使微通道表面的電荷達(dá)到平衡；

步驟2、向步驟1中的微通道中通入A分子的緩沖溶液，直至A分子在微通道表面的吸附達(dá)到平衡，并測定A分子在空白微通道表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化；

步驟3、用空白緩沖沖洗步驟2中吸附穩(wěn)定的A分子，得到吸附有A分子的微通道表面的流動電勢的平均值；

步驟4、向步驟3中的微通道中通入B分子的緩沖溶液，測定A分子和B分子相互作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，以及作用達(dá)到平衡后得到微通道表面的流動電勢值；

步驟5、根據(jù)步驟2、步驟3和步驟4得到的數(shù)據(jù)計(jì)算出A分子和B分子之間相互作用的常數(shù)。

進(jìn)一步，所述A分子為蛋白質(zhì)，B分子為蛋白質(zhì)、小分子、聚合物或納米顆粒。

優(yōu)選的，所述緩沖為磷酸緩沖，磷酸緩沖時間為20s-100s。

進(jìn)一步，沖洗微通道的步驟包括用1M NaOH沖洗毛細(xì)管120s-240s，然后再用超純水沖洗60s-120s。

進(jìn)一步，所述微通道包括毛細(xì)管，微流控芯片通道以及其他微納米尺度的通道。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

1、本方法能夠在非標(biāo)記、自由溶液中進(jìn)行測定，不會對蛋白質(zhì)分子固有的活性造成影響；

2、本方法能夠測定蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用、蛋白質(zhì)與小分子(包括藥物分子、DNA)之間的相互作用、蛋白質(zhì)與聚合物、蛋白質(zhì)與納米材料之間的相互作用，測定范圍廣；

3、本方法可應(yīng)用于藥物篩選、生命相關(guān)蛋白質(zhì)之間相互作用的機(jī)理的解釋、納米材料改性的表征、納米材料毒性的解釋、蛋白質(zhì)分子的定量等。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的方法流程圖；

圖2為實(shí)施例1混合法測定蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的數(shù)值圖；

圖3為實(shí)施例2混合法測定蛋白質(zhì)與小分子(DNA、其他小分子) 之間的相互作用的數(shù)值圖；

圖4為實(shí)施例3混合法測定蛋白質(zhì)與納米顆粒之間的相互作用的數(shù)值圖；

圖5為實(shí)施例4混合法測定蛋白質(zhì)與其對應(yīng)的抑制劑之間的相互作用的數(shù)值圖；

圖6為實(shí)施例5順序吸附法測定蛋白質(zhì)與適體之間的相互作用的數(shù)值圖；

圖7為實(shí)施例6順序吸附法測定蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用的數(shù)值圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。

實(shí)施例1

首先利用1.25mM的磷酸緩沖(pH 7.2)沖洗空白毛細(xì)管120s，以使毛細(xì)管表面的電荷達(dá)到平衡；接著向毛細(xì)管中通入0.96μM的核糖核苷酸酶A的緩沖溶液，測定核糖核苷酸酶A在空白毛細(xì)管表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到核糖核苷酸酶A與空白毛細(xì)管作用的初始速率值；用1M NaOH、超純水分別沖洗毛細(xì)管240s、120s，使毛細(xì)管表面的電荷恢復(fù)，接著向毛細(xì)管中通入9.78μM牛血清白蛋白的緩沖溶液，測定牛血清白蛋白與空白毛細(xì)管作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到牛血清白蛋白與空白毛細(xì)管作用的初始速率值；進(jìn)行完如上的測定后，用1M NaOH、超純水分別沖洗毛細(xì)管120s、60s，使毛細(xì)管表面的電荷恢復(fù)，同時利用緩沖溶液沖洗毛細(xì)管120s，接著向毛細(xì)管中通入0.96μM的核糖核苷酸酶A和9.78μM牛血清白蛋白的混合溶液，測定混合溶液與空白毛細(xì)管表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到混合溶液與空白毛細(xì)管作用的初始速率值，通過比較得出核糖核苷酸酶A與牛血清白蛋白之間的相互作用的強(qiáng)弱，同時通過計(jì)算得到核糖核苷酸酶A和牛血清白蛋白之間相互作用的常數(shù)為1.2×10⁶mol^-1(pH＝7.0)

實(shí)施例2

首先利用緩沖沖洗微流控芯片通道20s以使表面電荷達(dá)到穩(wěn)定；接著向微流控芯片通道中通入3.0μM的溶菌酶的緩沖溶液，測定溶菌酶在空白微流控芯片通道表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到該濃度的溶菌酶的初始流動電勢的變化速率；用1M NaOH、超純水分別沖洗微流控芯片通道240s、120s，使微流控芯片通道表面的電荷恢復(fù)，接著向微流控芯片通道中通入6.0μM單寧酸的緩沖溶液，測定單寧酸與空白微流控芯片通道作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到該濃度的單寧酸的初始流動電勢的變化速率；進(jìn)行完如上的測定后，用1M NaOH、超純水分別沖洗微流控芯片通道120s、60s，使微流控芯片通道表面的電荷恢復(fù)，同時利用緩沖溶液沖洗微流控芯片通道120s，接著向微流控芯片通道中通入3.0μM的溶菌酶和6.0μM單寧酸的混合溶液，測定混合溶液與空白微流控芯片通道表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到混合溶液的初始流動電勢的變化速率，根據(jù)流動電勢的變化速率計(jì)算得出單寧酸與溶菌酶之間的相互作用常數(shù)值為3.2×10⁵mol^-1(pH＝7.0)。

實(shí)施例3

首先利用緩沖沖洗毛細(xì)管20s以使表面電荷達(dá)到穩(wěn)定；接著向毛細(xì)管中通入濃度為2.0μM的溶菌酶的緩沖溶液，測定溶菌酶在空白毛細(xì)管表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到該濃度的溶菌酶的初始流動電勢的變化速率；用1M NaOH、超純水分別沖洗毛細(xì)管240s、120s，使毛細(xì)管表面的電荷恢復(fù)，接著向毛細(xì)管中通入4.0μg/mL的GO(氧化石墨烯)的緩沖溶液，測定GO在空白毛細(xì)管表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到該濃度的GO的初始流動電勢的變化速率；進(jìn)行完如上的測定后，用1M NaOH、超純水分別沖洗毛細(xì)管120s、60s，使毛細(xì)管表面的電荷恢復(fù)，同時利用緩沖溶液沖洗毛細(xì)管120s，接著向毛細(xì)管中通入2.0μM的溶菌酶和4.0μg/mL的GO的混合溶液，測定混合溶液與空白毛細(xì)管表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，得到混合溶液的初始流動電勢的變化速率，根據(jù)流動電勢的變化速率得出GO與LYZ之間的相互作用，pH＝7.0條件下，電導(dǎo)率為220μs/cm時，所得相互作用的解離常數(shù)為5.1×10^-3g/L。

實(shí)施例4

首先利用緩沖沖洗毛細(xì)管100s以使空白毛細(xì)管表面電荷達(dá)到穩(wěn)定(pH＝5.0的磷酸緩沖)；接著向空白毛細(xì)管內(nèi)通入10.0μM的酒石酸鈉緩沖溶液，測定酒石酸鈉在空白毛細(xì)管表面的作用，得到該濃度的酒石酸鈉與毛細(xì)管作用的初始流動電勢的變化速率；利用1MNaOH、超純水分別沖洗毛細(xì)管，使表面電荷恢復(fù)，向毛細(xì)管中通入緩沖沖洗毛細(xì)管100s，以使空白毛細(xì)管表面的電荷達(dá)到穩(wěn)定，接著向毛細(xì)管中通入100.0μg/mL的酸性磷酸酶，測定酸性磷酸酶在毛細(xì)管表面吸附產(chǎn)生的流動電勢的變化速率值，得到該濃度的酸性磷酸酶的初始流動電勢的變化速率；利用1M NaOH、超純水沖洗毛細(xì)管，以使毛細(xì)管表面的電荷恢復(fù)，用緩沖沖洗毛細(xì)管表面100s，以使表面電荷達(dá)到穩(wěn)定向毛細(xì)管中通入10.0μM的酒石酸鈉和100.0μg/mL的酸性磷酸酶的混合溶液，測定混合溶液在毛細(xì)管表面的吸附作用，得到混合溶液的初始流動電勢的變化速率，最后通過流動電勢的變化速率得出酒石酸鈉與酸性磷酸酶之間的相互作用。

實(shí)施例5

首先將將凝血酶的適配體20.0nM(TBA29，5’-NH₂(CH₂)6-AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3’)通過5’端的氨基固定到毛細(xì)管的表面，測定得到毛細(xì)管表面的平均流動電勢值，接著利用200.0nM的凝血酶與毛細(xì)管表面的適配體作用，得到此時毛細(xì)管表面的流動電勢值，計(jì)算凝血酶與其適配體之間的相互作用，得到凝血酶與對應(yīng)的適配體之間的結(jié)合常數(shù)為1.10×10⁶mol^-1(pH＝7.0)。

實(shí)施例6

首先利用緩沖沖洗毛細(xì)管200s以使表面電荷達(dá)到穩(wěn)定；接著向毛細(xì)管中通入10.0μg/mL球蛋白(lgG)的緩沖溶液，測定lgG在空白毛細(xì)管表面作用流動電勢隨時間的變化，直至作用達(dá)到平衡，接著利用空白緩沖沖洗吸附穩(wěn)定的lgG，同時測定此時毛細(xì)管表面流動電勢值隨時間的變化，得到吸附有l(wèi)gG的毛細(xì)管表面的流動電勢的平均值，向吸附有l(wèi)gG的毛細(xì)管中通入5.0μg/mL protein A(蛋白A)的緩沖溶液測定proteinA與lgG相互作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，作用達(dá)到平衡后得到毛細(xì)管表面的流動電勢值，如圖7(a)所示；用1MNaOH、超純水分別沖洗毛細(xì)管240s、120s，使毛細(xì)管表面的電荷恢復(fù)，并用緩沖沖洗毛細(xì)管，使毛細(xì)管表面的電荷平衡，接著向毛細(xì)管中通入5.0μg/mL protein A的緩沖溶液，測定protein A在空白毛細(xì)管表面作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，直至作用達(dá)到平衡，接著利用空白緩沖沖洗吸附穩(wěn)定的protein A，同時測定此時毛細(xì)管表面流動電勢值隨時間的變化，得到吸附有protein A的毛細(xì)管表面的流動電勢值，向吸附有protein A的毛細(xì)管中通入10.0μg/mL lgG的緩沖溶液，測定lgG與protein A相互作用產(chǎn)生的流動電勢隨時間的變化，作用達(dá)到平衡后，得到此時的流動電勢的平均值，用以表征相互作用的強(qiáng)弱，如圖7(b)所示。根據(jù)不同的順序可以得出作用順序?qū)Φ鞍踪|(zhì)之間相互作用的影響。同時測定出protein A和lgG的相互作用常數(shù)為1.2×10⁷mol^-1(pH＝7.0)。

最后應(yīng)說明的是：顯然，上述實(shí)施例僅是為清楚地說明本申請所作的舉例，而并非對實(shí)施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本申請的保護(hù)范圍之中。