本發(fā)明涉及藥品的檢測，具體涉及同時測定地榆或地榆類制劑中沒食子酸和地榆皂苷i含量的hplc波長切換法。

背景技術(shù)：

地榆及地榆類制劑中的地榆是薔薇科植物地榆sanguisorbaofficinalisl.或長葉地榆sanguisorbaofficinalisl.var.longifolia(bert.)yüetli的干燥根，具有涼血止血，解毒斂瘡的功效[1]。地榆中主要含有多酚類、皂苷類和黃酮等化學(xué)成分，多酚類成分主要有沒食子酸、(+)-兒茶素、鞣花酸、沒食子兒茶素等[2-4]。地榆具有升高白細(xì)胞數(shù)量的作用，臨床上常作為化療期間的輔助用藥，治療化療引起的白細(xì)胞減少癥[5-7]，也可用于治療精神病藥所致的白細(xì)胞減少癥[8]、干擾素治療乙型肝炎所致的白細(xì)胞減少癥[9,10]。

在2015版《中國藥典》收載的地榆藥材以及收載于《國家中成藥標(biāo)準(zhǔn)匯編》的地榆升白片制劑的含量測定項(xiàng)下僅測定了沒食子酸的含量，其含量測定的指標(biāo)單一，專屬性差。

地榆皂苷i是地榆藥材中的一個主要化學(xué)成分，現(xiàn)有資料表明，地榆皂苷i具有一定的造血促進(jìn)作用，可明顯升高紅細(xì)胞和血紅蛋白，治療或預(yù)防各種貧血，尤其是骨髓造血功能低下或衰竭引起的貧血[11-13]，對治療白細(xì)胞減少癥具有一定的輔助效果。譚鵬等[14]采用hplc-elsd法單獨(dú)測定地榆升白片中地榆皂苷i的含量，該文獻(xiàn)單一測定地榆皂苷i成分不能全面控制地榆升白片。

因此，實(shí)際中有必要對地榆或地榆類制劑中沒食子酸和地榆皂苷i的含量同時進(jìn)行監(jiān)控，以更真實(shí)地反映藥品的內(nèi)在質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[s].二部.北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010:117.

[2]曹愛民,張東方,沙明,等.地榆中皂苷類化合物分離、鑒定及其含量測定[j].中草藥,2003,34(5):397.

[3]nonakag,tanakat,nitam,etal.adimerichydrolyzabletannin,sanguiinh-6fromsanguisorbaofficinalisl.[j].chempharmbull,1982,30(6):2255.

[4]nonakag,tanakat,nishiokai.tanninsandrelatedcompounds.part3.anewphenolicacid,sanguisorbicaciddilactone,andthreenewellagitannins,saguiinsh-1,h-2,andh-3fromsanguisorbaofficinalis[j].chemsocpekintrans,1982,4:1067.

[5]劉揚(yáng)帆.地榆升白片預(yù)防放療性白細(xì)胞減少癥的臨床觀察[j]，中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用.2011，5(10)：88－89.

[6]熊玲凡,馮覺平.地榆升白片緩解結(jié)直腸癌化療中白細(xì)胞減少的臨床研究[j].湖北中醫(yī)雜志,2015,37(11):3-4.

[7]張晶晶.地榆升白片治療婦科腫瘤化療中白細(xì)胞減少癥臨床分析[j].中國實(shí)用醫(yī)藥,2014(31):179-180.

[8]顧冬云.地榆升白片對抗精神病藥所致白細(xì)胞減少療效觀察[j].中國現(xiàn)代醫(yī)生.2012，50(36)：92－93.

[9]董紅筠，宓余強(qiáng)，王敬，等.地榆升白片預(yù)防性治療干擾素所致白細(xì)胞減少的臨床觀察[j].中成藥，2010，32(2)：182－183.

[10]王大光,余萬祥,郭宗云.地榆升白片治療干擾素誘發(fā)白細(xì)胞減少癥臨床觀察[j].山西中醫(yī),2014,30(12):33-33.

[11]高小平,吳建明,鄒文俊,等.地榆促造血作用的有效部位篩選[j].中國天然藥物,2006,4(2):137.

[12]成都地奧制藥集團(tuán)有限公司.中藥地榆及其提取物在制備升高紅細(xì)胞和血紅蛋白藥物中的應(yīng)用：中國.101119740a[p].2008-02-06.

[13]鄒文俊,劉芳,吳建明,等.地榆總皂苷促進(jìn)血細(xì)胞增殖效應(yīng)研究[j].中草藥.2012,5(43):929-933.

[14]譚鵬,蒲旭峰,文永盛,等.hplc-elsd法測定地榆升白片中地榆皂苷i的含量[j].中藥與臨床.2013,4(1):21-23.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種同時測定地榆或地榆類制劑中沒食子酸和地榆皂苷i含量的hplc波長切換法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)沒食子酸和地榆皂苷i標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：

a、對照品溶液的制備：

取沒食子酸和地榆皂苷i對照品，混合，加甲醇配制成混合對照品溶液；

b、對照品溶液的測定：

配制系列濃度的混合對照品溶液，分別注入高效液相色譜儀，梯度洗脫，采用切換波長法檢測，測定各色譜峰峰面積，得到?jīng)]食子酸和地榆皂苷i的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

色譜條件如下：

色譜柱：c18色譜柱；

流動相：流動相a為乙腈，流動相b為0.05％磷酸水溶液；

梯度洗脫：0～12min，5％a；12～14min，5％～36％a；14～28min，36％～45％a；28～30min，45％～5％a；

波長切換：0～26min，在280nm波長下檢測沒食子酸；26～30min，在210nm波長下檢測地榆皂苷i；

流速：1ml/min；

(2)待測樣品中沒食子酸和地榆皂苷i的含量測定：

c、供試品溶液的制備：

取待測樣品，加甲醇提取，過濾得供試品溶液；

d、供試品溶液的測定：

取供試品溶液，注入高效液相色譜儀，以步驟b相同的色譜條件檢測，根據(jù)步驟(1)的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測樣品中沒食子酸和地榆皂苷i的含量。

進(jìn)一步地，所述色譜條件的柱溫為30℃。

進(jìn)一步地，所述c18色譜柱為inertsilods-3色譜柱，

進(jìn)一步地，所述色譜柱的規(guī)格為250mm×4.6mm，5μm。

進(jìn)一步地，步驟c中，所述甲醇提取是50％甲醇提取。

進(jìn)一步地，步驟c中，所述提取是回流提取。

進(jìn)一步地，步驟c中，所述回流提取的時間為1小時。

進(jìn)一步地，其特征在于：步驟c中，所述甲醇與待測樣品的體積質(zhì)量比為25ml：1.5g。

進(jìn)一步地，所述地榆類制劑是以地榆原粉為原料，加上藥學(xué)上可接受的輔料制備得到的制劑，優(yōu)選為片劑。

進(jìn)一步地，所述地榆類制劑為地榆升白片。

本發(fā)明成功建立了地榆或地榆類制劑中沒食子酸和地榆皂苷i含量的hplc波長切換法，可以簡便、快速、準(zhǔn)確地同時測定沒食子酸和地榆皂苷i的含量，可以更全面地監(jiān)控地榆或地榆類制劑中的活性成分含量，更真實(shí)地反映藥品的內(nèi)在質(zhì)量，為地榆或地榆類制劑的質(zhì)量控制提供了有效保障。

顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。

以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1a.沒食子酸和和地榆皂苷i對照品色譜圖；b.地榆藥材色譜圖；c.地榆升白片制劑色譜圖；1.沒食子酸；2.地榆皂苷i。

圖2為地榆皂苷idad光譜圖。

圖3為地榆皂苷i紫外掃描圖。

圖4為沒食子酸對照品光譜掃描圖；

圖5為地榆對照品3d光譜圖。

圖61.沒食子酸；2.地榆皂苷i。

圖7a.沒食子酸和和地榆皂苷i對照品色譜圖；b.地榆藥材色譜圖；c.地榆升白片制劑色譜圖；1.沒食子酸；2.地榆皂苷i。

圖8為不同流動相系統(tǒng)(ph值)考察hplc圖。

圖9為不同柱溫考察hplc圖。

圖10為不同流速考察hplc圖。

圖11為不同色譜柱考察hplc圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1本發(fā)明的hplc波長切換法及方法學(xué)驗(yàn)證

1儀器、試藥與藥品

ssiseries1500高效液相色譜儀(美國ssi公司)，紫外檢測器，cschromplus色譜工作站；色譜柱inertsilods-3(250mm×4.6mm，5μm，glscienceslnc.)；kq-600de型數(shù)控超聲波清洗器(40khz，600w)；十萬分之一電子天平(瑞士奧豪斯dv-215-cd)；優(yōu)普upt系列超純水器(成都優(yōu)普電子產(chǎn)品有限公司)，可調(diào)式移液器(美國thermo，finnpipette系列，20～200μl，100～1000μl)。

地榆(批號見表1，購于甘肅省天水市清水縣)；地榆升白片(批號見表2，由成都地奧制藥集團(tuán)有限公司提供)；沒食子酸對照品(批號：m-017-150129，購于成都瑞芬思生物科技有限公司)，地榆皂苷i(批號：d-022-150519，購于成都瑞芬思生物科技有限公司)。液相用乙腈為色譜級(fisher)，水為超純水，其余試劑為分析級。

表1地榆樣品信息

表2地榆升白片樣品信息

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

inertsilods-3色譜柱(250mm×4.6mm，5μm，glsciencesinc.)；流動相為乙腈-0.05％磷酸，梯度洗脫(0～12min，5％；12～14min，5％～36％；14～28min，36％～45％；28～30min，45％～5％)；波長切換(0～26min，在280nm波長下檢測沒食子酸；26～30min，在210nm波長下檢測地榆皂苷i)；流速1ml·min-1；柱溫30℃；進(jìn)樣量為20μl。在上述色譜條件下，沒食子酸和地榆皂苷i色譜峰的對稱因子均在0.95～1.05之間，理論塔板數(shù)均大于5000，與樣品中其他組分色譜峰達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，見圖1。

2.2對照品溶液的制備

分別精密稱取沒食子酸、地榆皂苷i對照品適量，置同一容量瓶中，50％甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品儲備溶液，分別為沒食子酸0.402mg·ml^-1、地榆皂苷i1.503mg·ml^-1。

2.3供試品溶液的制備

取地榆升白片制劑(三批混合取樣)20片，除去包衣，精密稱定，研細(xì)，取約1.5g，精密稱定，精密加入50％甲醇25ml，稱定重量，加熱回流1h，放冷至室溫，再稱定重量，補(bǔ)足重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。另取地榆藥材0.1g，精密稱定后同地榆升白片制備方法制備。

2.4含量測定

取6批地榆藥材及6批地榆升白片制劑，分別按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算，結(jié)果見表3、4。

表3地榆升白片含量測定結(jié)果

表4地榆含量測定結(jié)果

二、本發(fā)明方法的方法學(xué)驗(yàn)證

2.5線性關(guān)系，檢測限和定量限

分別精密吸取“2.2”項(xiàng)下制備的混合對照品貯備溶液適量，加50％甲醇稀釋，分別配制成含沒食子酸對照品4.02、20.10、36.18、52.26、68.34、84.42μg·ml^-1，含地榆皂苷i對照品15.03、75.15、135.27、195.39、255.51、315.63μg·ml^-1的混合對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積，以質(zhì)量濃度x(μg·ml^-1)為橫坐標(biāo)，峰面積值y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得混合對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和各對照品回歸方程。將對照品溶液用50％甲醇不斷進(jìn)行稀釋后分析，分別得到?jīng)]食子酸和地榆皂苷i的檢測限lod值(s/n≈3)和定量限loq值(s/n≈10)。目標(biāo)化合物的回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、線性范圍、檢測限和定量限。結(jié)果見表5，表明沒食子酸和地榆皂苷i在線性范圍內(nèi)濃度與峰面積線性關(guān)系良好，方法靈敏度高，測試樣品中沒食子酸和地榆皂苷i的含量遠(yuǎn)高于定量限。

表5地榆升白片中沒食子酸和地榆皂苷i的線性關(guān)系

2.6精密度試驗(yàn)

精密吸取同一對照品溶液20μl，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果顯示，沒食子酸和地榆皂苷i的峰面積rsd值分別為1.60％、0.96％，說明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取地榆及地榆升白片適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24、48h測定，計(jì)算峰面積，地榆中沒食子酸和地榆皂苷i的rsd分別為1.40％、0.76％。結(jié)果表明地榆供試品溶液在48h內(nèi)相對穩(wěn)定。同時對地榆升白片制得的供試品溶液于0、2、4、6、8、12、24、48h測定，計(jì)算峰面積，地榆中沒食子酸和地榆皂苷i的rsd分別為1.20％、0.88％。結(jié)果表明地榆升白片供試品溶液在48h內(nèi)相對穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

稱取同一批地榆升白片(批號：)6份，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果顯示沒食子酸和地榆皂苷i的rsd分別為0.18％、1.05％，表明方法重復(fù)性良好。另稱取同一批地榆藥材6份，按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果顯示沒食子酸和地榆皂苷i的rsd分別為0.90％、1.00％，表明方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的地榆升白片制劑(批號：)6份，各約0.7g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入沒食子酸溶液(濃度為0.402mg·ml^-1)1.55ml、地榆皂苷i溶液(濃度為1.503mg·ml^-1)0.88ml的對照品溶液，照“2.3”項(xiàng)下制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表6，沒食子酸平均回收率100.16％，rsd為1.72％；地榆皂苷i平均回收率為100.22％，rsd為1.20％。表明該方法的回收率良好。

表6地榆升白片制劑沒食子酸、地榆皂苷i的加樣回收率(n＝6)

另取已知含量的地榆藥材(批號：)6份，各約0.05g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入沒食子酸溶液(濃度為0.402mg·ml^-1)0.22ml、地榆皂苷i溶液(濃度為1.503mg·ml^-1)0.976ml的對照品溶液，照“2.3”項(xiàng)下制備，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表7，沒食子酸平均回收率100.08％，rsd為0.24％；地榆皂苷i平均回收率為100.59％，rsd為1.87％。表明該方法的回收率良好。

表7地榆藥材沒食子酸、地榆皂苷i的加樣回收率(n＝6)

實(shí)施例2本發(fā)明色譜條件的篩選

一、目標(biāo)化合物波長的選擇

精密吸取混合對照品溶液注入高效液相色譜儀中，采用二級陣列管檢測器在200-400nm內(nèi)進(jìn)行全波長掃描同時將地榆皂苷i在分光光度計(jì)上進(jìn)行紫外測定，結(jié)果顯示地榆皂苷i在210nm有最大吸收(見圖3、圖4)，而沒食子酸在210nm、280nm附近都有最大吸收(見圖2、圖4)，但在210nm下不利于雜質(zhì)峰的分離和含量的計(jì)算。故本研究采用切換波長法對供試品進(jìn)行檢測分析，首先選擇280nm避免雜質(zhì)峰，然后轉(zhuǎn)換為210nm檢測地榆皂苷。地榆對照品3d光譜圖見圖5。

二、流動相比例的選擇

選擇流動相系統(tǒng)為乙腈-0.05％磷酸水溶液體系。對梯度洗脫程序進(jìn)行了篩選，例如下述梯度洗脫程序：

0～12min，5％～10％；12～13min，10％～36％；13～27min，36％～45％；27～30min，45％～5％)；波長切換(0～24min，在280nm波長下檢測沒食子酸；24～30min，在210nm波長下檢測地榆皂苷i)

結(jié)果顯示，在該梯度洗脫程序下，樣品中沒食子酸和地榆皂苷i分離度達(dá)不到2015版《中國藥典》中高效液相色譜法含量測定項(xiàng)下對色譜峰分離度的要求(分離度＞1.5)，色譜圖見圖6。

最終經(jīng)色譜條件的篩選，按表8進(jìn)行梯度洗脫，對混合對照品溶液及供試品溶液進(jìn)行系統(tǒng)適用性考察，結(jié)果在該流動相條件下，沒食子酸和地榆皂苷i峰形對稱，理論塔板數(shù)高，分離度符合要求，色譜圖見圖7。

0～12min，5％；12～14min，5％～36％；14～28min，36％～45％；28～30min，45％～5％)；波長切換(0～26min，在280nm波長下檢測沒食子酸；26～30min，在210nm波長下檢測地榆皂苷i；流速1ml·min-1；柱溫30℃；進(jìn)樣量為20μl。

表8梯度洗脫色譜條件

三、流動相系統(tǒng)及ph值

為了使樣品中沒食子酸和地榆皂苷i的色譜峰達(dá)到較好的分離效果，對流動相系統(tǒng)及ph值進(jìn)行考察，分別考察了乙腈-0.05％磷酸水溶液、乙腈-0.1％磷酸水溶液和乙腈-0.2％磷酸水溶液。分析結(jié)果可知，隨著磷酸濃度的增加，分離度有所下降，在乙腈-0.05％磷酸水體系下，分離效果最佳。故選定流動相比例及ph值為乙腈-0.05％磷酸水。相關(guān)色譜圖見圖9。

四、柱溫考察

試驗(yàn)過程中共考察了25℃、30℃和35℃三個柱溫下供試品色譜峰情況，結(jié)果見圖9。在三個柱溫條件下，隨柱溫的升高，對照品色譜峰的保留時間逐漸縮短，分離效果在30℃時最佳。從縮短分析時間及良好分離度的角度考慮，選擇柱溫為30℃時為宜。

五、流速考察

試驗(yàn)過程中分別考察了流速為0.8ml·min^-1、1.0ml·min^-1和1.2ml·min^-1時，目標(biāo)化合物的分離效果，分析結(jié)果可知，在流速為1.0ml·min^-1時分離效果最佳，故選定分析流速為1.0ml·min^-1。色譜圖見圖10。

六、色譜柱考察

試驗(yàn)過程中分別對島津ods-3色譜柱(型號：1a7133271)、島津ods-3色譜柱(型號：1a7145030)和島津ods-3色譜柱(型號：1a7161645)三種不同品牌或不同型號色譜柱的分離效果進(jìn)行了比較。分析結(jié)果可知，以上三種色譜柱對樣品峰的保留時間沒有較大的影響，其中島津ods-3色譜柱(型號：1a7161645)的分離效果最佳。故本試驗(yàn)最終確定色譜柱為島津ods-3色譜柱(型號：1a7161645)。色譜圖見圖11。

六、色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

色譜柱：inertsilods-3色譜柱(250mm×4.6mm，5μm，glsciencesinc.)；流動相為乙腈-0.05％磷酸，梯度洗脫(見表8)；波長切換(0～26分鐘，在280nm波長下檢測沒食子酸；26～30分鐘，在210nm波長下檢測地榆皂苷i)；流速1ml·min^-1；柱溫30℃；進(jìn)樣量為20μl。

在上述色譜條件下，沒食子酸和地榆皂苷i色譜峰的分離度均大于1.5，拖尾因子均在0.95～1.05之間，分離度良好；靈敏度以信噪比s/n計(jì)算大于10；理論塔板數(shù)分別按沒食子酸峰和地榆皂苷i峰計(jì)算不低于5000。

綜上所述，本發(fā)明成功建立了地榆或地榆類制劑中沒食子酸和地榆皂苷i含量的hplc波長切換法，可以簡便、快速、準(zhǔn)確地同時測定沒食子酸和地榆皂苷i的含量，可以更全面地監(jiān)控地榆或地榆類制劑中的活性成分含量，更真實(shí)地反映藥品的內(nèi)在質(zhì)量，為地榆或地榆類制劑的質(zhì)量控制提供了有效保障。