本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)和體外診斷領(lǐng)域，具體涉及一種采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定人體血液或糞便排泄物中鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒。
背景技術(shù)：
：鈣衛(wèi)蛋白（Calprotectin）是一個(gè)分子量為36kD的鈣、鋅結(jié)合蛋白，由兩條分子量為14kD的重鏈和一個(gè)分子量為8kD的輕鏈以共價(jià)鍵連接的異三聚體組成，每條鏈可結(jié)合兩個(gè)Ca離子，從而具有耐熱性和增強(qiáng)水解性的特性，其蛋白結(jié)構(gòu)是由2個(gè)亞單位S-100A8和S-100A9組成的復(fù)合物。它分布于人體的粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、角化細(xì)胞和各種組織及體液中，是保護(hù)性蛋白。鈣衛(wèi)蛋白是一種急性炎癥標(biāo)志物，來(lái)源于中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，其表達(dá)具有組織或細(xì)胞特異性，是一種雜合性的鈣結(jié)合蛋白，具有抗蛋白酶的活性，并具有螯合鋅離子能力而具有抗熱性。鈣衛(wèi)蛋白具有抗微生物、調(diào)節(jié)免疫、抗增殖、傳遞信號(hào)等多種生物學(xué)功能，在許多炎癥情況下升高。在炎癥反應(yīng)時(shí)，中性粒細(xì)胞進(jìn)入組織是一個(gè)主動(dòng)積極的過(guò)程，它在趨化因子的作用下鉆出血管壁到達(dá)炎癥區(qū)域，分化成熟為巨噬細(xì)胞，這部分巨噬細(xì)胞作為炎癥的效應(yīng)細(xì)胞，釋放各種炎癥因子，同時(shí)進(jìn)行吞噬發(fā)揮其生物學(xué)功能。在中性粒細(xì)胞中，鈣衛(wèi)蛋白主要存在于溶菌酶外的細(xì)胞質(zhì)中，大約占中性粒細(xì)胞蛋白總量的5%。當(dāng)中性粒細(xì)胞激活時(shí)，磷酸化的鈣衛(wèi)蛋白移位到細(xì)胞膜上，作為酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制底物，可抑制對(duì)細(xì)胞增殖起重要作用的酶（酪蛋白激酶Ⅱ和拓?fù)洚悩?gòu)酶等）。鈣衛(wèi)蛋白還可以刺激免疫球蛋白的生成、趨化因子的活化以及中性粒細(xì)胞固定因子的活化。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法（Latex-enhancedturbidimetricimmunoassay）是一種體液蛋白均相透射免疫比濁檢測(cè)方法，原理是在納米級(jí)高分子膠乳微球的表面交聯(lián)多克隆抗體，當(dāng)交聯(lián)有抗體的微球與抗原結(jié)合后，在短時(shí)間內(nèi)會(huì)迅速聚集在一起，改變了反應(yīng)液的透光性能；反應(yīng)液透光性能（即吸光度）的改變與被測(cè)抗原的濃度有較強(qiáng)的相關(guān)性，在一定范圍內(nèi)可以反映被測(cè)抗原的濃度。膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的優(yōu)勢(shì)具體體現(xiàn)在：1、省時(shí)省力：在均相反應(yīng)體系中進(jìn)行抗原、抗體反應(yīng)，利用全自動(dòng)生化分析儀直接測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值，幾分鐘就能獲得結(jié)果，省卻酶聯(lián)免疫法反復(fù)孵育和洗板等煩瑣操作步驟；2、穩(wěn)定準(zhǔn)確：操作步驟的簡(jiǎn)化也相應(yīng)地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境等外界因素的干擾，穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，能較真實(shí)地反映被測(cè)人體血液或糞便排泄物中鈣衛(wèi)蛋白的含量；3、應(yīng)用廣泛：膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的靈敏度足以檢測(cè)到鈣衛(wèi)蛋白的下限值，可完全滿足臨床檢測(cè)要求，明顯優(yōu)于免疫層析法（膠體金）。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種納米膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒，以解決上述
背景技術(shù)：
中提出的問(wèn)題。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種納米膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒，包括R1試劑，R2試劑和鈣衛(wèi)蛋白抗原校準(zhǔn)品溶液，所述試劑盒包括可密閉盒體以及置于盒體中的試劑固定件，所述試劑固定件為紙質(zhì)固定件或高分子材質(zhì)固定件，所述試劑固定件上開(kāi)設(shè)有空腔，分別為空腔一、空腔二和空腔三，所述空腔一裝有試劑瓶R1，所述空腔二裝有試劑瓶R2，所述空腔三裝有溶液瓶，所述試劑瓶R1、試劑瓶R2以及溶液瓶均包括瓶體及瓶蓋，所述瓶體具有瓶腔且其上端開(kāi)設(shè)有瓶口，所述瓶口外周設(shè)有外螺紋，所述瓶蓋設(shè)有與瓶口外螺紋適配的內(nèi)螺紋，所述瓶蓋與所述瓶體螺紋連接，所述試劑瓶R1為扁平狀瓶體，試劑瓶R2和溶液瓶為圓柱狀瓶體，所述R1試劑包含電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑和緩沖液；所述R2試劑包含包被抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體的膠乳顆粒、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑、緩沖液；所述膠乳顆粒平均粒徑范圍為50～500nm。所述鈣衛(wèi)蛋白抗原校準(zhǔn)品溶液包含鈣衛(wèi)蛋白和穩(wěn)定劑。進(jìn)一步地，所述抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體是通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方法偶聯(lián)于膠乳顆粒表面。進(jìn)一步地，所述電解質(zhì)選自氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂或其組合，濃度為0.1～10%。進(jìn)一步地，鈣衛(wèi)蛋白抗原在校準(zhǔn)品和質(zhì)控品溶液中的濃度為0.01mg/L～100mg/L。進(jìn)一步地，所述穩(wěn)定劑選自酪蛋白、甘露醇、殼聚糖、乙二胺四乙酸二鈉、牛血清白蛋白或其組合，濃度為0.1～10%。進(jìn)一步地，所述表面活性劑選自吐溫、脂肪醇聚乙二醇醚類(lèi)、聚氧乙烯苯基醚或其組合，濃度為0.1～10%。進(jìn)一步地，所述防腐劑選自疊氮鈉、苯酚、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、Proclin系列，濃度為0.1～10%。進(jìn)一步地，所述緩沖液選自MES緩沖液、硼酸緩沖液、醋酸鹽緩沖液、磷酸緩沖液、甘氨酸緩沖液，濃度為10～500mmol/L，pH5～9。進(jìn)一步地，所述方法是通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑在交聯(lián)緩沖液中進(jìn)行；所述化學(xué)交聯(lián)劑選自EDC、N-羥基琥珀酰亞胺、N-羥基硫代琥珀酰亞胺、碳化亞胺、酰肼、異氰酸鉀或其組合；所述交聯(lián)緩沖液選自MES、MOPSO、MOPS、HEPES和PBS緩沖液，pH6～9。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的一種膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒流程，具有穩(wěn)定準(zhǔn)確、省時(shí)省力的優(yōu)點(diǎn)，與全自動(dòng)生化分析儀相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)快速測(cè)定樣品的臨床檢測(cè)要求，與傳統(tǒng)免疫比濁試劑相比靈敏度增加10倍以上，可用于臨床檢測(cè)，所述抗體通過(guò)化學(xué)交聯(lián)的方法偶聯(lián)于膠乳顆粒表面，膠乳顆粒與抗體Fc片段之間通過(guò)化學(xué)鍵結(jié)合，提高抗體的結(jié)合率和穩(wěn)定性，有效地保護(hù)抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域，提高檢測(cè)靈敏度。附圖說(shuō)明圖1是本發(fā)明專(zhuān)利優(yōu)選實(shí)施例的一種用于測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本發(fā)明專(zhuān)利優(yōu)選實(shí)施例的一種用于測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒的試劑固定件結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是本發(fā)明專(zhuān)利優(yōu)選實(shí)施例的一種用于測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒的立體裝配圖；圖4是本發(fā)明專(zhuān)利優(yōu)選實(shí)施例的一種用于測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒的試劑瓶的局部剖視圖；圖5是本發(fā)明專(zhuān)利優(yōu)選實(shí)施例的一種用于測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒的試劑瓶的濃度值變化趨勢(shì)圖；圖6是本發(fā)明專(zhuān)利優(yōu)選實(shí)施例的一種用于測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒的試劑瓶的濃度與吸光度變化趨勢(shì)圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。如圖1-圖4所示，一種納米膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測(cè)定鈣衛(wèi)蛋白的試劑盒，包括R1試劑，R2試劑和鈣衛(wèi)蛋白抗原校準(zhǔn)品溶液，其中R1試劑包含電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑和緩沖液；R2試劑包含包被抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體的膠乳顆粒、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑、緩沖液；所述膠乳顆粒平均粒徑范圍為50～500nm；所述鈣衛(wèi)蛋白抗原校準(zhǔn)品溶液包含鈣衛(wèi)蛋白和穩(wěn)定劑。所述試劑盒包括可密閉盒體1以及置于盒體1中的試劑固定件2，其中試劑固定件2為紙質(zhì)固定件或高分子材質(zhì)固定件，該試劑固定件2上開(kāi)設(shè)有空腔，分別為空腔一3、空腔二4和空腔三5，所述空腔一3裝有試劑瓶R1，空腔二4裝有試劑瓶R2，空腔三5裝有溶液瓶8，而試劑瓶R1、試劑瓶R2以及溶液瓶8均包括瓶體及瓶蓋，所述瓶體具有瓶腔且其上端開(kāi)設(shè)有瓶口，瓶口外周設(shè)有外螺紋，該瓶蓋設(shè)有與瓶口外螺紋適配的內(nèi)螺紋，瓶蓋與所述瓶體螺紋連接，所述試劑瓶R1為扁平狀瓶體，試劑瓶R2和溶液瓶8為圓柱狀瓶體。材料及來(lái)源：鈣衛(wèi)蛋白：通過(guò)基因重組技術(shù)獲取提純的人鈣衛(wèi)蛋白；其他試劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。實(shí)施例1：鈣衛(wèi)蛋白的提取將人的鈣衛(wèi)蛋白重組基因通過(guò)大腸桿菌發(fā)酵表達(dá)，經(jīng)過(guò)離子交換樹(shù)脂與親和層析純化柱純化，獲得高濃度重組人鈣衛(wèi)蛋白，并用BCA方法測(cè)定蛋白濃度，用于接下來(lái)的抗體制備，同時(shí)也可以作為標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的母液。實(shí)施例2：抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體的制備將100μg鈣衛(wèi)蛋白以等量弗氏完全佐劑乳化抗原，背部皮下多點(diǎn)注射2.2～2.5kg的新西蘭白兔，其后每隔兩周以弗氏不完全佐劑乳化抗原，同法重復(fù)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫3次，共計(jì)免疫4次。然后從靜脈抽取100ml兔子血液，離心獲得血清。取10ml兔血清通過(guò)免疫親和層析柱，用1000mlTBS（20mMTris,pH7.4,500mMNaCl,0.05%Tween-20）緩沖液反復(fù)沖洗層析柱，棄去流出液，沖洗完畢后，用10ml的glycine/HCl（100mM,pH2.5）緩沖液洗脫結(jié)合的抗體，收集于透析袋中，并放置于1000mlTBS（20mMTris,pH7.4,500mMNaCl,0.05%Tween-20）緩沖液中，冰箱中4℃透析過(guò)夜，獲得抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體。實(shí)施例3：包被抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體的膠乳顆粒的制備抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體是通過(guò)化學(xué)鍵聯(lián)的方法偶聯(lián)于膠乳顆粒表面，具體步驟如下：1）100mg的膠乳顆粒在5mlMES緩沖液中（50mM,pH6.0）或PBS緩沖液中（50mM,pH7.2），加入表面活性劑十二烷基磺酸鈉（最終濃度0.01%），得到膠乳顆粒溶液。2）將抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體溶解于5mlMES緩沖液中（50mM,pH6.0）或PBS緩沖液中（50mM,pH7.2），最終濃度達(dá)到1～10μmol/ml，得到抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體溶液。3）將膠乳顆粒溶液和抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體溶液充分混合，然后加入100mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）溶解于混合液中，室溫下反應(yīng)2～4h，獲得成功包被抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體的膠乳顆粒。實(shí)施例4：試劑盒的制備R1試劑：由下述重量百分比的組分制成：3%氯化鈉，2.5%的甘露醇，5%的吐溫80，0.5%的疊氮鈉，pH7.4，250mmol/L的MES緩沖液。R2試劑：由下述重量百分比的組分制成：4mg/mL的包被抗人鈣衛(wèi)蛋白多克隆抗體的膠乳顆粒，3%氯化鈉，2.5%的甘露醇，5%的吐溫80，0.5%的疊氮鈉，pH7.4，250mmol/L的MES緩沖液。實(shí)施例5：標(biāo)準(zhǔn)品的制備以通過(guò)基因重組技術(shù)提純的人鈣衛(wèi)蛋白為母液，使用牛血清白蛋白梯度稀釋母液，制備校準(zhǔn)品：S5：40mg/L，S4：10mg/L，S3：5mg/L，S2：1mg/L，S1：0mg/L。牛血清白蛋白濃度100～1000mg/L。實(shí)施例6：質(zhì)控品的制備以通過(guò)基因重組技術(shù)提純的人鈣衛(wèi)蛋白為母液，使用牛血清白蛋白梯度稀釋母液，制備兩種濃度的質(zhì)控品：C1：3.6mg/L，C2：0.6mg/L。牛血清白蛋白濃度100～1000mg/L。實(shí)施例7：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定試劑盒測(cè)定使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)主波長(zhǎng)：600nm，副波長(zhǎng)：750nm。試劑用量：樣本3μl；R1試劑300μl；R2試劑100μl。測(cè)定方法（兩點(diǎn)終點(diǎn)法）：300μlR1試劑加入3μl樣本，于37℃反應(yīng)5分鐘，然后加入100μlR2試劑即開(kāi)始讀點(diǎn)測(cè)得吸光度A1，10分鐘之后再次讀點(diǎn)測(cè)得吸光度A2，計(jì)算吸光度差值ΔA=A2-A1。如圖5所示。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：采用本發(fā)明的鈣衛(wèi)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，濃度分別為S5：40mg/L，S4：10mg/L，S3：5mg/L，S2：1mg/L，S1：0mg/L。按照上述步驟測(cè)得本發(fā)明鈣衛(wèi)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如圖6所示。圖6中曲線上的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)含量的標(biāo)準(zhǔn)品，其中x軸表示鈣衛(wèi)蛋白的濃度，y軸表示吸光度的差值。實(shí)施例8、線性范圍的確定將接近線性范圍上限的鈣衛(wèi)蛋白高濃度樣本100mg/L，用生理鹽水按1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64稀釋?zhuān)才渲瞥?個(gè)不同濃度的溶液，另以不含鈣衛(wèi)蛋白的生理鹽水作為空白溶液。用實(shí)施例7所述方法檢測(cè)各濃度，將測(cè)定濃度值與理論濃度進(jìn)行線性回歸分析，計(jì)算回歸方程為：y=1.0102x-0.1321，相關(guān)系數(shù)r=0.9995，表明本發(fā)明試劑盒在0～100mg/L線性范圍內(nèi)相關(guān)性較好。實(shí)施例9：準(zhǔn)確度測(cè)定使用本發(fā)明的試劑盒采用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)20例人（深圳市第三人民醫(yī)院消化科和檢驗(yàn)科）進(jìn)行血清測(cè)定（小于等于0.6mg/L為正常標(biāo)本，大于0.6mg/L為發(fā)生感染炎癥標(biāo)本）和糞便測(cè)定（小于等于3.6mg/L為正常標(biāo)本，大于3.6mg/L為發(fā)生感染炎癥標(biāo)本）。測(cè)試結(jié)果如下表1所示，結(jié)果顯示本發(fā)明的試劑盒和臨床病癥的相關(guān)性很高。表1：實(shí)施例10：靈敏度測(cè)定靈敏度定義為單位濃度吸光度的變化。用鈣衛(wèi)蛋白校準(zhǔn)品對(duì)鈣衛(wèi)蛋白試劑在全自動(dòng)生化分析儀上定標(biāo)，記錄校準(zhǔn)品（濃度為1.0mg/L）與試劑反應(yīng)的吸光度值為0.16，即該試劑在校準(zhǔn)濃度為1.0mg/L時(shí)的靈敏度為0.16。實(shí)施例11：批內(nèi)精密度的測(cè)定按本發(fā)明試劑盒測(cè)定同一份樣本10次，計(jì)算測(cè)定均值和批內(nèi)精密度，如表2所示。結(jié)果顯示批內(nèi)精密度為0.51%。表2：實(shí)施例12：抗干擾分析干擾物選擇配方和測(cè)試結(jié)果如下表3所示。結(jié)果顯示，使用本發(fā)明專(zhuān)利的試劑盒抗干擾能力良好。表3：加入的干擾物質(zhì)測(cè)定值（mg/L）試驗(yàn)組與對(duì)照組測(cè)定值偏差對(duì)照組：樣本+蒸餾水3.21-試驗(yàn)組：樣本+VC3.230.62%試驗(yàn)組：樣本+膽紅素3.220.31%試驗(yàn)組：樣本+血紅蛋白3.251.25%試驗(yàn)組：樣本+甘油三酯3.261.56%盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3