本發(fā)明涉及一種檢測方法，具體是一種阪崎腸桿菌含量的快速檢測方法。
背景技術：
許多食源性疾病大多都是由食源性致病菌引起的。食源性致病菌快速檢測一直是研究關注的焦點。食源性致病菌快速檢測是采用微生物學、化學、生物化學、生物物理、免疫學的方法對食品及其加工、貯藏等環(huán)境中的致病菌進行分離、檢測、鑒定和計數(shù)。阪崎腸桿菌是乳制品中新發(fā)現(xiàn)的一種病原菌，已被世界衛(wèi)生組織和許多國家確定為引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌。阪崎腸桿菌(又稱阪崎氏腸桿菌)是腸桿菌科的一種，1980年由黃色陰溝腸桿菌更名為阪崎腸桿菌。該菌引起的食源性疾病可導致嬰兒(尤其是新生兒)的腦膜炎、小腸結腸炎和菌血癥，報告病例的死亡率達20％～50％，幸存者常遺留嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。近年來對食品(奶粉、巧克力、谷類食品、馬鈴薯、意大利面等)加工廠原料、生產(chǎn)環(huán)境及家庭中阪崎腸桿菌污染率的研究發(fā)現(xiàn)，阪崎腸桿菌在自然界中分布廣泛。在多起阪崎腸桿菌的暴發(fā)事件中發(fā)現(xiàn)，新生兒阪崎腸桿菌感染與嬰兒配方粉(powderedinfantformula，PIF)密切相關。2004年2月FAOPWHO在日內瓦召開的嬰兒配方粉中阪崎腸桿菌專家研討會上提出，嬰兒配方粉中微量的阪崎腸桿菌污染(＜3CFUP100g)也能導致感染的發(fā)生。即使是嬰兒配方粉中大腸菌群污染水平符合相應的微生物學標準，也可能存在阪崎腸桿菌的污染。PIF中阪崎腸桿菌的污染已經(jīng)引起國際社會的廣泛關注。2002年國際食品微生物標準化委員會(ICMSF)把阪崎腸桿菌列為“嚴重危害特定人群，危害生命或慢性實質性后遺癥或長期影響”的一種致病菌。從2005年開始我國陸續(xù)出臺了阪崎腸桿菌檢測的行業(yè)標準和國家標準。雖然標準規(guī)定的檢測方法準確性和靈敏度較高，但存在操作繁瑣、時間長等缺陷。分子技術比如PCR技術應用于阪崎腸桿菌的檢測，用PCR技術檢測有害微生物具有特異性強、靈敏度高和操作簡便、省時等優(yōu)點，但是PCR反應受樣品情況的影響比較大，特別在食源性有害微生物檢查中，食品中的成分(糖類、酸類，油脂等物質)會干擾反應的正常進行。而檢測的環(huán)境，中間處理環(huán)節(jié)也會帶來一些PCR反應抑制劑。從而使PCR反應呈現(xiàn)較高的假陽性和假陰性率。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種阪崎腸桿菌含量的快速檢測方法，以解決上述背景技術中提出的問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案：
一種阪崎腸桿菌含量的快速檢測方法，包括如下步驟：(1)向待測樣品中加入免疫化超順磁性納米磁珠，15～35℃混合反應10～60min，使免疫化超順磁性納米磁珠與阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；(2)在外加磁場吸引作用下，收集免疫化超順磁性納米磁珠，洗滌后加入免疫化熒光量子點，15～35℃混合反應10～60min，使之與載于免疫化超順磁性納米磁珠的阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；(3)利用外加磁場作用吸附收集載于免疫化超順磁性納米磁珠的阪崎腸桿菌與免疫化熒光量子點結合物，洗滌后定性或定量熒光檢測；所述免疫化超順磁性納米磁珠為以四氧化三鐵納米粒子為內核，以二氧化硅為外殼，表面偶聯(lián)特異性抗體的磁性粒子；所述的特異性抗體為抗阪崎腸桿菌多克隆抗體或抗阪崎腸桿菌單克隆抗體；所述的免疫化熒光量子點為與聯(lián)特異性抗體連接的量子點，所述的特異性抗體為抗阪崎腸桿菌多克隆抗體或抗阪崎腸桿菌單克隆抗體；所述的免疫化超順磁性納米磁珠是以四氧化三鐵納米粒子為內核、以二氧化硅為外殼、表面偶聯(lián)抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的磁性粒子。
作為本發(fā)明進一步的方案：所述的抗阪崎腸桿菌多克隆抗體為兔抗阪崎腸桿菌多克隆抗體。
作為本發(fā)明進一步的方案：所述免疫化超順磁納米磁珠的粒徑為80～120nm，用量為0.5～0.1mg/ml。
作為本發(fā)明再進一步的方案：所述的免疫化超順磁性納米磁珠制備方法包括如下步驟：(1)包被二氧化硅和表面氨基化：將粒徑10～70nm的四氧化三鐵納米磁核的環(huán)己烷溶液與正硅酸四乙酯和氨水混合，加入過硫酸銨，攪拌反應48～96小時；反應結束后加入丙酮，過濾洗滌；(2)連接抗體：特異性抗體活化后分散在pH7.3～7.6磷酸緩沖液中，加入步驟(1)所得表面氨基化的納米磁珠，2～8℃反應8～12小時；所述抗阪崎腸桿菌多克隆抗體用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺)活化。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明對阪崎腸桿菌的檢測具有高度特異性和靈敏性，而且快速，尤其適用于檢測低濃度的阪崎腸桿菌，尤其是乳制品中的阪崎腸桿菌。本方法能高靈敏度地檢測出樣品中的目標菌，尤其在低濃度的目標菌情況下極為靈敏。
具體實施方式
下面對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。
本發(fā)明實施例中，一種阪崎腸桿菌含量的快速檢測方法，包括如下步驟：(1)向待測樣品中加入免疫化超順磁性納米磁珠，15～35℃混合反應10～60min，使免疫化超順磁性納米磁珠與阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；(2)在外加磁場吸引作用下，收集免疫化超順磁性納米磁珠，洗滌后加入免疫化熒光量子點，15～35℃混合反應10～60min，使之與載于免疫化超順磁性納米磁珠的阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；(3)利用外加磁場作用吸附收集載于免疫化超順磁性納米磁珠的阪崎腸桿菌與免疫化熒光量子點結合物，洗滌后定性或定量熒光檢測；所述免疫化超順磁性納米磁珠為以四氧化三鐵納米粒子為內核，以二氧化硅為外殼，表面偶聯(lián)特異性抗體的磁性粒子；所述的特異性抗體為抗阪崎腸桿菌多克隆抗體或抗阪崎腸桿菌單克隆抗體；所述的免疫化熒光量子點為與聯(lián)特異性抗體連接的量子點，所述的特異性抗體為抗阪崎腸桿菌多克隆抗體或抗阪崎腸桿菌單克隆抗體；所述的免疫化超順磁性納米磁珠是以四氧化三鐵納米粒子為內核、以二氧化硅為外殼、表面偶聯(lián)抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的磁性粒子。所述的抗阪崎腸桿菌多克隆抗體為兔抗阪崎腸桿菌多克隆抗體。所述免疫化超順磁納米磁珠的粒徑為80～120nm，用量為0.5～0.1mg/ml。所述的免疫化超順磁性納米磁珠制備方法包括如下步驟：(1)包被二氧化硅和表面氨基化：將粒徑10～70nm的四氧化三鐵納米磁核的環(huán)己烷溶液與正硅酸四乙酯和氨水混合，加入過硫酸銨，攪拌反應48～96小時；反應結束后加入丙酮，過濾洗滌；(2)連接抗體：特異性抗體活化后分散在pH7.3～7.6磷酸緩沖液中，加入步驟(1)所得表面氨基化的納米磁珠，2～8℃反應8～12小時；所述抗阪崎腸桿菌多克隆抗體用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺)活化。
實施例1：
本發(fā)明阪崎腸桿菌含量的快速檢測方法，包括如下步驟：(1)向待測樣品中加入免疫化超順磁性納米磁珠，15℃混合反應10min，使免疫化超順磁性納米磁珠與阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；(2)在外加磁場吸引作用下，收集免疫化超順磁性納米磁珠，洗滌后加入免疫化熒光量子點，15℃混合反應10min，使之與載于免疫化超順磁性納米磁珠的阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；(3)利用外加磁場作用吸附收集載于免疫化超順磁性納米磁珠的阪崎腸桿菌與免疫化熒光量子點結合物，洗滌后定性或定量熒光檢測；所述免疫化超順磁性納米磁珠為以四氧化三鐵納米粒子為內核，以二氧化硅為外殼，表面偶聯(lián)特異性抗體的磁性粒子；所述的特異性抗體為抗阪崎腸桿菌多克隆抗體或抗阪崎腸桿菌單克隆抗體；所述的免疫化熒光量子點為與聯(lián)特異性抗體連接的量子點，所述的特異性抗體為抗阪崎腸桿菌多克隆抗體或抗阪崎腸桿菌單克隆抗體；所述的免疫化超順磁性納米磁珠是以四氧化三鐵納米粒子為內核、以二氧化硅為外殼、表面偶聯(lián)抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的磁性粒子。所述的抗阪崎腸桿菌多克隆抗體為兔抗阪崎腸桿菌多克隆抗體。所述免疫化超順磁納米磁珠的粒徑為80nm，用量為0.5mg/ml。所述的免疫化超順磁性納米磁珠制備方法包括如下步驟：(1)包被二氧化硅和表面氨基化：將粒徑10nm的四氧化三鐵納米磁核的環(huán)己烷溶液與正硅酸四乙酯和氨水混合，加入過硫酸銨，攪拌反應48小時；反應結束后加入丙酮，過濾洗滌；(2)連接抗體：特異性抗體活化后分散在pH7.3磷酸緩沖液中，加入步驟(1)所得表面氨基化的納米磁珠，2℃反應8小時；所述抗阪崎腸桿菌多克隆抗體用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺)活化。
實施例2：
本發(fā)明阪崎腸桿菌含量的快速檢測方法，包括如下步驟：(1)向待測樣品中加入免疫化超順磁性納米磁珠，35℃混合反應60min，使免疫化超順磁性納米磁珠與阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；(2)在外加磁場吸引作用下，收集免疫化超順磁性納米磁珠，洗滌后加入免疫化熒光量子點，35℃混合反應60min，使之與載于免疫化超順磁性納米磁珠的阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；(3)利用外加磁場作用吸附收集載于免疫化超順磁性納米磁珠的阪崎腸桿菌與免疫化熒光量子點結合物，洗滌后定性或定量熒光檢測；所述免疫化超順磁性納米磁珠為以四氧化三鐵納米粒子為內核，以二氧化硅為外殼，表面偶聯(lián)特異性抗體的磁性粒子；所述的特異性抗體為抗阪崎腸桿菌多克隆抗體或抗阪崎腸桿菌單克隆抗體；所述的免疫化熒光量子點為與聯(lián)特異性抗體連接的量子點，所述的特異性抗體為抗阪崎腸桿菌多克隆抗體或抗阪崎腸桿菌單克隆抗體；所述的免疫化超順磁性納米磁珠是以四氧化三鐵納米粒子為內核、以二氧化硅為外殼、表面偶聯(lián)抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的磁性粒子。所述的抗阪崎腸桿菌多克隆抗體為兔抗阪崎腸桿菌多克隆抗體。所述免疫化超順磁納米磁珠的粒徑為120nm，用量為0.1mg/ml。所述的免疫化超順磁性納米磁珠制備方法包括如下步驟：(1)包被二氧化硅和表面氨基化：將粒徑70nm的四氧化三鐵納米磁核的環(huán)己烷溶液與正硅酸四乙酯和氨水混合，加入過硫酸銨，攪拌反應96小時；反應結束后加入丙酮，過濾洗滌；(2)連接抗體：特異性抗體活化后分散在pH7.6磷酸緩沖液中，加入步驟(1)所得表面氨基化的納米磁珠，8℃反應12小時；所述抗阪崎腸桿菌多克隆抗體用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺)活化。
實施例3：
本發(fā)明阪崎腸桿菌含量的快速檢測方法，包括如下步驟：(1)向待測樣品中加入免疫化超順磁性納米磁珠，20℃混合反應30min，使免疫化超順磁性納米磁珠與阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；(2)在外加磁場吸引作用下，收集免疫化超順磁性納米磁珠，洗滌后加入免疫化熒光量子點，20℃混合反應30min，使之與載于免疫化超順磁性納米磁珠的阪崎腸桿菌發(fā)生特異性結合；(3)利用外加磁場作用吸附收集載于免疫化超順磁性納米磁珠的阪崎腸桿菌與免疫化熒光量子點結合物，洗滌后定性或定量熒光檢測；所述免疫化超順磁性納米磁珠為以四氧化三鐵納米粒子為內核，以二氧化硅為外殼，表面偶聯(lián)特異性抗體的磁性粒子；所述的特異性抗體為抗阪崎腸桿菌多克隆抗體或抗阪崎腸桿菌單克隆抗體；所述的免疫化熒光量子點為與聯(lián)特異性抗體連接的量子點，所述的特異性抗體為抗阪崎腸桿菌多克隆抗體或抗阪崎腸桿菌單克隆抗體；所述的免疫化超順磁性納米磁珠是以四氧化三鐵納米粒子為內核、以二氧化硅為外殼、表面偶聯(lián)抗阪崎腸桿菌多克隆抗體的磁性粒子。所述的抗阪崎腸桿菌多克隆抗體為兔抗阪崎腸桿菌多克隆抗體。所述免疫化超順磁納米磁珠的粒徑為100nm，用量為0.8mg/ml。所述的免疫化超順磁性納米磁珠制備方法包括如下步驟：(1)包被二氧化硅和表面氨基化：將粒徑50nm的四氧化三鐵納米磁核的環(huán)己烷溶液與正硅酸四乙酯和氨水混合，加入過硫酸銨，攪拌反應56小時；反應結束后加入丙酮，過濾洗滌；(2)連接抗體：特異性抗體活化后分散在pH7.5磷酸緩沖液中，加入步驟(1)所得表面氨基化的納米磁珠，6℃反應10小時；所述抗阪崎腸桿菌多克隆抗體用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基丁二酰亞胺)活化。
對于本領域技術人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發(fā)明內。此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經(jīng)適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。