本發(fā)明涉及一種檢測醛酮類化合物的方法，特別涉及一種以丹磺酰肼作為醛酮類化合物轉(zhuǎn)化試劑，通過熒光檢測醛酮類化合物的方法，屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

醛酮類物質(zhì)是常見常用的化學試劑，包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、丙酮等等，這些屬于小分子、低沸點醛酮，易被釋放到空氣中或轉(zhuǎn)移到接觸物上直接或間接地導(dǎo)致多種疾病。其中，甲醛對人體的鼻腔、肺、造血系統(tǒng)均可造成損傷，并提高各個部位患癌的風險，國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)已經(jīng)將甲醛歸于可疑致癌物類。其它醛酮長期接觸，會在一定程度上損害健康，甚至引發(fā)一系列的并發(fā)癥。

目前，國內(nèi)外常用的醛酮的檢測方法是2,4-二硝基苯肼(DNPH)柱前衍生－HPLC/PDA進行檢測，其衍生原理如下反應(yīng)方程式1，行業(yè)內(nèi)相關(guān)的常用檢測方法也是基于此原理進行的。但是基于PDA檢測器靈敏度的限制，其檢測限均處于一個較高數(shù)值的水平，對于樣品中較低濃度的醛酮的檢測與監(jiān)控無法達到。

其中，R₁和R₂獨立選擇氫、甲基乙基等；

反應(yīng)方程式1：DNPH衍生醛酮原理

而熒光檢測器(FLD)靈敏度要比PDA檢測器高，但熒光檢測器對衍生化試劑的選擇有較高的要求，需要其自身能發(fā)出熒光或者產(chǎn)物能發(fā)出熒光，因此，尋找合適的衍生化試劑是實現(xiàn)熒光檢測醛酮類化合物的關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有的PDA檢測醛酮類化合物的方法存在的缺陷，本發(fā)明的目的是在于提供一種方法簡單，靈敏度高，檢出限低的低含量醛酮的分析檢測方法，該方法基于熒光檢測醛酮類化合物，能很好地應(yīng)用到實際生活中樣品的檢測，有利于推廣應(yīng)用。

為了實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明提供了一種檢測醛酮類化合物的方法，在酸性條件下，將醛酮類化合物與丹磺酰肼反應(yīng)，得到腙類化合物；所述腙類化合物通過高效液相色譜分離后，采用熒光檢測器進行定性定量分析。

本發(fā)明的技術(shù)方案首次選用丹磺酰肼(DNSH)作為醛酮類化合物的轉(zhuǎn)化試劑，使醛酮類化合物轉(zhuǎn)化成可用于高效液相色譜標記，且能被熒光檢測器檢測的腙類化合物，以實現(xiàn)高效液相色譜分離及熒光檢測(FLD)，以達到高靈敏度和低檢出限檢測醛酮類化合物的目的。

本發(fā)明技術(shù)方案，在酸性介質(zhì)存在條件下，DNSH易于與醛酮類化合物發(fā)生反應(yīng)生成相對穩(wěn)定的腙類化合物，由于其結(jié)構(gòu)本身包含具有大的共軛結(jié)構(gòu)，可用于高效液相色譜標記，且能被熒光檢測器檢測。DNSH與醛酮類化合物的反應(yīng)機理如反應(yīng)方程式2。本發(fā)明的技術(shù)方案正是利用該原理建立了檢測醛酮類化合物的方法，該方法具有簡單，靈敏度高，檢出限低等特點，為低含量醛酮的檢測提供方法依據(jù)。

反應(yīng)方程式2：DNSH衍生醛酮原理

優(yōu)選的方案，醛酮類化合物與丹磺酰肼在冰醋酸/乙腈混合溶液中反應(yīng)，得到腙類化合物。DNSH易溶于極性溶劑如乙醇、乙腈等，但極易在水中分解，穩(wěn)定性差，本發(fā)明的技術(shù)方案在非水溶劑中進行反應(yīng)。同時，丹磺酰肼氨氮上含有活性較強的孤對電子，在酸性條件下，能進攻羰基碳，發(fā)生親核加成反應(yīng)。

較優(yōu)選的方案，反應(yīng)溫度為5～45℃，反應(yīng)時間為12～30h。

較優(yōu)選的方案，醛酮類化合物包括甲醛、乙醛、丙醛、丁醛、丙酮中至少一種。

較優(yōu)選的方案，所述高效液相色譜采用的液相色譜柱型號：C18(2)，4.6mm×250mm，5μm；

流動相A：水，流動相B：乙腈；

洗脫程序：梯度洗脫，0min，55vol％A+45vol％B；12min，55vol％A+45vol％B；15min，40vol％A+60vol％B；20min，10vol％A+90vol％B；21min，55vol％A+45vol％B，25min，55vol％A+45vol％B；

流速：1.0mL·min^-1；

進樣量：10μL；

柱溫：30℃。

較優(yōu)選的方案，熒光檢測器為2475熒光檢測器，檢測波長λex＝330nm，λem＝484nm。

本發(fā)明的技術(shù)方案中，丹磺酰肼采用醋酸/乙腈溶液配制成濃度為500mg·L^-1的丹磺酰肼溶液，具體配制方法為：準確稱取丹磺酰肼(DNSH)25mg到50mL棕色容量瓶中，加入適量3％(體積百分數(shù))冰醋酸/乙腈混合溶液，振蕩使DNSH完全溶解后，用冰醋酸/乙腈混合溶液定容至刻度。

本發(fā)明的技術(shù)方案可以用于檢測樣品中的醛酮類化合物，如紙張等，樣品中的醛酮類化合物先采用乙腈提取，再采用丹磺酰肼溶液使醛酮類化合物轉(zhuǎn)化成可以進行熒光檢測的腙類化合物。以檢測紙張中醛酮類化合物含量進行具體說明：稱取待測樣品(如紙張)1.5g于50mL具塞錐形瓶中，往錐形瓶中加入乙腈15mL，振蕩萃取30min，靜置后取約8mL上層清液到10mL離心管，于12000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，取離心后的上層清液5mL到裝有2mL丹磺酰肼溶液和90μL冰醋酸的10mL棕色容量瓶中，并用乙腈定容至刻度，反應(yīng)24h，過0.45μm有機相濾膜后，采用高效液相色譜分析及熒光檢測。

本發(fā)明的熒光檢測過程中標準工作液的配制方法：

1)混合標準儲備液的配置

準確移取磺酰肼溶液5mL到10mL棕色容量瓶中，再分別準確移取各醛酮類化合物標準品各20μL到上述容量瓶中，振蕩混勻后，用乙腈溶液定容至刻度，配置成各醛酮類化合物的腙類化合物濃度均為2mg·L^-1的一級混合標準儲備液。準確移取5.00mL一級混合標準儲備液到10mL棕色容量瓶中，用1.5vol.％冰醋酸/乙腈溶液定容至刻度，作為二級混合標準儲備液。

2)混合標準工作液的配置

分別準確移取0.100、0.200、0.500、1.000、2.000、4.000mL二級混合標準儲備液到10mL棕色容量瓶中，用1.5vol.％冰醋酸/乙腈溶液定容至刻度，得到濃度分別為10.000、20.000、50.000、100.000、200.000、400.000μg·L^-1混合標準工作液。

相對現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)方案帶來的有益技術(shù)效果：本發(fā)明的技術(shù)方案首次選用丹磺酰肼(DNSH)作為醛酮類化合物的轉(zhuǎn)化試劑，使醛酮類化合物轉(zhuǎn)化成可用于高效液相色譜標記，且能被熒光檢測器檢測的腙類化合物，實現(xiàn)了醛酮類化合物的熒光檢測(FLD)，具有簡單，靈敏度高，檢出限低等特點，為低含量醛酮類化合物的檢測提供方法依據(jù)。

附圖說明

【圖1】工藝流程圖。

【圖2】為標準溶液和某紙張樣品中5種選擇的醛酮類化合物的色譜圖；

其中，1為甲醛-丹磺酰腙，2為乙醛-丹磺酰腙；3為丙酮-丹磺酰腙；4為丙醛-丹磺酰腙；5為丁醛-丹磺酰腙。

具體實施方式

以下以DNSH衍生-HPLC/FLD法同時測定某紙張中的五種醛酮的測定方法為例，對本發(fā)明進行進一步的說明，而不會限制本發(fā)明權(quán)利要求保護范圍。

實施例1

1、儀器、試劑與材料

儀器：Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)，配備自動進樣器，四元泵，柱溫箱和2475熒光檢測器；BSA224S-CW分析天平(德國Sartorius電子天平公司)；HY-6雙層調(diào)速振蕩儀(國華電器有限公司)；KQ-600DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；TGL-16M臺式離心機(湘儀離心機儀器有限公司)；Milli-Q50超純水儀(美國Millipore公司)；1uL-5mL活塞式移液槍(德國Eppendorf公司)；C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)液相色譜柱。

試劑：

表1標準品及試劑

所用水為超純水。

2、溶液的配制

DNSH溶液：準確稱取丹磺酰肼(DNSH)25mg到50mL棕色容量瓶中，加入適量3％(體積百分數(shù))冰醋酸/乙腈混合溶液，振蕩使DNSH完全溶解后，用該溶液定容至刻度。DNSH溶液中DNSH濃度為500mg·L^-1。

混合標準儲備液的配制：準確移取衍生化試劑5mL到10mL棕色容量瓶中，再分別準確移取甲醛、乙醛、丙酮、丙醛、丁醛標準品各20μL到上述容量瓶中，振蕩混勻后，用乙腈溶液定容至刻度，配置成甲醛－腙、乙醛－腙、丙醛－腙、丁醛－腙、丙酮－腙濃度均為2mg·L^-1的一級混合標準儲備液。準確移取5.00mL一級混合標準儲備液到10mL棕色容量瓶中，用1.5％冰醋酸/乙腈混合溶液定容至刻度，作為二級混合標準儲備液。

混合標準工作液的配制：分別準確移取0.100、0.200、0.500、1.000、2.000、4.000mL二級混合標準儲備液到10mL棕色容量瓶中，用1.5％冰醋酸/乙腈混合溶液定容至刻度，得到濃度分別為10.000、20.000、50.000、100.000、200.000、400.000μg·L-1混合標準工作液。于4℃冰箱中避光保存，有效期3個月。

3、樣品前處理

稱取按規(guī)定裁剪紙張碎片1.5g于50mL具塞錐形瓶中，往錐形瓶中加入乙腈15mL，振蕩萃取30min，靜置后取約8mL上層清液到10mL離心管,于12000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，取離心后的上層清液5mL到裝有2mL衍生化試劑和90μL冰醋酸的10mL棕色容量瓶中，并用乙腈定容至刻度，衍生化反應(yīng)24h，而后過0.45μm有機相濾膜待高效液相色譜分析。

4、檢測

儀器條件

液相色譜柱：C18(2)(4.6mm×250mm，5μm)；檢測器：2475熒光檢測器,λex＝330nm，λem＝484nm；流動相A：水，流動相B：乙腈；洗脫程序：梯度洗脫，0min，(55％A+45％B)，12min，(55％A+45％B)，15min，(40％A+60％B)，20min(10％A+90％B)，21min，(55％A+45％B)，25min，(55％A+45％B)；流速：1.0mL·min-1；進樣量：10μL；柱溫：30℃。采用保留時間定性，外標法定量。

分析檢測步驟：

在色譜條件下對系列標準工作液進行測定，根據(jù)測得的峰面積(μV*S)對其質(zhì)量濃度ρ(μg·L-1)進行線性回歸，以峰面積(μV*S)為Y軸，以質(zhì)量濃度ρ(μg·L-1)為X軸作圖，得到線性回歸方程。各醛酮的線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表2，方法的加標回收率及精密度見表3。

表2線性范圍、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

表3方法回收率及精密度結(jié)果(n＝5)

紙張樣品的檢測：在相同條件下對樣品進行檢測，將得到的待測5種醛酮化合物的色譜峰面積帶入相應(yīng)的標準曲線回歸方程中，即可得到樣品中相應(yīng)的5種醛酮化合物的含量。

5、含量計算

某紙張中5種醛酮化合物的測定結(jié)果，按照下列公式計算：

q＝c×V/m

式中：

q為紙張中5種醛酮化合物含量，單位為μg/kg；

c為紙張中5種醛酮化合物的濃度，單位為μg/L；

V為萃取液體積(mL)；

m為稱的取紙張樣品重量，單位為g。

試驗樣品中5種醛酮化合物含量的測定采用本發(fā)明方法，測定結(jié)果如表4所示：

表4紙張樣品分析結(jié)果

注：“－”表示低于定量限，未檢出。