本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術，具體涉及一種用于檢測替米考星的酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用。

背景技術：

替米考星(Tilmicosin)屬大環(huán)內酯類抗生素，其主要作用機理是干擾菌體蛋白質的合成，主要用于防治家畜肺炎(由胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、支原體等感染引起)、禽支原體病及泌乳動物的乳腺炎，低劑量時亦可作豬的飼料添加劑以促進增重和提高飼料轉換率。雖然該藥物具有良好的藥理作用，但在體內蓄積達到一定濃度，可引起過敏反應、耳蝸神經損害、聽力減退，嚴重者造成肝腎的嚴重損害，同時導致攜帶耐藥因子的菌株擴散。

農業(yè)部第235號文件中規(guī)定，替米考星在肌肉、脂肪中的最高殘留限量為75～100μg/kg；在肝臟、腎臟中的最高殘留限量為250～1000μg/kg；在奶中的最高殘留限量為50μg/L。

目前替米考星的檢測方法主要是儀器檢測方法和免疫分析檢測方法。高效液相色譜法，也是我國測定食品中替米考星的標準方法，但是由于儀器設備昂貴，技術水平要求較高，樣品還需要進行純化處理，不利于現場篩查。文獻報道替米考星殘留檢測的免疫學方法相對較少，且主要集中在奶制品的檢測。本發(fā)明應用酶聯(lián)免疫法，測定動物組織、蜂蜜、雞蛋、牛奶和水質中替米考星藥物的殘留量，具有檢測限低、特異性強、操作簡便、檢測速度快、檢測成本低，非常容易推廣等優(yōu)點。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的是提供一種替米考星酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用。

一種替米考星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，其包括包被有包被原的酶標板、替米考星特異性抗體、酶標記物、替米考星標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、樣本稀釋液，所述包被原為替米考星藥物抗原，所述酶標記物為酶標記抗抗體。

本發(fā)明所提供的替米考星酶聯(lián)免疫試劑盒，所述替米考星藥物抗原為替米考星半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，所述載體蛋白為牛血清白蛋白、鼠血清蛋白、兔血清蛋白、甲狀腺蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或人血清白蛋白。

所述替米考星特異性抗體為替米考星單克隆抗體，是用替米考星免疫原免疫動物得到的。所述替米考星單克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源或豚鼠源抗體，所述替米考星單克隆抗體優(yōu)選為替米考星鼠單克隆抗體。

所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶，酶標記抗抗體是采用過碘酸鈉法將標記酶與羊抗鼠抗抗體偶聯(lián)得到。

為了更方便的進行大量樣本篩查和現場監(jiān)控，所述試劑盒還包括：替米考星標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、樣本稀釋液。

所述標準品溶液為系列替米考星標準品溶液，1mL/瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L。所述底物液A液為過氧化脲溶液，底物液B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液，所述的終止液為1～2mol/L的硫酸溶液，所述濃縮洗滌液為含1％吐溫-20的0.15～0.2mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液，所述的樣本稀釋液為pH為7.4的0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液中吐溫-20的含量為0.5％混合溶液配制而成的稀釋液進行稀釋。

其中所述酶標板在制備過程中所用到的包被緩沖液為pH 9.6的0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，封閉緩沖液為10％的小牛血清溶液。

發(fā)明酶標板的制備主要為：用包被緩沖液將包被原稀釋成0.2～0.3μg/ml，每孔加入100μl，37℃環(huán)境中避光孵育2h或4℃過夜，傾去孔中液體，洗滌液洗滌1～2次，拍干，每孔中加入150μl封閉液，37℃避光孵育2h，傾去孔中液體拍干，用鋁膜真空密閉保存。

本發(fā)明中包被原和免疫原的合成過程為：

1.半抗原合成(合成路線如圖1)

(1)取1.0g替米考星，加DMF溶解，加氫化鈉0.138g，加2-(4-溴丁基)-1,3-二氧戊環(huán)0.72g，60℃攪拌5h。停止反應，冷卻到室溫，加水稀釋，加適量稀鹽酸調節(jié)PH值到7，1,2-二氯乙烷萃取，分去水相，水洗，無水硫酸鈉干燥，正己烷/乙醚(5/1，v/v)重結晶，得到中間產物縮醛替米考星0.95g，收率83.33％。

(2)取0.95g中間產物縮醛替米考星加20ml乙醇溶解，加1mol/L稀鹽酸10ml，50℃攪拌反應4h。停止反應，加碳酸氫鈉水溶液，調節(jié)PH值到7，加乙酸乙酯萃取，水洗，無水硫酸鈉干燥，蒸干，上硅膠柱，二氯甲烷/甲醇(5/1，v/v)，洗脫分離，得到戊醛替米考星半抗原產物0.8g，收率88.9％。

2.免疫原的合成

(1)取戊醛-替米考星半抗原36mg，加乙醇0.4ml溶解，得到A液

(2)取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加6ml PH 9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液溶解，將A液緩慢滴加到蛋白溶液中，室溫下，避光攪拌6h。

(3)將得到抗原溶液用0.02M PBS透析3天，每天換液3次，封裝，得到免疫原。

3.包被原的合成

(1)取16mg戊醛-替米考星半抗原，溶解于0.3mL乙醇，得到A液。

(2)稱取OVA50mg，使之充分溶解在5mLCB(PH 9.5)中，將A液逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌4h；

(3)用0.02mol/l PBS4℃透析3d，每天換3次透析液，得到包被抗原。

4.單克隆抗體的制備

動物免疫：替米考星半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物免疫8-10周齡Balb/c小鼠。

細胞融合與克隆化：取免疫后的鼠脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞在融合劑聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，篩選獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

細胞凍存和復蘇：將雜交瘤細胞用凍存液制成1×10⁹個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)。

本發(fā)明還提供了一種用替米考星酶聯(lián)免疫試劑盒檢測樣本中替米考星殘留的方法，采用本方法對動物組織、蜂蜜、雞蛋、牛奶和水質樣本中的替米考星進行定性或定量檢測，樣本前處理過程簡單，能同時快速檢測大批量樣本，試劑盒具有很高的精確度和靈敏度，較低的操作技術要求和短暫的檢測時間，檢測樣本量大等特點，主要步驟包括：

1)將待測樣本進行前處理，得到待測樣本溶液；

2)用酶聯(lián)免疫試劑盒檢測待測樣本溶液；

3)分析檢測結果。

附圖說明

圖1：替米考星半抗原合成圖

圖2：替米考星標準曲線

具體實施方式

下面結合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明均為常規(guī)方法。

實施例一：抗原、抗體及酶標記物的制備

1.替米考星半抗原的制備

(1)取1.0g替米考星，加DMF溶解，加氫化鈉0.138g，加2-(4-溴丁基)-1,3-二氧戊環(huán)0.72g，60℃攪拌5h。停止反應，冷卻到室溫，加水稀釋，加適量稀鹽酸調節(jié)PH值到7，1,2-二氯乙烷萃取，分去水相，水洗，無水硫酸鈉干燥，正己烷/乙醚(5/1，v/v)重結晶，得到中間產物縮醛替米考星0.95g，收率83.33％。

(2)取0.95g中間產物縮醛替米考星加20ml乙醇溶解，加1mol/L稀鹽酸10ml，50℃攪拌反應4h。停止反應，加碳酸氫鈉水溶液，調節(jié)PH值到7，加乙酸乙酯萃取，水洗，無水硫酸鈉干燥，蒸干，上硅膠柱，二氯甲烷/甲醇(5/1，v/v)，洗脫分離，得到戊醛替米考星半抗原產物0.8g，收率88.9％。

2.免疫原的制備

(1)取戊醛-替米考星半抗原36mg，加乙醇0.4ml溶解，得到A液

(2)取牛血清白蛋白(BSA)50mg，加6ml PH 9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液溶解，將A液緩慢滴加到蛋白溶液中，室溫下，避光攪拌6h。

(3)將得到抗原溶液用0.02M PBS透析3天，每天換液3次，封裝，得到免疫原。

3.包被原的制備

(1)取16mg戊醛-替米考星半抗原，溶解于0.3mL乙醇，得到A液。

(2)稱取OVA 50mg，使之充分溶解在5mL CB(PH 9.5)中，將A液逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌4h；

(3)用0.02mol/l PBS 4℃透析3d，每天換3次透析液，得到包被抗原。

4.酶標板的制備

所述酶標板在制備過程中所用到的包被緩沖液為pH9.6的0.05mol/L的碳酸鹽緩沖液，封閉緩沖液為10％的小牛血清溶液。

本發(fā)明酶標板的制備主要為：用包被緩沖液將包被原稀釋成0.2～0.3μg/ml，每孔加入100μl，37℃環(huán)境中避光孵育2h或4℃過夜，傾去孔中液體，洗滌液洗滌1～2次，拍干，每孔中加入150μl封閉液，37℃避光孵育2h，傾去孔中液體拍干，用鋁膜真空密閉保存。

5.羊抗鼠抗抗體的制備

以羊為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原免疫無病原體羊，得到羊抗鼠抗抗體。

6.酶標記羊抗鼠抗抗體(酶標記抗抗體)的制備

將辣根過氧化物酶與抗抗體采用改良后的過碘酸鈉法進行偶聯(lián)，省去了氨基的封閉過程，因為能產生自身氨基連接的氨基實際很少；辣根過氧化物酶∶抗抗體的摩爾濃度比率為2：1，改良后的方法比傳統(tǒng)的方法簡便，對酶的活性的損失減少。

7.單克隆抗體的制備方法

動物免疫：替米考星半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物免疫8-10周齡Balb/c小鼠。

細胞融合與克隆化：取免疫后的鼠脾細胞，與SP2/0骨髓瘤細胞在融合劑聚乙二醇(PEG)4000的作用下融合，篩選獲得能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。

經篩選得到替米考星單克隆雜交瘤細胞株，該雜交瘤細胞株可以無限量的產生替米考星特異性抗體，該抗體特異性是針對替米考星的，靈敏度達到0.5μg/L。

細胞凍存和復蘇：將雜交瘤細胞用凍存液制成1×10⁹個/ml的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)。

實施例二：替米考星酶聯(lián)免疫試劑盒各組分的組建

組建替米考星酶聯(lián)免疫試劑盒，包含下述各組分：

(1)包被有包被原的酶標板。

(2)酶標記抗抗體：辣根過氧化物酶-羊抗鼠抗抗體。

(3)替米考星單克隆抗體工作液。

(4)標準溶液：采用梯度稀釋法配制標準品溶液，得到系列標準品6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L，以及高濃度標準品1mg/L，1mL/瓶。

(5)底物顯色液A液為過氧化脲溶液，底物顯色液B液為四甲基聯(lián)苯胺溶液。

(6)終止液為1～2mol/L的硫酸溶液。

(7)濃縮洗滌液為含1％吐溫-20的0.15～0.2mol/LpH7.4磷酸鹽緩沖液。

(8)樣本稀釋液為pH為7.4的0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液中吐溫-20的含量為0.5％混合溶液配制而成的稀釋液進行稀釋。

實施例三：檢測樣本中殘留的替米考星

1.樣本的前處理

(1)組織(豬肉、雞肉、牛肉、羊肉、魚、蝦)前處理方法

稱取2.0±0.05g均質后的組織樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，分別加入2ml 0.1M(PH＝10.6)CB(稱取0.932g無水碳酸鈉和0.1g碳酸氫鈉加入100ml去離子水溶解混勻)和8ml乙酸乙酯，用渦動儀渦動3min，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；取4ml上層有機相至10ml潔凈干燥玻璃管中，于50-60℃(122-140℉)水浴氮氣流下吹干；加入1ml正已烷，用渦旋儀渦動30s，再加入1ml樣本稀釋液，用渦旋儀渦動30s，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；除去上層，取下層50μl用于分析。

(2)肝臟(雞肝、豬肝)的前處理方法

稱取1.0±0.05g均質后的樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，分別加入2ml 0.5M(PH＝10.6)CB(稱取4.66g無水碳酸鈉和0.5g碳酸氫鈉加入100ml去離子水溶解混勻)和8ml乙酸乙酯，用渦動儀渦動3min，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；取2ml上層有機相至10ml潔凈干燥玻璃管中，于50-60℃(122-140℉)水浴氮氣流下吹干；加入1ml正已烷，用渦旋儀渦動30s，再加入1ml樣本稀釋液，用渦旋儀渦動30s，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；除去上層，取100μl下層加400μl樣本稀釋液，用渦旋儀渦動30s，混勻；取50μl用于分析。

(3)蜂蜜的前處理方法

稱取2.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中，分別加入2ml 0.1M(PH＝10.6)CB，和8ml乙酸乙酯，用渦動儀渦動3min，3000g室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；取2ml上層有機相至10ml潔凈干燥玻璃管中，于50-60℃(122-140℉)水浴氮氣流下吹干；加入1ml樣本稀釋液，用渦旋儀渦動30s，混勻；取50μl用于分析。

(4)雞蛋的前處理方法

用均質器低速均質雞蛋樣本；取100μl均質后的雞蛋樣本加900μl雞蛋稀釋液(取樣本稀釋液與甲醇按19:1體積比混合)，用渦旋儀渦動30s，混勻；取50μl用于分析。

(5)牛奶的前處理方法

取100μl鮮牛奶樣本；加入900μl牛奶稀釋液(取樣本稀釋液與甲醇按19:1體積比混合)，用渦旋儀渦動30s，混勻；取50μl用于分析。

(6)水質的前處理方法

取100μl水質樣本；加入900μl樣本稀釋液，混勻，取50μl用于分析。

2.檢測方法

(1)準備：使用之前將所有試劑和需用板條從冷藏環(huán)境中取出，使溫度回升至室溫(20-25℃)，使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。

(2)加標準品/樣本：加標準品/樣本50μl到對應的微孔中。

(3)抗體工作液和酶標記抗抗體濃縮液的混合：將抗體工作液和酶標記抗抗體濃縮液按10：1體積比混合并混勻。(注：此混合液不能保存，混合均勻后立刻進行加樣)

(4)加抗體工作液和酶標記抗抗體濃縮液的混合液：加抗體工作液和酶標記抗抗體濃縮液的混合液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應30min。

(5)洗板：小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液(用去離子水將20×濃縮洗滌液按1：19體積比進行稀釋)250μl/孔，充分洗滌4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。

(6)顯色：加入底物液A液50μl/孔，再加底物液B液50μl/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中顯色15min，加入終止液50μl/孔，輕輕振蕩混勻。

(7)測定：酶標儀測定每孔的吸光度值，設定酶標儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內讀完數據)。

3.檢測結果分析

標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100％，即得到百分吸光率。以替米考星標準品百分吸光率為縱坐標，以替米考星標準品濃度(μg/L)的對數為橫坐標，繪制標準曲線圖(如圖2)。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中替米考星實際濃度。

實施例四：替米考星試劑盒靈敏度、特異性、精密度和準確度、保存期實驗

1.試劑盒靈敏度測定

按照常規(guī)方法測定試劑盒靈敏度試驗，試劑盒標準曲線最低點為0.5μg/L，標準曲線的范圍為0.5μg/L～40.5μg/L，在組織(豬肉、雞肉、牛肉、羊肉、魚、蝦)中替米考星檢測限為0.5μg/kg，肝臟(雞肝、豬肝)中檢測限為10μg/kg，蜂蜜中檢測限為1μg/kg，雞蛋、牛奶、水質中檢測限為5μg/L。

2.試劑盒準確度和精密度

準確度是指測定值與真值間的符合程度，試劑盒的準確度常用回收率表示；精密度是反應測定方法對某一特定樣本多次測定所得結果的重復程度，常用變異系數表示。分別向空白豬肉、雞肉、牛肉、羊肉、魚、蝦、雞肝、豬肝、蜂蜜、雞蛋、牛奶、水質中添加替米考星至終濃度為2μg/kg，2μg/kg，2μg/kg，2μg/kg，2μg/kg，2μg/kg，20μg/kg，20μg/kg，2μg/kg，10μg/L，10μg/L，10μg/L，重復5次，分別取三個批次的試劑盒計算變異系數，結果見下表。

表1試劑盒的準確度和精密度測定

結果表明，向豬肉中添加至終濃度為2μg/kg，回收率范圍為76.5％～103.0％，向雞肉中添加至終濃度為2μg/kg，回收率范圍為78.0％～103.0％，向牛肉中添加至終濃度為2μg/kg，回收率范圍為78.0％～103.5％，向羊肉中添加至終濃度為2μg/kg，回收率范圍為72.5％～100.5％，向魚中添加至終濃度為2μg/kg，回收率范圍為77.0％～101.5％，向蝦中添加至終濃度為2μg/kg，回收率范圍為78.0％～102.0％，向雞肝中添加至終濃度為20μg/kg，回收率范圍為64.5％～84.0％，向豬肝中添加至終濃度為20μg/kg，回收率范圍為64.0％～84.0％，向蜂蜜中添加至終濃度為2μg/kg，回收率范圍為84.0％～106.0％，向雞蛋中添加至終濃度為10μg/L，回收率范圍為80.2％～108.0％，向牛奶中添加至終濃度為10μg/L，回收率范圍為78.9％～102.5％，向水質中添加至終濃度為10μg/L，回收率范圍為80.2％～107.5％，批內批間變異系數小于20％，符合《農業(yè)部文件》農醫(yī)發(fā)[2005]17號附件2試劑盒備案參考評判標準中第四點精密度和準確度的規(guī)定。

3.交叉反應率試驗

選擇如下所示的替米考星、泰樂菌素2種藥物按照常規(guī)方法分別測定交叉反應率，結果如表2所示。

表2試劑盒的特異性

4.保存期實驗

試劑盒保存條件為2-8℃，經過12個月測定，試劑盒的最大吸光度值、IC50值、替米考星添加實際測定值均在正常范圍之內。同時做加速老化和冷凍試驗，將試劑盒放在37℃、-20℃中7天，測定結果也表明試劑盒的各項指標正常。從以上結果得到替米考星試劑盒可以在2-8℃保存12個月。