一種車前子藥材及其配方顆粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的含量測定方法。

背景技術：

車前子為車前科植物車前Plantago asiatica L.或平車前Plantagodeprossa Willd.的干燥成熟種子。是一種常用中藥，具清熱利尿，滲濕止瀉，明目，祛痰的功效。用于熱淋澀痛，水腫脹滿，暑濕泄瀉，目赤腫痛，痰熱咳嗽。車前子主含黃酮類、三萜類、揮發(fā)油、多糖類及其他等。黃酮類有木犀草素、高車前苷、車前甙等；三萜類有熊果酸、齊墩果酸等；揮發(fā)油有2，6二叔丁基對甲酚、3-叔丁基-4-羥基茴香醚等；糖類有L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖等；其他有京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷等。其質量標準在中國藥典2015年版一部車前子藥材項下，收載了京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的梯度洗脫HPLC定量測定，二種成分的HPLC運行時間是50分鐘。文獻雖有采用HPLC以梯度洗脫的方式，測定鹽制車前子中京尼平苷酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷三成分含量的報道，但運行時間至少也要40分鐘，而且未報道波峰分離圖譜。目前還未查閱到同時測定車前子藥材與其配方顆粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷四種成分的含量報道。在上述背景情況下，為簡便、快捷、多指標控制車前子藥材及其配方顆粒的質量，發(fā)明了以乙腈為A相、0.5％乙酸為B相，采用梯度洗脫方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱溫30℃；檢測波長：京尼平苷酸為239nm、咖啡酸為325nm、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷為330nm；在15分鐘內測定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷四成分含量的快速測定方法。

車前子藥材配方顆粒的制備方法取車前子6500-6700g，分別加水8倍量，煎煮提取二次，每次1-2小時，濾過，濾液70℃減壓濃縮，濃縮液噴霧干燥或70℃減壓干燥，加糊精適量，混勻，制粒成1000g，分裝，即得車前子配方顆粒。

技術實現(xiàn)要素：

以乙腈為A相、0.5％乙酸為B相，采用梯度洗脫方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱溫30℃；檢測波長：京尼平苷酸為239nm、咖啡酸為325nm、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷為330nm；在15分鐘內京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷出峰完畢， 波峰分離良好。方法簡便、快捷、易于普及實施。

通過方法學考察，京尼平苷酸進樣量在0.2921～2.921μg，與峰面積呈良好的線性關系(見表1、圖1)，回歸方程為Y＝52.781X+0.8012，r＝0.9999；咖啡酸進樣量在0.0034～0.0336μg，與峰面積呈良好的線性關系(見表2、圖2)，回歸方程為Y＝171.34X-0.022，r＝0.9997；毛蕊花糖苷進樣量在0.0476～0.476μg，與峰面積呈良好的線性關系(見表3、圖3)，回歸方程為Y＝63.501X-0.005，r＝0.9996；異毛蕊花糖苷進樣量在0.1027～1.027μg，與峰面積呈良好的線性關系(見表4、圖4)，回歸方程為Y＝61.501X-0.031，r＝0.9996。采用加樣回收實驗，結果表明：京尼平苷酸的平均回收率為99.31％，RSD為1.51％(n＝9，見表5)；咖啡酸的平均回收率為98.64％，RSD為1.40％(n＝9，見表6)；毛蕊花糖苷的平均回收率為98.23％，RSD為1.62％(n＝9，見表7)；異毛蕊花糖苷的平均回收率為99.46％，RSD為1.99％(n＝9，見表8)。精密度(見表9)、穩(wěn)定性(見表10)、重復性(見表11)，均符合方法學要求。適用于車前子藥材與其配方顆粒中京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷的含量測定。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案為：

(1)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以乙腈為A相、0.5％乙酸為B相，采用梯度洗脫方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱溫30℃；檢測波長：京尼平苷酸為239nm、咖啡酸為325nm、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷為330nm；理論板數(shù)按京尼平苷酸峰計算應不低于3000；

(2)對照品溶液的制備精密稱取京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷對照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成質量濃度分別為0.2921，0.0034，0.0476，0.1027mg/mL的混合對照品溶液；

(3)供試品溶液的制備取車前子藥材細粉1.5g，精密稱定；或車前子配方顆粒0.5g，研細，精密稱定；分別置棕色具塞錐形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，稱定重量，藥材細粉以功率250W，頻率33kHz超聲處理30分鐘；配方顆粒以功率250W，頻率33kHz超聲處理10分鐘；放冷，再稱定重量，用60％甲醇補足各自減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，用0.45μm的微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；

(4)測定法分別精密吸取上述對照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量(見表12)。

本發(fā)明的原理如下：

京尼平苷酸屬于環(huán)烯醚萜類與糖結合成的苷；咖啡酸屬于酚酸類化合物；毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷則都屬于苯丙素苷類化合物，水解后形成1分子咖啡酸和去咖啡酰毛蕊花糖苷與去咖啡酰異毛蕊花糖苷，都是偏水溶性化合物，易溶于含水醇。從其紫外光譜圖 得知，京尼平苷酸在約239nm(圖5)、咖啡酸在約325nm(圖6)、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷在約330nm(圖7、圖8)有最大吸收，所以選擇其最大吸收為檢測波長，進行含量測定。直接以含水甲醇超聲提取藥材或配方顆粒中的四種成分，濾過后，進樣即可。無萃取、無蒸干、簡便、快捷、實用。通過經時地調整A相和B相體積比，使四種成分在15分鐘內出峰完畢。再依據該四種成分的進樣量在一定范圍內，與其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關系，而用于定量測定。

本發(fā)明的創(chuàng)新點及有益效果如下：

(1)以乙腈為A相、0.5％乙酸為B相，采用梯度洗脫方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱溫30℃；檢測波長：京尼平苷酸為239nm、咖啡酸為325nm、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷為330nm；在15分鐘內使京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷出峰完畢，且波峰分離良好。方法簡便、快捷、易于普及實施，為首次報道。

(2)中國藥典2015年版一部車前子藥材項下，收載的京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的梯度洗脫HPLC定量測定，二種成分的HPLC運行時間是50分鐘。本發(fā)明測定車前子的四種成分，其運行時間才15分鐘，測定效率是藥典方法的3倍以上。

(3)本申請能在15分鐘內，使京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷四成分測定完畢，且波峰分離度良好，其關鍵技術還在于將流動相的流速設定在0.3mL/min，不但節(jié)約了流動相，降低了柱壓力，而且大幅度提高了波峰間的分離度，使了各波峰的保留時間：京尼平苷酸約3分鐘、咖啡酸約6.5分鐘、毛蕊花糖苷約10.7分鐘、異毛蕊花糖苷約12.5分鐘，相互分離度都在3以上，并在15分鐘內運行完畢(見圖9、10、11)。

(4)由本申請的圖9、10、11的測定圖譜與表12的測定數(shù)據，揭示了在藥材規(guī)定的取樣量內未檢測到咖啡酸，而京尼平苷酸和毛蕊花糖苷的含量較高、異毛蕊花糖苷很低，僅為毛蕊花糖苷含量的約1/9；但在配方顆粒中成分的含量發(fā)生了變化，檢測到咖啡酸、且毛蕊花糖苷含量明顯降低，僅為異毛蕊花糖苷含量的約1/6，而異毛蕊花糖苷的含量顯著升高，。說明在加熱提取過程中藥材所含的成分發(fā)生了結構變化，煎煮后用于臨床的都是轉結構后的成分。以四種成分指標控制車前子藥材與其配方顆粒的質量，不但質量可控性提升，而且有利于市場對其質量的監(jiān)督評價。

(5)一般情況下，HPLC的流速都是1mL/min，通過本申請完成，提示在特定的情況下，可以通過流動相組分、比例以及流速，達到高效率、低成本、高分離度、準確，同時測定多種成分的目的。

附圖說明

圖1京尼平苷酸的線性關系圖

圖2咖啡酸的線性關系圖

圖3毛蕊花糖苷的線性關系圖

圖4異毛蕊花糖苷的線性關系圖

圖5京尼平苷酸的光譜掃描圖

圖6咖啡酸的的光譜掃描圖

圖7毛蕊花糖苷的光譜掃描圖

圖8異毛蕊花糖苷的光譜掃描圖

圖9為京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷對照品HPLC色譜圖

圖10為車前子藥材HPLC色譜圖

圖11為車前子配方顆粒HPLC色譜圖

圖1、圖2、圖3、圖4縱坐標為峰面積；橫坐標為進樣量(μg)

圖5、圖6、圖7、圖8縱坐標為吸收強度(mAU)；橫坐標為吸收波長(nm)

圖9、圖10、圖11中，1.京尼平苷酸 2.咖啡酸 3.毛蕊花糖苷 4.異毛蕊花糖苷

本發(fā)明具體實施方式

實施例1：

(1))色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以乙腈為A相、0.5％乙酸為B相，采用梯度洗脫方式，即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱溫30℃；檢測波長：京尼平苷酸為239nm、咖啡酸為325nm、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷為330nm；理論板數(shù)按京尼平苷酸峰計算應不低于3000；

(2)對照品溶液的制備精密稱取京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷對照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成質量濃度分別為0.2921，0.0034，0.0476，0.1027mg/mL的混合對照品溶液；

(3)供試品溶液的制備取車前子藥材細粉1.5g，精密稱定，置棕色具塞錐形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，稱定重量，以功率250W，頻率33kHz超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用60％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45μm的微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；

(4)測定法分別精密吸取上述對照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量。

實施例2：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以乙腈為A相、0.5％乙酸為B相，采用梯度洗脫方式， 即0～1min，6％～15％A；1～13min，15％～20％A；13～13.5min，20％～6％A；13.5～20min，6％A；流速0.3mL/min；柱溫30℃；檢測波長：京尼平苷酸為239nm、咖啡酸為325nm、毛蕊花糖苷和異毛蕊花糖苷為330nm；理論板數(shù)按京尼平苷酸峰計算應不低于3000；

(2)對照品溶液的制備精密稱取京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷對照品適量，置棕色量瓶中，加甲醇制成質量濃度分別為0.2921，0.0034，0.0476，0.1027mg/mL的混合對照品溶液；

(3)供試品溶液的制備取車前子配方顆粒0.5g，研細，精密稱定；置棕色具塞錐形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，稱定重量，以功率250W，頻率33kHz超聲處理10分鐘，放冷，再稱定重量，用60％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液用0.45μm的微孔濾膜濾過，續(xù)濾液作為供試品溶液；

(4)測定法分別精密吸取上述對照品溶液與供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，測定京尼平苷酸、咖啡酸、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷的含量。

表1京尼平苷酸進樣量與峰面積

表2咖啡酸進樣量與峰面積

表3毛蕊花糖苷進樣量與峰面積

表4異毛蕊花糖苷進樣量與峰面積

表5樣品中京尼平苷酸的回收率試驗結果

表6樣品中咖啡酸的回收率試驗結果

表7樣品中毛蕊花糖苷的回收率試驗結果

表8樣品中異毛蕊花糖苷的回收率試驗結果

表9精密度實驗結果(峰面積)

表10穩(wěn)定性實驗結果(峰面積)

表11重復性試驗結果(mg/g)

表12車前子藥材和配方顆粒的含量測定結果(mg/g)

注：回收率試驗中，為降低京尼平苷酸和異毛蕊花糖苷對照品用量，其總體積是5ml，取樣量降低到25ml的1/5，即0.05g。