本發(fā)明涉及技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種禽肉中特布他林檢測(cè)方法及檢測(cè)盒。
背景技術(shù)：
特布他林屬于β—興奮劑，β—興奮劑時(shí)一類化學(xué)合成的苯乙醇胺類衍生物，β—興奮劑作用機(jī)理和腎上腺、去甲腎上腺素相同，可影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在動(dòng)物體內(nèi)的流向和重新分配，有效促進(jìn)肌肉組織生長(zhǎng)，降低胴體脂肪含量，提高瘦肉率和增加瘦肉產(chǎn)量，但是β—興奮劑具有類似腎上腺素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，而且這類化合物作為促生長(zhǎng)劑的用量一般較高，一般為治療用量的5-10倍，事實(shí)表明此類藥物不易破壞，應(yīng)用于禽類的飼料添加劑時(shí)，如果在屠宰前沒有經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的體藥期，則在肌肉和內(nèi)臟器官會(huì)殘留較高濃度的藥物，如果人長(zhǎng)期食用含有這些殘留藥物的禽肉，就會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，如心悸、頭疼、目眩、惡心、嘔吐、戰(zhàn)栗、神經(jīng)過(guò)敏、血管擴(kuò)張、心率加快等，尤其是對(duì)高血壓、心臟病、糖尿病、甲亢患者危害更大，嚴(yán)重的可導(dǎo)致死亡，雖然我國(guó)已經(jīng)禁止瘦肉精的使用，但是定期的對(duì)禽肉制品進(jìn)行特布他林殘留的檢測(cè)依然是一個(gè)必要的監(jiān)控手段。
目前，檢測(cè)特布他林的方法主要有：微生物法、薄層色譜法(TLC)、放射免疫法，高效液相色譜法(HPLC)、色/質(zhì)聯(lián)用分析法(LC-MS )、液/質(zhì)聯(lián)用分析法、微生物法的缺陷是：費(fèi)時(shí)而且缺乏特異性。薄層色譜法的缺陷是：操作過(guò)程復(fù)雜，時(shí)間長(zhǎng)；操作人員需要經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)；影響分析的干擾因素較多，結(jié)果重復(fù)性差。薄層色譜法、高效液相色譜法、色/質(zhì)連用分析法、液/質(zhì)聯(lián)用分析法這些理化方法的缺陷是儀器設(shè)備昂貴，費(fèi)時(shí)，費(fèi)力，不適合作為大量篩選檢測(cè)的推廣，檢測(cè)費(fèi)用高，而且得到的檢測(cè)結(jié)果不直觀。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于背景技術(shù)存在的技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種禽肉中特布他林檢測(cè)方法及檢測(cè)盒。
本發(fā)明提出一種禽肉中特布他林檢測(cè)方法，所述檢測(cè)方法包括以下步驟：
S1，取新鮮的禽肉，剪除禽肉樣本中的脂肪得到肌肉組織，對(duì)禽肉樣本進(jìn)行粉碎；
S2，取1支50ml試管和2支50ml的離心管，分別標(biāo)記為管A、管B和管C，從S1中粉碎后的禽肉樣品中取出3-5g放置與管A中，向管A中加入4-7ml濃度為1-1.5mol/L的鹽酸溶液并進(jìn)行混合，使用超聲波提取20min，然后靜置待其自然沉淀，取上清液2-4ml至管B待用；
S3，向管B中加入3-5ml濃度為8-11mol/L的NaON溶液將管B中上清液PH值調(diào)至9.0，手動(dòng)震蕩1min，將管B放入離心機(jī)6000r/min離心10min，取3-5ml上清液至管C中待用；
S4，向管C中加入300-500μL濃度為1-1.5mol/L的洗滌溶液和100-300μL濃度為1-1.5mmol/L的氯化鈣溶液，輕輕吹打液體潤(rùn)洗管C內(nèi)壁，吹打時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，將管C放入離心機(jī)，在4000r/min下離心1min，分離出有機(jī)相，水相使用濃度為3-5mol/L異丁醇萃取兩次（每次5ml），將萃取液置于55-60℃水浴減壓蒸干，殘余物用0.5-1mol/L洗滌液溶解配成1：8的溶液，得到待測(cè)樣品溶液；
S5，向酶標(biāo)板微孔中分別加入兩份60μL樣品溶液，然后一份加入特布他林抗體溶液60μL，在25℃的環(huán)境中培育2h；
S6，將酶標(biāo)板微孔中的液體倒出，每個(gè)微孔中加入260μL的洗滌溶液，洗滌后拍干，每個(gè)微孔加入發(fā)光溶液120μL，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定每個(gè)微孔的發(fā)光強(qiáng)度；
將測(cè)得的加入特布他林抗體溶液樣品的發(fā)光值除以沒加入特布他林抗體溶液樣品的發(fā)光值在乘以100%得到樣品中特布他林濃度。
優(yōu)選的，所述S2中超聲波提取所選用的超聲頻率為40KHZ。
優(yōu)選的，所述S1中粉碎后的禽肉在雙氧水中消毒2min。
一種禽肉中特布他林檢測(cè)盒，所述檢測(cè)盒的內(nèi)部放置有酶標(biāo)板和試劑，其中酶標(biāo)板的各個(gè)微孔內(nèi)包被有抗原，抗原為特布他林和卵清蛋白偶合制成，試劑包括氯化鈣溶液、發(fā)光溶液和洗滌溶液。
優(yōu)選的，所述洗滌溶液為含有137mmol/L的NaOH、2.7mmol/L的KCL、44.3mmol/L的Na2HPO和41.4mmol/L的KH2PO。
優(yōu)選的，所述發(fā)光溶液為使用PH值為9的0.0001mol/L對(duì)甲苯酚和三氨基甲烷溶液配制成0.01mol/L的魯米諾溶液，再與H2O2按照3：10000的體積混合。
優(yōu)選的，所述特布他林抗體溶液使用人工免疫抗原免疫動(dòng)物制備所得的多克隆抗體，使用洗滌溶液稀釋得到1：500的濃度。
優(yōu)選的，所述氯化鈣溶液的濃度為130mmol/L。
有益效果
本發(fā)明提供了一種禽肉中特布他林檢測(cè)方法及檢測(cè)盒，具備以下有益效果：
該禽肉中特布他林檢測(cè)方法，通過(guò)向管C中加入300-500μL濃度為1-1.5mol/L的洗滌溶液和100-300μL濃度為1-1.5mmol/L的氯化鈣溶液，將管C放入離心機(jī)，在4000r/min下離心1min，分離出有機(jī)相，水相使用濃度為3-5mol/L異丁醇萃取兩次（每次5ml），將萃取液置于55-60℃水浴減壓蒸干，殘余物用0.5-1mol/L洗滌液溶解配成1：8的溶液，得到待測(cè)樣品溶液，操作簡(jiǎn)便，對(duì)技術(shù)人員水平要求較低，檢測(cè)費(fèi)用也相對(duì)降低，能夠得到純度較高的樣品溶液，有效的提高檢測(cè)的成功率，達(dá)到了省時(shí)省力，節(jié)約成本的效果，將酶標(biāo)板微孔中的液體倒出，每個(gè)微孔中加入260μL的洗滌溶液，洗滌后拍干，每個(gè)微孔加入發(fā)光溶液120μL，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定每個(gè)微孔的發(fā)光強(qiáng)度，得到禽肉中特布他林的濃度數(shù)據(jù)，檢測(cè)結(jié)果相比其他檢測(cè)方法更加直觀，適合作為大量篩選檢測(cè)的推廣。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
本發(fā)明提供了一種技術(shù)方案，一種禽肉中特布他林檢測(cè)盒，檢測(cè)盒的內(nèi)部放置有酶標(biāo)板和試劑，其中酶標(biāo)板的各個(gè)微孔內(nèi)包被有抗原，抗原為特布他林和卵清蛋白偶合制成，試劑包括氯化鈣溶液、發(fā)光溶液和洗滌溶液，洗滌溶液為含有137mmol/L的NaOH、2.7mmol/L的KCL、44.3mmol/L的Na2HPO和41.4mmol/L的KH2PO，發(fā)光溶液為使用PH值為9的0.0001mol/L對(duì)甲苯酚的三氨基甲烷溶液配制成0.01mol/L的魯米諾溶液，再與H2O2按照3：10000的體積混合，特布他林抗體溶液使用人工免疫抗原免疫動(dòng)物制備所得的多克隆抗體，使用洗滌溶液稀釋得到1：500的濃度，氯化鈣溶液的濃度為130mmol/L。
實(shí)施例一
本發(fā)明提供了一種技術(shù)方案，一種禽肉中特布他林檢測(cè)方法，檢測(cè)方法包括以下步驟：
S1，取新鮮的禽肉，剪除禽肉樣本中的脂肪得到肌肉組織，對(duì)禽肉樣本進(jìn)行粉碎，禽肉粉碎后放置在雙氧水中消毒2min后取出待用，殺死粉碎過(guò)程中禽肉可能沾染的細(xì)菌，避免其影響試驗(yàn)結(jié)果；
S2，取1支50ml試管和2支50ml的離心管，分別標(biāo)記為管A、管B和管C，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未使用的試管和離心管要在無(wú)菌環(huán)境中存放待用，從S1中粉碎后的禽肉樣品中取出3g放置與管A中，向管A中加入4ml濃度為1mol/L的鹽酸溶液并進(jìn)行混合，使用超聲波提取20min，然后靜置待其自然沉淀，取上清液2ml至管B待用；
S3，向管B中加入3ml濃度為8mol/L的NaON溶液將管B中上清液PH值調(diào)至9.0，手動(dòng)震蕩1min，將管B放入離心機(jī)6000r/min離心10min，取3ml上清液至管C中待用；
S4，向管C中加入300μL濃度為1mol/L的洗滌溶液和100μL濃度為1mmol/L的氯化鈣溶液，輕輕吹打液體潤(rùn)洗管C內(nèi)壁，吹打時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，將管C放入離心機(jī)，在4000r/min下離心1min，分離出有機(jī)相，水相使用濃度為3mol/L異丁醇萃取兩次（每次5ml），將萃取液置于55-60℃水浴減壓蒸干，殘余物用0.5mol/L洗滌液溶解配成1：8的溶液，得到待測(cè)樣品溶液；
S5，向酶標(biāo)板微孔中分別加入兩份60μL樣品溶液，然后一份加入特布他林抗體溶液60μL，在25℃的環(huán)境中培育2h；
S6，將酶標(biāo)板微孔中的液體倒出，每個(gè)微孔中加入260μL的洗滌溶液，洗滌后拍干，每個(gè)微孔加入發(fā)光溶液120μL，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定每個(gè)微孔的發(fā)光強(qiáng)度；
將測(cè)得的加入特布他林抗體溶液樣品的發(fā)光值除以沒加入特布他林抗體溶液樣品的發(fā)光值在乘以100%得到樣品中特布他林濃度。
該實(shí)施例一與實(shí)施例二和實(shí)施例三相比具有以下特點(diǎn)：
準(zhǔn)確度高，需要的樣本量較少。
實(shí)施例二
本發(fā)明提供了一種技術(shù)方案，一種禽肉中特布他林檢測(cè)方法，檢測(cè)方法包括以下步驟：
S1，取新鮮的禽肉，剪除禽肉樣本中的脂肪得到肌肉組織，對(duì)禽肉樣本進(jìn)行粉碎，禽肉粉碎后放置在雙氧水中消毒2min后取出待用，殺死粉碎過(guò)程中禽肉可能沾染的細(xì)菌，避免其影響試驗(yàn)結(jié)果；
S2，取1支50ml試管和2支50ml的離心管，分別標(biāo)記為管A、管B和管C，從S1中粉碎后的禽肉樣品中取出4g放置與管A中，向管A中加入5ml濃度為1.3mol/L的鹽酸溶液并進(jìn)行混合，使用超聲波提取20min，然后靜置待其自然沉淀，取上清液3ml至管B待用；
S3，向管B中加入4ml濃度為9mol/L的NaON溶液將管B中上清液PH值調(diào)至9.0，手動(dòng)震蕩1min，將管B放入離心機(jī)6000r/min離心10min，取4ml上清液至管C中待用；
S4，向管C中加入400μL濃度為1.3mol/L的洗滌溶液和200μL濃度為1.2mmol/L的氯化鈣溶液，輕輕吹打液體潤(rùn)洗管C內(nèi)壁，吹打時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，將管C放入離心機(jī)，在4000r/min下離心1min，分離出有機(jī)相，水相使用濃度為4mol/L異丁醇萃取兩次（每次5ml），將萃取液置于55-60℃水浴減壓蒸干，殘余物用0.7mol/L洗滌液溶解配成1：8的溶液，得到待測(cè)樣品溶液；
S5，向酶標(biāo)板微孔中分別加入兩份60μL樣品溶液，然后一份加入特布他林抗體溶液60μL，在25℃的環(huán)境中培育2h；
S6，將酶標(biāo)板微孔中的液體倒出，每個(gè)微孔中加入260μL的洗滌溶液，洗滌后拍干，每個(gè)微孔加入發(fā)光溶液120μL，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定每個(gè)微孔的發(fā)光強(qiáng)度；
將測(cè)得的加入特布他林抗體溶液樣品的發(fā)光值除以沒加入特布他林抗體溶液樣品的發(fā)光值在乘以100%得到樣品中特布他林濃度。
該實(shí)施例二與實(shí)施例一和實(shí)施例三相比具有以下特點(diǎn)：
檢測(cè)結(jié)果等待時(shí)間短，準(zhǔn)確度相對(duì)較低。
實(shí)施例三
本發(fā)明提供了一種技術(shù)方案，一種禽肉中特布他林檢測(cè)方法，檢測(cè)方法包括以下步驟：
S1，取新鮮的禽肉，剪除禽肉樣本中的脂肪得到肌肉組織，對(duì)禽肉樣本進(jìn)行粉碎，禽肉粉碎后放置在雙氧水中消毒2min后取出待用，殺死粉碎過(guò)程中禽肉可能沾染的細(xì)菌，避免其影響試驗(yàn)結(jié)果；
S2，取1支50ml試管和2支50ml的離心管，分別標(biāo)記為管A、管B和管C，從S1中粉碎后的禽肉樣品中取出5g放置與管A中，向管A中加入7ml濃度為1.5mol/L的鹽酸溶液并進(jìn)行混合，使用超聲波提取20min，然后靜置待其自然沉淀，取上清液4ml至管B待用；
S3，向管B中加入5ml濃度為11mol/L的NaON溶液將管B中上清液PH值調(diào)至9.0，手動(dòng)震蕩1min，將管B放入離心機(jī)6000r/min離心10min，取5ml上清液至管C中待用；
S4，向管C中加入500μL濃度為1.5mol/L的洗滌溶液和300μL濃度為1.5mmol/L的氯化鈣溶液，輕輕吹打液體潤(rùn)洗管C內(nèi)壁，吹打時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡，將管C放入離心機(jī)，在4000r/min下離心1min，分離出有機(jī)相，水相使用濃度為5mol/L異丁醇萃取兩次（每次5ml），將萃取液置于55-60℃水浴減壓蒸干，殘余物用1mol/L洗滌液溶解配成1：8的溶液，得到待測(cè)樣品溶液；
S5，向酶標(biāo)板微孔中分別加入兩份60μL樣品溶液，然后一份加入特布他林抗體溶液60μL，在25℃的環(huán)境中培育2h；
S6，將酶標(biāo)板微孔中的液體倒出，每個(gè)微孔中加入260μL的洗滌溶液，洗滌后拍干，每個(gè)微孔加入發(fā)光溶液120μL，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定每個(gè)微孔的發(fā)光強(qiáng)度；
將測(cè)得的加入特布他林抗體溶液樣品的發(fā)光值除以沒加入特布他林抗體溶液樣品的發(fā)光值在乘以100%得到樣品中特布他林濃度。
該實(shí)施例三與實(shí)施例一和實(shí)施例二相比具有以下特點(diǎn)：
檢測(cè)結(jié)果等待時(shí)間短，準(zhǔn)確度高，需要樣品量大。
綜上所述，該禽肉中特布他林檢測(cè)方法，通過(guò)向管C中加入300-500μL濃度為1-1.5mol/L的洗滌溶液和100-300μL濃度為1-1.5mmol/L的氯化鈣溶液，將管C放入離心機(jī)，在4000r/min下離心1min，分離出有機(jī)相，水相使用濃度為3-5mol/L異丁醇萃取兩次（每次5ml），將萃取液置于55-60。C水浴減壓蒸干，殘余物用0.5-1mol/L洗滌液溶解配成1：8的溶液，得到待測(cè)樣品溶液，操作簡(jiǎn)便，對(duì)技術(shù)人員水平要求較低，檢測(cè)費(fèi)用也相對(duì)降低，能夠得到純度較高的樣品溶液，有效的提高檢測(cè)的成功率，達(dá)到了省時(shí)省力，節(jié)約成本的效果，將酶標(biāo)板微孔中的液體倒出，每個(gè)微孔中加入260μL的洗滌溶液，洗滌后拍干，每個(gè)微孔加入發(fā)光溶液120μL，使用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測(cè)定每個(gè)微孔的發(fā)光強(qiáng)度，得到禽肉中特布他林的濃度數(shù)據(jù)，檢測(cè)結(jié)果相比其他檢測(cè)方法更加直觀，適合作為大量篩選檢測(cè)的推廣。
需要說(shuō)明的是，在本文中，諸如第一和第二等之類的關(guān)系術(shù)語(yǔ)僅僅用來(lái)將一個(gè)實(shí)體或者操作與另一個(gè)實(shí)體或操作區(qū)分開來(lái)，而不一定要求或者暗示這些實(shí)體或操作之間存在任何這種實(shí)際的關(guān)系或者順序。而且，術(shù)語(yǔ)“包括”、“包含”或者其任何其他變體意在涵蓋非排他性的包含，從而使得包括一系列要素的過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備不僅包括那些要素，而且還包括沒有明確列出的其他要素，或者是還包括為這種過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備所固有的要素。在沒有更多限制的情況下。由語(yǔ)句“包括一個(gè)......限定的要素，并不排除在包括所述要素的過(guò)程、方法、物品或者設(shè)備中還存在另外的相同要素”。
盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。