本發(fā)明屬于納米傳感器領(lǐng)域，具體涉及一種多功能化的鐵鈷磁性納米傳感器的制備方法及其產(chǎn)品和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

構(gòu)建一個(gè)高靈敏的傳感平臺(tái)，并用于定量檢測(cè)離子、蛋白和DNA，一直以來是環(huán)境檢測(cè)，臨床實(shí)驗(yàn)和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的焦點(diǎn)。近年來，電致化學(xué)發(fā)光(ECL)作為一個(gè)強(qiáng)有力的分析技術(shù)，在生物分析擁有較大的潛力，原因在于其簡(jiǎn)化了光學(xué)設(shè)置，擁有較低的背景信號(hào)和高的靈敏度。然而，幾乎所有的ECL生物傳感器都是異相分析模式(比如，金電極和玻璃碳電極表面的分析)，其通常伴隨著一些固有缺點(diǎn)：(1)有限的反應(yīng)區(qū)域和本身存在的位阻導(dǎo)致識(shí)別探針具有相對(duì)較慢的結(jié)合動(dòng)力學(xué)和較低的識(shí)別效率，從而導(dǎo)致低的靈敏度和選擇性；(2)電極的污染會(huì)導(dǎo)致相對(duì)較低的再現(xiàn)性；(3)發(fā)光體具有較低的ECL效率，導(dǎo)致相對(duì)較低的靈敏度。因此，構(gòu)建一個(gè)高靈敏和選擇性的傳感平臺(tái)用于目標(biāo)物的檢測(cè)是具有非常重要的意義。

目前，磁性傳感器作為納米平臺(tái)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用在均相的體系中，因?yàn)槠浯判约{米載體具有以下特點(diǎn)：(1)在準(zhǔn)均相體系中，磁性納米載體在水相和固相之間作為一個(gè)“橋梁”，可以擴(kuò)大反應(yīng)面積和改善空間位阻；(2)磁性納米載體具有較大的比表面積和優(yōu)異的磁特性，可允許多個(gè)生物分子識(shí)別，且從混合溶液中快速、方便地分離出來。常見的是Fe₃O₄磁性納米粒子(MNPs)作為磁性納米傳感器的納米載體。

雖然Fe₃O₄MNPs構(gòu)建的磁性納米傳感器擁有上述的優(yōu)點(diǎn)，然而為了改善磁性納米傳感器的靈敏度和選擇性，進(jìn)一步去探索多功能化磁性納米載體具有更重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種多功能化的鐵鈷磁性納米傳感器的制備方法及產(chǎn)品，通過水熱法簡(jiǎn)單地合成了一種分散良好的、小尺寸的鐵鈷磁性納米顆粒，簡(jiǎn)稱“CoFe₂O₄MNPs”，所制備的CoFe₂O₄MNPs可以作為一種新的共反應(yīng)促進(jìn)劑，能夠顯著提高混合氨基化苝衍生物(PTC-NH2)的發(fā)光效率；本發(fā)明的目的之二在于提供所述鐵鈷磁性納米傳感器的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，具體提供了如下的技術(shù)方案：

1、一種多功能化的鐵鈷磁性納米傳感器的制備方法，包括如下步驟：

1)CoFe₂O₄磁性納米顆粒的制備：將Co(NO₃)₂·6H₂O與FeC1₃·6H₂O溶解于乙二醇中得到澄清的溶液，然后向溶液中依次加入醋酸鈉、尿素和聚乙二醇攪拌得到紅棕色混合物，將紅棕色混合物轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼反應(yīng)釜中在溫度為150～200℃反應(yīng)大約8～12小時(shí)。最后，進(jìn)一步離心得到黑色沉淀物，將黑色沉淀物在磁場(chǎng)下交替用去離子水和乙醇洗滌，進(jìn)一步干燥得到CoFe₂O₄磁性納米顆粒；

2)多巴胺功能化CoFe₂O₄磁性納米顆粒的制備：將步驟1)得到的CoFe₂O₄磁性納米顆粒超聲溶解于四氫呋喃溶液中，進(jìn)一步加入多巴胺水溶液并超聲，進(jìn)一步使用醋酸溶液調(diào)節(jié)混合溶液(不能使用其它酸性物質(zhì)替代)調(diào)節(jié)混合溶液pH值為4.0～5.0，然后放在搖床上混合過夜離心得固體產(chǎn)品，將固體在磁場(chǎng)下交替用去離子水和乙醇洗滌后，進(jìn)一步干燥獲得多巴胺功能化CoFe₂O₄磁性納米顆粒，將所述顆粒與去離子水混合，將混合液備用；

3)nano-Au@CoFe₂O₄磁性納米顆粒的制備：將納米金膠體溶液加入步驟2)得到的混合液中，繼續(xù)在在搖床上混合，進(jìn)一步離心得固體納米顆粒，在磁場(chǎng)下交替用去離子水和乙醇洗滌后，獲得nano-Au@CoFe₂O₄磁性納米顆粒，并溶解于Tris-HCl緩沖溶液中，在4℃條件下存儲(chǔ)備用；

4)多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器的制備：將5'和3'分別修飾疊氮基和巰基的DNA1鏈與步驟3)得到的溶液混合并保持至4℃，然后加入正己硫醇溶液并保持至4℃，進(jìn)一步離心得固體，在磁場(chǎng)下交替用去離子水和乙醇洗滌后，獲得多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器，并分散于Tris-HCl緩沖溶液中，在4℃條件存儲(chǔ)。

優(yōu)選的，步驟1)所述Co(NO₃)₂·6H₂O與FeC1₃·6H₂O摩爾比為1:2，所述Co(NO₃)₂·6H₂O、醋酸鈉、尿素和聚乙二醇加入比例范范圍為0.05：1：1：0.03。

優(yōu)選的，步驟2)所述多巴胺水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0％～2.0％，所述CoFe₂O₄磁性納米顆粒與多巴胺水溶液的質(zhì)量比為1：100。

優(yōu)選的，步驟3)所述納米金膠體溶液與多巴胺功能化CoFe₂O₄磁性納米顆粒的質(zhì)量比為800：1。

優(yōu)選的，步驟4)所述正己硫醇溶液的濃度為1.0mM，所述DNA1鏈、nano-Au@CoFe₂O₄磁性納米顆粒與正己硫醇溶液的質(zhì)量比為1×10^-4：1：0.2。

優(yōu)選的，步驟3)與步驟4)所述Tris-HCl緩沖溶液的pH值為7.4。

2、所述方法制備而成的多功能化的鐵鈷磁性納米傳感器。

3、所述多功能化的鐵鈷磁性納米傳感器定量檢測(cè)離子、蛋白和DNA的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明基于雙重放大策略“共反應(yīng)促進(jìn)劑放大策略和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)放大策略”，多功能化CoFe₂O₄磁性納米傳感器成功的構(gòu)建并成功的應(yīng)用于Cu²⁺的檢測(cè)。本發(fā)明的檢測(cè)體系具有以下幾個(gè)顯著的優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明所制備的CoFe₂O₄磁性納米納米顆粒作為一種新的ECL共反應(yīng)促進(jìn)劑系統(tǒng)，可顯著提高PTC-NH₂的ECL發(fā)光效率；(2)所制備的CoFe₂O₄磁性納米納米顆粒作為納米載體，具有優(yōu)異的磁性性能可允許快速的分離和大的比表面積允許多個(gè)生物分子識(shí)別事件的發(fā)生；在準(zhǔn)均相體系中，所制備的CoFe₂O₄磁性納米載體在水相和固相之間作為一個(gè)“橋梁”，可以擴(kuò)大反應(yīng)面積和改善空間位阻。因此，本發(fā)明所制備的多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器應(yīng)用于Cu²⁺的檢測(cè)，顯示出較高的靈敏度、優(yōu)異的選擇性和良好的重現(xiàn)性。另外，多功能化的CoFe₂O₄磁性納米顆粒，也能成為其他分析物檢測(cè)的一個(gè)可靠的和靈敏的平臺(tái)。

附圖說明

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：

圖1中A表示多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器對(duì)不同濃度的Cu²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液的ECL響應(yīng)曲線，B表示ECL信號(hào)強(qiáng)度值與Cu²⁺濃度的對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2中A、B分別表示多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器的選擇性和穩(wěn)定性。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1

多功能化的鐵鈷磁性納米傳感器的制備方法如下：

1)CoFe₂O₄磁性納米顆粒的制備：將Co(NO₃)₂·6H₂O與FeC1₃·6H₂O溶解于乙二醇中得到澄清的溶液，然后向溶液中依次加入醋酸鈉、尿素和聚乙二醇攪拌得到紅棕色混合物，將紅棕色混合物轉(zhuǎn)入聚四氟乙烯內(nèi)襯不銹鋼反應(yīng)釜中在150～200℃反應(yīng)大約8～12小時(shí)。最后，進(jìn)一步離心得到黑色沉淀物，將黑色沉淀物在磁場(chǎng)下交替用去離子水和乙醇洗滌，進(jìn)一步干燥得到CoFe₂O₄磁性納米顆粒；

2)多巴胺功能化CoFe₂O₄磁性納米顆粒的制備：將步驟1)得到的CoFe₂O₄磁性納米顆粒超聲溶解于四氫呋喃溶液中，進(jìn)一步加入多巴胺水溶液并超聲混合，進(jìn)一步使用醋酸溶液(不

能使用其它酸性物質(zhì)替代)調(diào)節(jié)混合溶液pH值為4.0～5.0，然后放在搖床上混合過夜離心得固體產(chǎn)品，將固體在磁場(chǎng)下交替用去離子水和乙醇洗滌后，進(jìn)一步干燥獲得多巴胺功能化CoFe₂O₄磁性納米顆粒，將所述顆粒與去離子水混合，將混合液備用；

3)nano-Au@CoFe₂O₄磁性納米顆粒的制備：將納米金膠體溶液加入步驟2)得到的混合液中，繼續(xù)在在搖床上混合，進(jìn)一步離心得固體納米顆粒，在磁場(chǎng)下交替用去離子水和乙醇洗滌后，獲得nano-Au@CoFe₂O₄磁性納米顆粒，并溶解于Tris-HCl緩沖溶液中，在4℃條件下存儲(chǔ)備用；

4)多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器的制備：將5'和3'分別修飾疊氮基和巰基的DNA1鏈與步驟3)得到的溶液混合并保持至4℃，然后加入正己硫醇溶液并保持至4℃，進(jìn)一步離心得固體，在磁場(chǎng)下交替用去離子水和乙醇洗滌后，獲得多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器，并分散于Tris-HCl緩沖溶液中，在4℃條件存儲(chǔ)。

本實(shí)施例中，步驟1)所述Co(NO₃)₂·6H₂O與FeC1₃·6H₂O摩爾比為1:2，所述Co(NO₃)₂·6H₂O、醋酸鈉、尿素和聚乙二醇加入比例范圍為0.05：1：1：0.03。

本實(shí)施例中，步驟2)所述多巴胺水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0％～2.0％，所述CoFe₂O₄磁性納米顆粒與多巴胺水溶液的質(zhì)量比為1：100。

本實(shí)施例中，步驟3)所述納米金膠體溶液與多巴胺功能化CoFe₂O₄磁性納米顆粒的質(zhì)量比為800：1。

本實(shí)施例中，步驟4)所述正己硫醇溶液的濃度為1.0mM，所述DNA1鏈、nano-Au@CoFe₂O₄磁性納米顆粒與正己硫醇溶液的質(zhì)量比為1×10^-4：1：0.2。本實(shí)施例中，步驟3)與步驟4)所述Tris-HCl緩沖溶液的pH值為7.4。

應(yīng)用實(shí)施例1

采用該多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器的對(duì)Cu²⁺的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行了檢測(cè)，具體方法如下：

1)將制備好的多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器與3'修飾炔基的DNA2鏈DNA2(作為引發(fā)鏈)溶液混合后。然后，加入不同濃度Cu²⁺溶液(含抗壞血酸溶液)于上述溶液中，混合之后，可以通過Click反應(yīng)使引發(fā)鏈DNA2與DNA1鏈接在一起。

2)發(fā)夾探針1(H1)和發(fā)夾探針2(H2)溶液(使用前，所有的發(fā)夾探針被加熱到95℃約5分鐘，然后在室溫下冷卻約1小時(shí))加入上述溶液中后，繼續(xù)混合，進(jìn)而DNA2可以引發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，從而生成很長(zhǎng)的雙鏈DNA聚合物。

3)加入ECL信號(hào)探針PTC-NH₂溶液，繼續(xù)在室溫下混合，進(jìn)而使PTC-NH₂分子通過靜電吸附、分子間的疏水性和π-π堆積作用嵌入到雙鏈DNA槽中。值得注意的是，在實(shí)驗(yàn)中的每一步的產(chǎn)物，都是在磁場(chǎng)條件下，用去離子水沖洗除去物理吸附物種。

4)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)采用自制的三電極體系，即是Ag/AgCl(飽和KCl)作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，金片(GCP，直徑為1.45厘米)在有/無磁場(chǎng)作用下作為工作電極。在準(zhǔn)均相體系中，所得到的磁性產(chǎn)品中加入檢測(cè)底液中，用自制的三電極系統(tǒng)檢測(cè)(在磁場(chǎng)作用下)中檢測(cè)。在工作電壓范圍是-2.0至0V(vs.Ag/AgCl)，掃描描速率為0.3V/S和電壓為800V的光電倍增管中檢測(cè)。

5)其多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器對(duì)不同濃度的Cu²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液的ECL響應(yīng)曲線，具體結(jié)果見圖1(A)。將三次測(cè)的ECL信號(hào)強(qiáng)度求平均值，與Cu²⁺濃度的對(duì)數(shù)作圖，圖1(B)為標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性響應(yīng)范圍為1.0×10^-13mol/L～1.0×10^-7mol/L。

由圖1A可反映出該多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器的對(duì)Cu²⁺的標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度效應(yīng)很靈敏，由圖1B可反映出ECL信號(hào)強(qiáng)度值與Cu²⁺濃度的對(duì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線其線性關(guān)系非常好。

應(yīng)用實(shí)施例2該多功能化的CoFe2O4磁性納米傳感器的選擇性和穩(wěn)定性檢測(cè)

為了進(jìn)一步研究該多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器的實(shí)用價(jià)值。我們使用該傳感器檢測(cè)方法對(duì)干擾離子的樣品進(jìn)行了檢測(cè)，其結(jié)果和標(biāo)準(zhǔn)的Cu²⁺方法檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)照。具體步驟如下：

1)將制備好的多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器分別與1.0×10^-5mol/L干擾離子和1.0×10^-7mol/L Cu²⁺的樣品溶液反應(yīng)。反應(yīng)完成后用去離子水沖洗去掉未結(jié)合的物質(zhì)。

2)電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)采用自制的三電極體系，即是Ag/AgCl(飽和KCl)作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，金片(GCP，直徑為1.45厘米)在有/無磁場(chǎng)作用下作為工作電極。在準(zhǔn)均相體系中，所得到的磁性產(chǎn)品中加入檢測(cè)底液中，用自制的三電極系統(tǒng)檢測(cè)(在磁場(chǎng)作用下)中檢測(cè)。在工作電壓范圍是-2.0至0V(vs.Ag/AgCl)，掃描描速率為0.3V/S和電壓為800V的光電倍增管中檢測(cè)。

3)其ECL信號(hào)與干擾離子濃度的緊密相關(guān)被測(cè)定，將三次ECL信號(hào)強(qiáng)度求平均值，對(duì)照1.0×10^-7mol/L Cu²⁺的ECL強(qiáng)度，具體結(jié)果見圖2(A)。

4)在1.0×10^-7mol/L的Cu²⁺孵育之后，多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器的ECL強(qiáng)度穩(wěn)定性，具體結(jié)果見圖2(B)。

由以上應(yīng)用實(shí)施例可反映出本發(fā)明所制備的多功能化的CoFe₂O₄磁性納米傳感器應(yīng)用于Cu²⁺的檢測(cè)，顯示出較高的靈敏度、優(yōu)異的選擇性和良好的重現(xiàn)性。

最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。