本發(fā)明涉及一種阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪和維生素B1的含量測(cè)定方法，具體涉及復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪和維生素B1的含量測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊是麗珠集團(tuán)利民制藥廠(chǎng)研制的西藥第3類(lèi)新藥(每粒含50mg阿魏酸鈉，20mg阿司匹林，桂利嗪25mg和10mg維生素B1)，本品的4種成分阿魏酸鈉、桂利嗪、阿司匹林和維生素B1在抗血小板聚集、抗凝、降低血粘度、溶栓、擴(kuò)血管、維護(hù)心腦血管正常功能方面具有不同的作用機(jī)制，經(jīng)組方有協(xié)同作用，使本品具有較強(qiáng)的抗血小板聚集，有明顯抑制實(shí)驗(yàn)性血栓形成和較強(qiáng)的抗實(shí)驗(yàn)性血栓的作用，適用于預(yù)防和治療缺血性腦血管疾病，如短暫腦缺血性發(fā)作、腦缺血性中風(fēng)和腦動(dòng)脈硬化，其組方科學(xué)生物利用度高療效確切用藥安全，有很好的市場(chǎng)效應(yīng)。但是由于其組方較為復(fù)雜，且各成分均為微量用藥，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)——國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn))第45冊(cè)各組分采用單一方法獨(dú)立檢驗(yàn)，分別采用UV法、UV法、重量分析法測(cè)定，各組分檢驗(yàn)前處理復(fù)雜，可操作的重復(fù)差、難度高、準(zhǔn)確度低、檢驗(yàn)周期長(zhǎng)，不利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制及延誤生產(chǎn)進(jìn)度，檢驗(yàn)成本高等的缺陷。

現(xiàn)有文獻(xiàn)公開(kāi)了用HPLC法單獨(dú)檢測(cè)固體制劑中阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪和維生素B1，如顧玉英等公開(kāi)的《HPLC法測(cè)定定痛寧沖劑中阿魏酸的含量》采用Diamonsil C18色譜柱，甲醇∶1％醋酸溶液(30∶70)作為流動(dòng)相，供試品溶液的制備方法：用水溶解后超聲提取，然后三氯甲烷萃取，萃取液蒸干后殘?jiān)眉状既芙?。鄭維兵等《HPLC法測(cè)定歸芪生血顆粒中阿魏酸的含量》采用Dimasoil C18色譜柱，乙腈-0.085％磷酸溶液(13∶87)作為流動(dòng)相，供試品溶液的制備方法：用甲醇溶解超聲，水浴，用醋酸乙酯萃取后蒸干，殘?jiān)眉状既芙?。俞永梅等公開(kāi)的《HPLC法測(cè)定參芪生肌顆粒中阿魏酸的含量》采用KromasilC18色譜柱，甲醇-0.1％磷酸溶液(30∶70)為流動(dòng)相，供試品溶液的制備方法：用甲醇溶解過(guò)濾后即得。楊春艷等公開(kāi)的《高效液相色譜法測(cè)定阿咖片中阿司匹林含量》采用Symmetry C18柱，磷酸鹽緩沖液-甲醇(7∶3)為流動(dòng)相，供試品溶液的制備方法：供試品磨碎，用流動(dòng)相溶解過(guò)濾后即得。從以上公開(kāi)文獻(xiàn)可以看出，阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪和維生素B1每種物質(zhì)使用的色譜柱種類(lèi)、流動(dòng)相組成和供試品制備方法都不相同，阿魏酸鈉和維生素B1水溶性極強(qiáng)，而阿司匹林和桂利嗪是水不溶性，若四種物質(zhì)用同一HPLC條件測(cè)定含量，必將會(huì)遇到諸多問(wèn)題。

藍(lán)獻(xiàn)泉等公開(kāi)的《HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中阿魏酸鈉、桂利嗪、阿司匹林、維生素B1》中，公開(kāi)了HPLC一次性檢測(cè)四種成分的方法，節(jié)約了時(shí)間，但是文中所提到的用初始比例流動(dòng)相甲醇-乙腈-醋酸水(25∶20∶55)溶解樣品超聲過(guò)程中會(huì)使樣品的包衣聚團(tuán)導(dǎo)致樣品中的桂利嗪難以溶解，含量檢測(cè)結(jié)果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生產(chǎn)理論值和重量法測(cè)定結(jié)果；同時(shí)該文獻(xiàn)中供試品溶液制備方法：供試品研細(xì)，混合均勻，精密稱(chēng)取粉末適量，加初始比例流動(dòng)相適量，超聲過(guò)濾，因流動(dòng)相中含有55％水相且超聲長(zhǎng)達(dá)15分鐘，會(huì)導(dǎo)致樣品中的阿司匹林快速水解產(chǎn)生大量的水楊酸，會(huì)導(dǎo)致樣品中的阿司匹林低于標(biāo)準(zhǔn)要求，綜上所述藍(lán)獻(xiàn)泉等公開(kāi)方法并不適用于復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中的桂利嗪、阿司匹林的含量檢測(cè)。

因此需要一種更加穩(wěn)定的方法同時(shí)測(cè)定復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中阿魏酸鈉、桂利嗪、阿司匹林。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本方法涉及同一色譜條件測(cè)定復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪組分含量的方法。

本發(fā)明所述方法還可以同時(shí)測(cè)定復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中維生素B1含量。

一種復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪的含量測(cè)定方法，所述方法包括：

(1)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑.流動(dòng)相有A相和B相；其中A相為乙腈、四氫呋喃、冰醋酸和水的混合溶劑，B相為甲醇、三乙醇胺和三乙胺的混合溶劑，B相pH值為6.0-7.0；

(2)供試品溶液制備：取復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊內(nèi)容物置研砵，研細(xì)，稱(chēng)取約相當(dāng)于阿魏酸鈉50mg、阿司匹林20mg、桂利嗪25mg的細(xì)粉置量瓶中，加冰醋酸甲醇溶液適量，超聲振蕩，稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液；

(3)混合對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取阿魏酸鈉對(duì)照品約50mg，阿司匹林對(duì)照品約20mg，桂利嗪對(duì)照品約25mg置量瓶中，加冰醋酸甲醇溶液超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；

(4)陰性對(duì)照品溶液制備：取混合輔料空白，精密稱(chēng)加，加冰醋酸甲醇溶液超聲溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為陰性對(duì)照品溶液；

(5)測(cè)定方法：分別吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算各組分標(biāo)示百分含量，即得。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中A相乙腈、四氫呋喃、冰醋酸和水的比例為20∶5∶5∶70。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中B相為甲醇、0.2％三乙醇胺和三乙胺混合溶劑，甲醇、0.2％三乙醇胺和三乙胺的比例為80∶20∶0.4。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中A相和B相梯度洗脫方法為：0-12.00min，A相100％；12.01-25.00min，B相100％；25.01-35.00min，A相100％。

優(yōu)選的，所述步驟(1)中還包括：流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10ul。

優(yōu)選的，所述步驟(2)-(4)中使用的冰醋酸甲醇溶液中冰醋酸的濃度為0.5％-5.0％。

優(yōu)選的，所述步驟(2)-(4)中使用的冰醋酸甲醇溶液中冰醋酸的濃度為1.0％。

現(xiàn)行方法如國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn))中，使用組分分別測(cè)定的方法，測(cè)定其阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪的含量需要三個(gè)工作天的時(shí)間，本發(fā)明涉及的方法只需一個(gè)工作天即可完成三個(gè)組分的含量測(cè)定，本發(fā)明涉及的方法樣品處理一步到位，比現(xiàn)行方法減少了繁雜的樣品處理過(guò)程，能較大的降低因現(xiàn)行方法繁雜的樣品處理引起的系統(tǒng)誤差及偶然誤差，執(zhí)行本發(fā)明涉及的方法后能更好控制復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊的質(zhì)量。

本發(fā)明涉及的方法能減少兩個(gè)工作天的檢驗(yàn)人力成本，同時(shí)縮短了中間產(chǎn)品檢驗(yàn)周期，減少了車(chē)間中間產(chǎn)品到成品的等待時(shí)間，節(jié)約了時(shí)間成本及因等待而引起的能耗成本，獲得一定的經(jīng)濟(jì)效益。

本發(fā)明涉及的方法含量測(cè)定過(guò)程中專(zhuān)屬性高、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高、精密度良好等的優(yōu)異處。

本方法涉及同一色譜條件測(cè)定復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪和維生素B1組分含量的方法。

一種復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪和維生素B1的含量測(cè)定方法，所述方法包括：

(1)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：A相為乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)，B相為PH＝6.6的甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)，A相和B相梯度洗脫方法為：0-12.00min，A相100％；12.01-25.00min，B相100％；25.01-35.00min，A相100％；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10ul；

(2)供試品溶液制備：臨用新配，取復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊20粒內(nèi)容物置研砵，研細(xì)，精密稱(chēng)取約相當(dāng)于阿魏酸鈉50mg、阿司匹林20mg、桂利嗪25mg及10mg維生素B1的細(xì)粉(約相當(dāng)于一粒的量)置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液適量，超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。

(3)混合對(duì)照品溶液制備：臨用新配，精密稱(chēng)取阿魏酸鈉對(duì)照品約50mg，阿司匹林對(duì)照品約20mg，桂利嗪對(duì)照品約25mg及10mg維生素B1同置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

(4)陰性對(duì)照品溶液制備：取混合輔料空白，精密稱(chēng)取約1粒的量，同法制備，作為陰性對(duì)照品溶液。

(5)測(cè)定方法：分別吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算各組分標(biāo)示百分含量，即得。

附圖說(shuō)明

附圖1：實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)組D復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中維生素B1、阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪測(cè)定色譜圖；

附圖2：實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)組E復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中維生素B1、阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪測(cè)定色譜圖；

附圖3：實(shí)施例5方法學(xué)驗(yàn)證專(zhuān)屬性試驗(yàn)測(cè)定色譜圖。

附圖4：實(shí)施例5方法學(xué)驗(yàn)證的阿魏酸鈉標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

附圖5：實(shí)施例5方法學(xué)驗(yàn)證的桂利嗪標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

附圖6：實(shí)施例5方法學(xué)驗(yàn)證的阿司匹林標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

具體實(shí)施例

實(shí)施例1

樣品預(yù)處理篩選

(1)實(shí)驗(yàn)組A：參照藍(lán)獻(xiàn)泉等公開(kāi)的《HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中阿魏酸鈉、桂利嗪、阿司匹林、維生素B1》“溶液制備”部分的2.2.1供試品溶液、2.2.2混合對(duì)照品溶液、2.2.3陰性供試品溶液方法制備。

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(推薦：月旭Xtimate C184.8×250mm，5um)；流動(dòng)相：A相為乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)，B相為PH＝6.6的甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)，A相和B相梯度洗脫方法為：0-12.00min，A相100％；12.01-25.00min，B相100％；25.01-35.00min，A相100％；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10ul；。

(2)實(shí)驗(yàn)組B：本發(fā)明方法。

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(推薦：月旭Xtimate C184.8×250mm，5um)；流動(dòng)相：A相為乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)，B相為PH＝6.6的甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)，A相和B相梯度洗脫方法為：0-12.00min，A相100％；12.01-25.00min，B相100％；25.01-35.00min，A相100％；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10ul。

供試品溶液制備：取復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊20粒內(nèi)容物置研砵，研細(xì)，精密稱(chēng)取約相當(dāng)于阿魏酸鈉50mg、阿司匹林20mg、桂利嗪25mg的細(xì)粉(約相當(dāng)于一粒的量)置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液適量，超聲(40kHz，250W)振蕩2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。

混合對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取阿魏酸鈉對(duì)照品約50mg，阿司匹林對(duì)照品約20mg，桂利嗪對(duì)照品約25mg同置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

陰性對(duì)照品溶液制備：取混合輔料空白，精密稱(chēng)取約1粒的量，同法制備，作為陰性對(duì)照品溶液。

測(cè)定方法：分別吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算各組分標(biāo)示百分含量，即得。

(3)實(shí)驗(yàn)組C：國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)(新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn))第45冊(cè)的UV法測(cè)定阿魏酸鈉和阿司匹林含量，重量法測(cè)定桂利嗪含量，不測(cè)定維生素B1含量。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：(1)實(shí)驗(yàn)組A使用流動(dòng)相甲醇-乙腈-醋酸水(25∶20∶55)溶解樣品超聲過(guò)程中，樣品的包衣聚團(tuán)，影響了樣品中各組分溶解程度。實(shí)驗(yàn)組B樣品的溶解使用1％冰醋酸甲醇溶液配制簡(jiǎn)單快速，無(wú)需調(diào)節(jié)PH值，溶解樣品快速，2分鐘即可把樣品中的阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪溶解完全，溶解過(guò)程中沒(méi)有包衣聚團(tuán)。

(2)實(shí)驗(yàn)組B中供試品溶液的制備和對(duì)照品溶液的制備均一步到位，而附件中的方法(韶關(guān)藥檢所方法)供試品溶液制備需要兩步稀釋?zhuān)瑢?duì)照品溶液的制備需要3步稀釋?zhuān)僮鲝?fù)雜，易由于多次移液轉(zhuǎn)移定容產(chǎn)生操作誤差。

(3)實(shí)驗(yàn)組A測(cè)定的阿司匹林、桂利嗪、阿魏酸鈉和維生素B1含量比實(shí)驗(yàn)組B、實(shí)驗(yàn)組C和生產(chǎn)理論值低。而實(shí)驗(yàn)組A阿司匹林比其他組低20％左右，實(shí)驗(yàn)組A桂利嗪比其他組也是20％左右，分析原因可能是實(shí)驗(yàn)組A樣品溶解過(guò)程中形成包衣聚團(tuán)，導(dǎo)致樣品中各組分的溶解受到影響，而阿司匹林和桂利嗪溶解性比較差，導(dǎo)致阿司匹林和桂利嗪難以溶解；并且實(shí)驗(yàn)組A使用溶解樣品的初始比例流動(dòng)相中含有55％水相且超聲長(zhǎng)達(dá)15分鐘，導(dǎo)致樣品中的阿司匹林快速水解產(chǎn)生大量的水楊酸，這些原因?qū)е掳⑺酒チ謸p失嚴(yán)重。

(4)實(shí)驗(yàn)組A測(cè)定的阿司匹林、桂利嗪含量比實(shí)驗(yàn)組B、實(shí)驗(yàn)組C和生產(chǎn)理論值低，分析原因可能是實(shí)驗(yàn)組A樣品溶解過(guò)程中形成包衣聚團(tuán)，導(dǎo)致樣品中的桂利嗪難以溶解；溶劑中含水相較多，樣品中的阿司匹林在超聲15min過(guò)程中迅速水解致含量偏低。

結(jié)論：本發(fā)明所述樣品預(yù)處理方法優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)。

表格1：各實(shí)驗(yàn)組測(cè)定阿司匹林、桂利嗪、阿魏酸鈉和維生素B1的標(biāo)示百分含量(％)

實(shí)施例2色譜條件篩選

(1)實(shí)驗(yàn)組D：參照藍(lán)獻(xiàn)泉等公開(kāi)的《HPLC法同時(shí)測(cè)定復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中阿魏酸鈉、桂利嗪、阿司匹林、維生素B1》優(yōu)選出的最佳實(shí)驗(yàn)條件操作。

(2)實(shí)驗(yàn)組E：本發(fā)明所述方法。色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：以乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)為流動(dòng)相A，甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)用3mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH＝6.6為流動(dòng)相B，按下表2進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm，以以下表格2中梯度進(jìn)行試驗(yàn)。

本實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)溶液的配制方法為：精密稱(chēng)取阿魏酸鈉對(duì)照品約50mg，阿司匹林對(duì)照品約20mg，桂利嗪對(duì)照品約25mg同置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

表2流動(dòng)相梯度

結(jié)論：表3、表4、圖1、圖2為實(shí)驗(yàn)組D和實(shí)驗(yàn)組E的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，從2個(gè)表格和附圖中可以看出實(shí)驗(yàn)組D中桂利嗪其峰型不對(duì)稱(chēng)，拖尾因子超1.5，而本發(fā)明方法中各成分峰的分離度良好，保留時(shí)間適中，各峰理論塔板數(shù)高，峰型對(duì)稱(chēng)。

表3實(shí)驗(yàn)組D各組分系統(tǒng)適用性結(jié)果

表4實(shí)驗(yàn)組E各組分系統(tǒng)適用性結(jié)果

實(shí)施例3：流動(dòng)相梯度篩選

色譜柱：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：以乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)為流動(dòng)相A，甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)用3mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH＝6.6為流動(dòng)相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm，以以下表5梯度進(jìn)行試驗(yàn)。比較流動(dòng)相的不同梯度時(shí)間變化，以?xún)?yōu)化更佳的色譜條件。

本實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)溶液的配制方法為：精密稱(chēng)取阿魏酸鈉對(duì)照品約50mg，阿司匹林對(duì)照品約20mg，桂利嗪對(duì)照品約25mg同置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

表5梯度優(yōu)化結(jié)果比較

結(jié)論：最終選定色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：以乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)為流動(dòng)相A，甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)用3mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)PH＝6.6為流動(dòng)相B，按上表序號(hào)3方法進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為276nm為色譜條件。

實(shí)施例4：

(1)色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(推薦：月旭Xtimate C184.8×250mm，5um)；流動(dòng)相：A相為乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)，B相為PH＝6.6的甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)，A相和B相梯度洗脫方法為：0-12.00min，A相100％；12.01-25.00min，B相100％；25.01-35.00min，A相100％；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10ul。

(2)供試品溶液制備：取復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊20粒內(nèi)容物置研砵，研細(xì)，精密稱(chēng)取約相當(dāng)于阿魏酸鈉50mg、阿司匹林20mg、桂利嗪25mg的細(xì)粉(約相當(dāng)于一粒的量)置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液適量，超聲(40kHz，250W)振蕩2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。

(3)混合對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取阿魏酸鈉對(duì)照品約50mg，阿司匹林對(duì)照品約20mg，桂利嗪對(duì)照品約25mg同置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

(4)陰性對(duì)照品溶液制備：取混合輔料空白，精密稱(chēng)取約1粒的量，同法制備，作為陰性對(duì)照品溶液。

(5)測(cè)定方法：分別吸取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照品溶液各10ul，注入液相色譜儀，測(cè)定，記錄色譜圖，以峰面積按外標(biāo)法計(jì)算各組分標(biāo)示百分含量，即得。

實(shí)施例5：方法學(xué)驗(yàn)證

(1)專(zhuān)屬性試驗(yàn)

陰性對(duì)照品溶液制備：取混合輔料空白，精密稱(chēng)取0.277g(約1粒的量)，置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為陰性對(duì)照品溶液。

阿魏酸鈉工作對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取阿魏酸鈉對(duì)照品約50mg，置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為阿魏酸鈉工作對(duì)照品溶液。

阿司匹林對(duì)照品溶液制備：臨用新配，精密稱(chēng)取阿司匹林對(duì)照品約20mg，置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為阿司匹林對(duì)照品溶液。

桂利嗪工作對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取桂利嗪工作對(duì)照品約25mg，置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為桂利嗪工作對(duì)照品對(duì)照品溶液。

色譜條件：本發(fā)明所述方法。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)附圖3，結(jié)果顯示，輔料空白樣品圖譜中在阿魏酸鈉峰、阿司匹林峰、桂利嗪峰相同的保留時(shí)間位置處未出峰，說(shuō)明輔料空白無(wú)干擾，該方法的專(zhuān)屬性較強(qiáng)。

(2)穩(wěn)定性

混合對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取阿魏酸鈉工作對(duì)照品54.30mg、阿司匹林對(duì)照品20.34mg和桂利嗪工作對(duì)照品25.02mg置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液溶解，并稀釋至刻度，搖勻，備用。于室溫下放置24小時(shí)，分別于0、2、4、6、8、24小時(shí)精密量取10ul按上述含量測(cè)定方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(推薦：月旭Xtimate C184.8×250mm，5um)；流動(dòng)相：A相為乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)，B相為PH＝6.6的甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)，A相和B相梯度洗脫方法為：0-12.00min，A相100％；12.01-25.00min，B相100％；25.01-35.00min，A相100％；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10ul。

表6溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)論：試驗(yàn)結(jié)果顯示，溶液中阿魏酸鈉穩(wěn)定性RSD為1.3％；桂利嗪穩(wěn)定性RSD為1.4％；阿司匹林穩(wěn)定性RSD為9.0％(超出目標(biāo)值)，表明溶液中阿魏酸鈉、桂利嗪在24h內(nèi)穩(wěn)定，阿司匹林在溶液中會(huì)逐漸產(chǎn)生游離水楊酸，經(jīng)計(jì)算4、6、8小時(shí)內(nèi)的RSD分別為1.3％、2.9％、3.9％，表明溶液中阿司匹林在4小時(shí)內(nèi)較穩(wěn)定，但為試驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確，因此要求試驗(yàn)中樣品溶液必須臨用新配。

(3)回收率試驗(yàn)

分別精密稱(chēng)取理論檢測(cè)濃度的80％、100％、120％的阿魏酸鈉對(duì)照品、阿司匹林對(duì)照品、桂利嗪對(duì)照品即含阿魏酸鈉約40、50、60mg、阿司匹林約16、20、24mg、桂利嗪約20、25、30mg的各3份置100ml量瓶中，再分別精密稱(chēng)取約0.277g理論處方量的混合輔料，加1％冰醋酸甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)作為供試品溶液。

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(推薦：月旭Xtimate C184.8×250mm，5um)；流動(dòng)相：A相為乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)，B相為PH＝6.6的甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)，A相和B相梯度洗脫方法為：0-12.00min，A相100％；12.01-25.00min，B相100％；25.01-35.00min，A相100％；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10ul。

計(jì)算回收率，回收率相關(guān)數(shù)據(jù)及結(jié)果見(jiàn)表7、表8、表9和表10。

表7準(zhǔn)確度試驗(yàn)稱(chēng)樣量

表8阿魏酸鈉準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

表9阿司匹林準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

表10桂利嗪準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)論：結(jié)果表明：阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪三組分的回收率均在95％～105％，平均回收率分別為101.0％、101.5％、100.1％表明該方法準(zhǔn)確度良好。

(4)精密度試驗(yàn)

混合對(duì)照品溶液制備：精密稱(chēng)取阿魏酸鈉工作對(duì)照品54.30mg、阿司匹林對(duì)照品20.34mg和桂利嗪工作對(duì)照品25.02mg置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液溶解，并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(推薦：月旭Xtimate C184.8×250mm，5um)；流動(dòng)相：A相為乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)，B相為PH＝6.6的甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)，A相和B相梯度洗脫方法為：0-12.00min，A相100％；12.01-25.00min，B相100％；25.01-35.00min，A相100％；流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10ul。

精密吸取對(duì)照品溶液10ul，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，計(jì)算其峰面積RSD，結(jié)果見(jiàn)表11。

表11精密度試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)論：試驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照品溶液中阿魏酸鈉精密度RSD為1.1％；桂利嗪穩(wěn)定性RSD為1.2％；阿司匹林穩(wěn)定性RSD為1.1％，表明該方法進(jìn)樣精密度良好。

(5)重復(fù)性試驗(yàn)

供試品溶液制備：臨用新配，取復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊20粒內(nèi)容物置研砵，研細(xì)，精密稱(chēng)取約相當(dāng)于阿魏酸鈉50mg、阿司匹林20mg、桂利嗪25mg及10mg維生素B1的細(xì)粉(約相當(dāng)于一粒的量)置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液適量，超聲2分鐘使溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，作為供試品溶液。

色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(推薦：月旭Xtimate C184.8×250mm，5um)；流動(dòng)相：A相為乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水(20∶5∶5∶70)，B相為PH＝6.6的甲醇-0.2％三乙醇胺-三乙胺(80∶20∶0.4)，A相和B相梯度洗脫方法為：0-12.00min，A相100％；12.01-25.00min，B相100％；25.01-35.00min，A相100％：流速：1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10ul。

取同一批樣品(批號(hào)：140901)，按照供試品溶液制備方法平行處理6份，結(jié)果如下表12：

表12重復(fù)性試驗(yàn)

結(jié)論：試驗(yàn)結(jié)果表明，6份樣品含量測(cè)定結(jié)果RSD分別阿魏酸鈉為0.3％；桂利嗪RSD為0.7％；阿司匹林RSD為0.4％，表明該方法重復(fù)性良好。

(6)線(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱(chēng)取阿魏酸鈉對(duì)照品約100.62mg(批號(hào)：1407020871)、阿司匹林對(duì)照品約40.39mg(批號(hào)：100113-201104)、桂利嗪對(duì)照品50.15mg(批號(hào)：150203-1)置100ml量瓶中，加1％冰醋酸甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。用上述溶液，以1％冰醋酸甲醇作溶劑，按下表進(jìn)一步稀釋制成一系列線(xiàn)性測(cè)試溶液，濃度相當(dāng)于對(duì)照品溶液濃度的40％-200％。取各溶液10ul注入液相色譜儀，按上述色譜條件檢測(cè)，以峰面積為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品濃度(mg/ml)為(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

表13線(xiàn)性試驗(yàn)

計(jì)算各組分回歸方程

阿魏酸鈉回歸方程為：Y＝0.0000591907X-0.011920712，r＝0.9999；阿司匹林回歸方程為：Y＝0.000289771X-0.00907672，r＝0.9999；桂利嗪回歸方程為：Y＝0.00019103X-0.004825443，r＝0.9999，結(jié)果表明：阿魏酸鈉在0.20124～1.0062mg/ml；阿司匹林在0.08278～0.4139mg/ml；桂利嗪在0.1003～0.5015mg/ml范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

結(jié)論：方法學(xué)驗(yàn)證總評(píng)：以上各項(xiàng)目驗(yàn)證結(jié)果均符合中國(guó)藥典相關(guān)規(guī)定，該方法準(zhǔn)確、有效可行。

實(shí)施例6

在含量測(cè)定新方法建立后我們選定了三批樣品與現(xiàn)行方法含量測(cè)定結(jié)果比較，結(jié)果見(jiàn)表14。

現(xiàn)行方法：國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS₁-(X-372)-2003Z(國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)第45冊(cè)45-203～45-205頁(yè))

新方法：本發(fā)明實(shí)施例4所述方法。

表14新方法與現(xiàn)行方法樣品測(cè)定結(jié)果

結(jié)論：以上多批次樣品的結(jié)果比較表明，新方法含量測(cè)定能夠有效、準(zhǔn)確的測(cè)定復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊中阿魏酸鈉、阿司匹林、桂利嗪的含量，方法穩(wěn)定，可靠、高效，可定入復(fù)方阿魏酸鈉阿司匹林膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中。