本發(fā)明涉及一種鑒定天麻產(chǎn)品的原料為新鮮天麻或干燥天麻的方法。

背景技術(shù)：

天麻是一味具有悠久歷史的藥食兩用的名貴中藥材，現(xiàn)在已經(jīng)被開發(fā)為相關(guān)的中成藥、食品飲料和保健酒等相關(guān)產(chǎn)品(Chau,C.F.,&Wu,S.H.(2006).The development of regulations of Chinese herbal medicines for both medicinal and food uses.Trends In Food Science&Technology,17(6),313-323；Yang,X.D.,Zhu,J.,Yang,R.,Liu,J.P.,Li,L.,&Zhang,H.B.(2007).Phenolic constituents from the rhizomes of Gastrodiaelata.Natural product research,21(2),180-186；Zhen,X.-J.,&Liu,J.-L.(2005).The technology research for Gastrodiaelata Bl.health protection beverage production.Food Science,26(9),653-655.)。由于天麻具有鮮、干兩用的歷史，所以在產(chǎn)品生產(chǎn)過程中既可投料新鮮的原材料，也可投放干燥樣品。但是目前沒有用于評(píng)價(jià)天麻產(chǎn)品新鮮或干燥原料投料的檢測(cè)方法。為此，提供一種能夠有效區(qū)分天麻產(chǎn)品中是否投有新鮮或干燥原料的方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種鑒定天麻產(chǎn)品的原料為新鮮天麻或干燥天麻的方法，本發(fā)明方法將兩個(gè)特征性化學(xué)成分(式Ⅰ和式Ⅱ所示化合物)作為鑒定的標(biāo)志物，能夠有效區(qū)分天麻產(chǎn)品的原料投料形式—新鮮天麻或干燥天麻投料。

本發(fā)明首先提供式Ⅰ和式Ⅱ所示化合物：

式Ⅰ和式Ⅱ所示化合物可通過如下方法提?。簩⑿迈r天麻研磨破碎后用水進(jìn)行超聲提取，離心收集上清液，分離提純所述上清液即可。

式Ⅰ和式Ⅱ所示化合物還可由13#化合物依次經(jīng)脫水縮合、水合及對(duì)羥基苯甲醇化修飾制備得到，各反應(yīng)可在常規(guī)條件下進(jìn)行；

式Ⅰ和/或式Ⅱ所示化合物可用作區(qū)分新鮮天麻或干燥天麻制備的天麻產(chǎn)品，即作為區(qū)分天麻產(chǎn)品的原料為新鮮天麻或干燥天麻的標(biāo)志物，其中的天麻類型包括紅天麻、黃天麻、烏天麻、綠天麻及相關(guān)的雜交品種。

本發(fā)明進(jìn)一步提供的基于式Ⅰ和/或式Ⅱ所示化合物作為標(biāo)志物的鑒定天麻產(chǎn)品的原料為新鮮天麻或干燥天麻的方法，當(dāng)天麻產(chǎn)品中檢測(cè)出式Ⅰ所示化合物和/或式Ⅱ所示化合物時(shí)，則所述天麻產(chǎn)品的原料為新鮮天麻，反之則為干燥天麻。

上述的方法中，所述天麻產(chǎn)品進(jìn)行如下前處理：

當(dāng)所述天麻產(chǎn)品為液態(tài)時(shí)，進(jìn)行如下1)-3)中任一種處理：

1)所述天麻產(chǎn)品經(jīng)離心收集上清液；

2)用水稀釋所述天麻產(chǎn)品后經(jīng)離心收集上清液；

3)所述天麻產(chǎn)品進(jìn)行富集；

處理1)適用于含有合適濃度標(biāo)志物的液態(tài)樣品；

處理2)適用于含有較高濃度標(biāo)志物的液態(tài)樣品，稀釋的程度為樣品中檢測(cè)不產(chǎn)生飽和信號(hào)為止；

處理3)適用于含有微量標(biāo)志物的液態(tài)樣品，所述富集的方式可為液液萃取、固相小柱萃取等；

當(dāng)所述天麻產(chǎn)品為固態(tài)時(shí)，將所述天麻產(chǎn)品進(jìn)行破碎得粉末樣品，再進(jìn)行如下1)或2)的處理：

1)用水對(duì)所述粉末樣品進(jìn)行超聲提取，經(jīng)離心收集上清液；

2)用水溶解所述粉末樣品，經(jīng)超聲提取后進(jìn)行富集處理；

處理1)適用于含有合適或較高濃度標(biāo)志物的固態(tài)樣品；

處理2)適用于含有較低濃度標(biāo)志物的固態(tài)樣品，所述富集的方式可為液液萃取、固相小柱萃取等。

上述的方法中，所述粉末樣品的粒度可為10～200目；

處理1)中所述水的用量可為：3～100mL水/g所述粉末樣品，具體可為4mL水/g所述粉末樣品。

上述的方法中，處理1)和處理2)中所述超聲提取的時(shí)間可為5～60min，具體可為30min；

處理1)中所述離心的速率可為10000～30000rpm，具體可為13000rpm，時(shí)間可為5～60min，具體可為10min。

上述的方法中，采用如下1)-7)中任一種方法進(jìn)行檢測(cè)：

1)超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用(含UPLC-PDA-ESI-Q-TOF-MS)的方法；

2)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法；

3)紫外分光光度法；

4)紅外光譜法；

5)近紅外光譜法；

6)熒光光度法；

7)核磁共振波譜法。

上述的方法中，采用超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的方法時(shí)的檢測(cè)條件如下：

柱溫：20～50℃，具體可為45℃；

檢測(cè)波長(zhǎng)：269.5～270.5nm；

流速：0.2～0.8mL/min，具體可為0.5mL/min；

流動(dòng)相：A相為體積濃度為0～0.15％的甲酸、乙酸、三氟乙酸、醋酸銨、氨水或甲酸銨的水溶液，具體可為0.1％的甲酸水溶液，作為水相，B相為體積濃度為0～0.15％的甲酸、乙酸、三氟乙酸、醋酸銨、氨水或甲酸銨的乙腈、乙醇或甲醇溶液，具體可 為0.1％的甲酸乙腈溶液，作為有機(jī)相；

具體洗脫梯度可為：0～4min，0～0.5％B相；4～6min，0.5％～2％B相；6～7min，2％～8％B相；7～12min，8％～12％B相；12～18min，12％～20％B相；18～24min，20％～40％B相；24～25min，40％～45％B相；25～31min，45％～70％B相；31～33min，70％～98％B相；33～35min，98％B相，均指的是體積百分含量。

上述的方法中，所述超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用的方法中，高分辨質(zhì)譜的檢測(cè)條件如下：

檢測(cè)模式：負(fù)離子模式；

檢測(cè)范圍：0～1500Da；

掃描時(shí)間：0.1～0.2s，具體可為0.2s；

檢測(cè)時(shí)間：0～35min，具體可為26.5min；

高碰撞能量：30～50V；

毛細(xì)管電壓：1.0～6.0kV，具體可為2.0kV；

錐孔電壓：10～60V，具體可為40V；

源內(nèi)溫度：50～500℃，具體可為100℃；

脫氣溫度：300～800℃，具體可為450℃；

錐孔氣流速度：20～100L/h，具體可為50L/h；

脫氣流速：100～2000L/h，具體可為900L/h。

上述的方法中，可采用MassLynx V4.1軟件(Waters公司，Milford，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

上述的方法中，其余幾種檢測(cè)方法均可在常規(guī)的條件下進(jìn)行，根據(jù)待測(cè)天麻樣品中標(biāo)志物的濃度高低來調(diào)整具體的檢測(cè)條件，以能有效檢測(cè)出標(biāo)志物即可。

本發(fā)明提供的式Ⅰ和/或式Ⅱ所示化合物可作為區(qū)分天麻產(chǎn)品的原料為新鮮天麻或干燥天麻的標(biāo)志物，能夠?qū)μ炻楫a(chǎn)品的原料形式進(jìn)行有效的鑒定，且檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行，通過常規(guī)的前處理以及檢測(cè)方法(如液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法、紫外、紅外、近紅外、熒光、核磁等)即能實(shí)現(xiàn)標(biāo)志物的檢測(cè)。檢測(cè)的天麻產(chǎn)品可以但不限于固態(tài)(如中成藥)、液態(tài)樣品(如飲料)；檢測(cè)天麻的類型包括紅天麻、黃天麻、烏天麻、綠天麻及相關(guān)的雜交品種。

附圖說明

圖1為新鮮和干燥天麻的高分辨質(zhì)譜總離子流圖和在270nm下的液相圖；

其中，IS表示蘆??；5#化合物表示巴利森苷G；13#化合物表示CA(0/p-HA/0)；32#化合物表示式Ⅰ所示化合物，34#化合物表示式Ⅱ所示化合物。

圖2為式Ⅰ和式Ⅱ所示化合物的加和離子和二級(jí)質(zhì)譜圖(分別為上圖和下圖)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、

1、標(biāo)準(zhǔn)品和試劑

標(biāo)準(zhǔn)品巴利森苷E購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司(成都，中國)，純度大于97％；蘆丁購自中國食品藥品檢定研究院(北京，中國)。

質(zhì)譜級(jí)的乙腈和甲酸分別購自Merck(Darmstadt，Germany)和Fisher Scientific(Geel,Belgium)公司。

去離子水由Thermo Scientific(Langenselbold,Germany)公司的Barnstead GenPure UV/UF制水系統(tǒng)制備。

2、材料與樣品制備

新鮮白麻和母麻于2015年11月份采自云南彝良，經(jīng)鑒定為蘭科天麻屬栽培品Gastrodiaelata Bl.f.glaucaS.Chow的塊根。每一份樣品立即清洗后，用吸水紙擦拭完樣品表面，均勻分成兩部分：一部分用于制備新鮮樣品，另一部分用于制備對(duì)應(yīng)的干燥樣品。

新鮮樣品的制備：

分別隨機(jī)稱取0.35g左右的已切成小塊的新鮮天麻(包括白麻和母麻)，置于2.0mL的EP管內(nèi)，利用Scientz電動(dòng)組織研磨儀(寧波，中國)在60Hz頻率下破碎2min，得到粒度均一的破碎樣品；破碎樣品用4倍體積(約1.40mL)的水溶解后，超聲提取30min，經(jīng)13000rpm離心10min后，吸取上清液，保存于-80℃，備用。

干燥樣品的制備：

取一部分新鮮樣品置于75℃的干燥箱內(nèi)，干燥至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5mg為止；利用Scientz電動(dòng)組織研磨儀(寧波，中國)在60Hz頻率下破碎2min，破碎后得到粒度為80目的粉末，干燥粉末溶解在水中，超聲提取30min后，13000rpm離心10min，吸取上清液，制備為100mg/mL的干燥樣品的提取液，置于-80℃，備用。

3、UPLC-PDA-ESI-Q-TOF-MS^E分析檢測(cè)

上述制備的所有提取液(上清液)經(jīng)解凍后，吸取100μL樣品溶液與10μL的蘆丁溶液(107μg/mL)混合，用于UPLC-PDA-ESI-Q-TOF-MS^E定性和定量分析。

色譜條件如下：液相，ACQUITY I-CLASS UPLC；色譜柱，ACQUITYT3 column(1.8μm，2.1mm i.d.×100mm)(Waters，MA)；預(yù)柱，VanGuard^TM T3C₁₈pre-column(1.8μm，2.1mm i.d.×10mm)(Waters，MA)；流速，0.5mL/min；柱溫：45℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：270nm。流動(dòng)相：A相，0.1％的甲酸水溶液(體積)；B相，0.1％的甲酸乙腈溶液(體積)。色譜梯度：0～4min，0～0.5％B；4～6min，0.5～2％B；6～7min，2～8％B；7～12min，8～12％B；12～18min，12～20％B；18～24min，20～40％B；24～25min，40～45％B；25～31min，45～70％B；31～33min，70～98％B；33～35min，98％B。

質(zhì)譜條件如下：儀器，高分辨質(zhì)譜Waters Xevo G2-S Q-Tof-MS(Manchester,UK)；檢測(cè)模式，負(fù)離子模式；檢測(cè)范圍，100～1500Da；掃描時(shí)間，0.2s；檢測(cè)時(shí)間，26.5min；高碰撞能量，30～50V；毛細(xì)管電壓，2.0kV；錐孔電壓，40V；源內(nèi)溫度，100℃；脫氣溫度，450℃；錐孔氣流速度，50L/h；脫氣流速，900L/h。數(shù)據(jù)處理軟件為MassLynx V4.1軟件(Waters公司，Milford，USA)。

4、結(jié)果

圖1為新鮮和干燥天麻(包括白麻、母麻兩種規(guī)格)的高分辨質(zhì)譜總離子流圖和在270nm下的液相圖(平行進(jìn)行三次)。

圖1中，IS表示蘆丁，5#化合物表示巴利森苷G，其結(jié)構(gòu)式如下所示；13#化合物的結(jié)構(gòu)式如下所示，32#化合物即為式Ⅰ所示化合物其結(jié)構(gòu)式如下所示，34#化合物即為式Ⅱ所示化合物，其結(jié)構(gòu)式如下所示：

由圖1可以看出，新鮮和干燥的天麻樣品具有顯著差異，其中新鮮的白麻和母麻樣品主要由巴利森苷G(5#)、CA(0/p-HA/0)(13#)、HdCA(CA(0/p-HA-p-HA/0)/p-HA-p-HA/0)(32#，式Ⅰ)和HdCA(CA(0/p-HA-p-HA-p-HA/0)/p-HA/0)(34#，式Ⅱ)組成，其中32#和34#化合物在三批干燥樣品中均未檢出。因此32#和34#化合物可作為檢測(cè)天麻產(chǎn)品的原料為新鮮天麻或干燥天麻的標(biāo)志物。

各化合物的分析和鑒定數(shù)據(jù)如下：

5#化合物的高分辨MS/MS數(shù)據(jù)為397.1122、191.0188、173.0085、129.0187和111.0083。經(jīng)文獻(xiàn)(Li,Z.,Wang,Y.,Ouyang,H.,Lu,Y.,Qiu,Y.,Feng,Y.,Jiang,H.,Zhou,X.,&Yang,S.(2015).A novel dereplication strategy for the identification of two new trace compounds in the extract of Gastrodiaelata using UHPLC/Q-TOF-MS/MS.Journal of Chromatography B,988,45-52.)和同分異構(gòu)體巴利森苷E的標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，可鑒定化合物為巴利森苷G。

13#化合物的高分辨MS/MS數(shù)據(jù)為595.1240([2M-H]^-),489.0847、191.0193、173.0075和111.0075。經(jīng)文獻(xiàn)(Lai,C.J.S.,Zha,L.,Liu,D.H.,Kang,L.,Ma,X.,Zhan,Z.L.,Nan,T.G.,Yang,J.,Li,F.,Yuan,Y.,&Huang,L.Q.(2016).Global profiling and rapid matching of natural products using diagnostic product ion network and in silico analogue database:Gastrodiaelata as a case study.Journal of Chromatography A,1456,187-195.)比對(duì)，可鑒定為CA(0/p-HA/0)。

32#化合物和34#化合物為一對(duì)同分異構(gòu)體，它們的高分辨質(zhì)譜的母離子([M-H]^-)和加和離子([M-2H+Na]^-、[M-2H+K]^-)數(shù)據(jù)表明該對(duì)同分異構(gòu)體的分子式為C₄₀H₄₀O₁₈。32#和34#化合物的二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分別為701.1723、595.1300、297.0622、191.0215、1733.0072、111.0077；701.1727、595.1313、403.1015、297.0618、191.0194、173.0085、129.0184、111.0079。其中碎片離子m/z 297.06和m/z 595.13表明該對(duì)同分異構(gòu)體具有一對(duì)含羥基對(duì)羥基苯甲醇檸檬酸骨架的化合物。由于檸檬酸酯類化合物sn-1/5鍵比sn-6更易斷裂(Lai,C.J.S.,Zha,L.,Liu,D.H.,Kang,L.,Ma,X.,Zhan,Z.L.,Nan,T.G.,Yang,J.,Li,F.,Yuan,Y.,&Huang,L.Q.(2016).Global profiling and rapid matching of natural products using diagnostic product ion network and in silico analogue database:Gastrodiaelata as a case study.Journal of Chromatography A,1456,187-195.)，因此高豐度的碎片離子m/z 297.06表明這對(duì)同分異構(gòu)體的酸酐鍵在sn-1/5位。其中34#化合物的保留時(shí)間為20.17min大于32#化合物的保留時(shí)間19.49min，并且它們具有系列脫對(duì)羥基苯甲醇基(-106Da)的離子信號(hào)。通過分析生源合成途徑，32#和34#化合物可由CA(0/p-HA/0)(13#)脫水縮合、水合及對(duì)羥基苯甲醇化修飾而成。所以32#和34#化合物分別鑒定為HdCA(CA(0/p-HA-p-HA/0)/p-HA-p-HA/0)(式Ⅰ)和HdCA(CA(0/p-HA-p-HA-p-HA/0)/p-HA/0)(式Ⅱ)。