本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)哺乳動物差異蛋白體系及其篩選方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：維吾爾醫(yī)(維醫(yī))學(xué)是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中重要組成部分，維醫(yī)學(xué)體液論認(rèn)為，人體由膽液質(zhì)、血液質(zhì)、黏液質(zhì)和黑膽質(zhì)4種體液質(zhì)組成，上述4種體液質(zhì)的動態(tài)平衡是機(jī)體健康的生理基礎(chǔ)，而某一種體液質(zhì)的量或/和質(zhì)的變化，引起體液質(zhì)平衡失調(diào)，產(chǎn)生一種異常體液質(zhì)證(證候)，與多種疾病的發(fā)生存在因果關(guān)系。體液病理學(xué)(體液論)是維醫(yī)理論根基，其認(rèn)為4種體液中，黏液質(zhì)體液屬性濕寒，常易因生活、飲食與環(huán)境因素、工作壓力、缺乏運(yùn)動等原因?qū)е麦w內(nèi)體液平衡遭到破壞，黏液質(zhì)體液發(fā)生改變，產(chǎn)生異常黏液質(zhì)，致代謝水平降低，產(chǎn)物蓄積體內(nèi)，進(jìn)而導(dǎo)致病理性改變，引發(fā)相關(guān)疾病。臨床研究證實，異常黏液質(zhì)證(AbnormalPhlegm)在陽痿(陰莖勃起功能障礙)、早泄、少弱精癥、卵巢早衰、不孕不育等生殖疾病、肥胖癥、高脂血癥等代謝性疾病和心血管疾病發(fā)生過程中，處于主導(dǎo)地位，可能也是腫瘤、糖尿病、高血壓等復(fù)雜性疾病發(fā)生早期的主要證型。盡管在復(fù)雜性疾病的維醫(yī)異常黑膽質(zhì)證研究中，在基因組學(xué)、代謝組學(xué)、氧化應(yīng)激、血栓前狀態(tài)和腸道菌群等多方面開展了大量的研究工作，取得了突破性進(jìn)展，成效顯著，但是對異常黏液質(zhì)證及其相關(guān)病證的基礎(chǔ)與臨床研究一直滯后。因此，本專利發(fā)明人在異常黏液質(zhì)證(證候)及其相關(guān)病證方面，原創(chuàng)性的建立了異常黏液質(zhì)證及病證結(jié)合大鼠模型，并對該模型從生物學(xué)表征、行為學(xué)改變與發(fā)生發(fā)展規(guī)律角度進(jìn)行較為系統(tǒng)的研究，證實了其具有較強(qiáng)科學(xué)性、可靠性和穩(wěn)定性，并與該證候的維醫(yī)臨床高度吻合的結(jié)論，同時對其發(fā)病機(jī)制從神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)改變角度進(jìn)行了較為深入的研究。維醫(yī)辨證分型的起點和核心是維醫(yī)“體液論”，其出發(fā)點是人體內(nèi)在體液動態(tài)變化的外在表現(xiàn)，而維醫(yī)藥學(xué)所推崇的辨證施治也是依據(jù)個體的整體水平上發(fā)生的體液表型差異來開展的，因此，若要揭開該證候的發(fā)生發(fā)展規(guī)律，則需在整體水平上來開展研究工作，尋找其關(guān)鍵功能分子，探索其核心機(jī)制及相關(guān)疾病的病理機(jī)制，而這與系統(tǒng)生物學(xué)整體研究思路不謀而合。血清融入了機(jī)體多器官、組織和細(xì)胞的蛋白質(zhì)組動態(tài)信息，也是各種疾病密切相關(guān)的分泌蛋白必經(jīng)之路，可以反映機(jī)體的病理生理改變相關(guān)的總體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的時空性，而藥物對任何靶器官、組織或細(xì)胞的作用最終也反映在血清蛋白質(zhì)組變化之中。故，本研究基于異常黏液質(zhì)證候與病證結(jié)合動物模型基礎(chǔ)上，開展了血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究，建立了異常黏液質(zhì)證候相關(guān)血清蛋白體系為進(jìn)一步開展異常黏液質(zhì)證相關(guān)疾病的機(jī)制研究、藥物篩選、轉(zhuǎn)化與防治研究奠定了基礎(chǔ)。技術(shù)實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的第一目的在于提供一種維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)的哺乳動物血清差異蛋白體系，包括以下蛋白：優(yōu)選地，本發(fā)明的所述維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)的哺乳動物血清差異蛋白體系來自模式動物；所述模式動物為大鼠。本發(fā)明還提供一種了維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)的哺乳動物血清差異蛋白，包括以下蛋白的任意一種或幾種：優(yōu)選地，本發(fā)明的所述維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)的哺乳動物血清差異蛋白來自模式動物；所述模式動物為大鼠。本發(fā)明另一目的在于提供了上述維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)的哺乳動物血清差異蛋白體系的篩選方法，包括以下步驟：1)建立正常對照組(N組)、異常黏液質(zhì)證候組(ZM組)、異常黏液質(zhì)病證組(BM組)哺乳動物；2)采集所述步驟1)得到的哺乳動物全血，分離后得到哺乳動物的血清；3)從所述步驟2)得到的所述血清中提取蛋白質(zhì)；4)將所述步驟3)中得到的所述蛋白質(zhì)標(biāo)記后純化，得到純化后肽段；5)將所述步驟4)得到的所述純化后的肽段經(jīng)質(zhì)譜檢測后得到指紋圖譜，篩選后所述指紋圖譜使用蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件進(jìn)行檢索，根據(jù)得到的搜索結(jié)果和篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析，將得到的分析數(shù)據(jù)在所述哺乳動物蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中使用蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢索軟件檢索，獲得所述N組、ZM組和BM組哺乳動物血清差異蛋白質(zhì)；6)將所述步驟5)中所述BM組與N組的血清蛋白質(zhì)相比較，得到BM/N的血清差異蛋白質(zhì)；將ZM組與N組的血清蛋白質(zhì)相比較，得到ZM/N的血清差異蛋白質(zhì)；統(tǒng)計所述BM/N和ZM/N差異蛋白的共同蛋白的種類和數(shù)量，得到異常黏液質(zhì)證(證候)的血清差異蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明的篩選方法中，所述哺乳動物為大鼠。優(yōu)選地，本發(fā)明的篩選方法中，所述步驟1)中正常對照組大鼠在常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)，喂食的環(huán)境溫度為18～22℃，所述喂食環(huán)境的相對濕度為40～60％，造模組的喂食的環(huán)境溫度為8～12℃，所述喂食環(huán)境的相對濕度70～80％；所述步驟1)中正常對照組為普通飼料，造模組喂食飼料為濕寒性飼料。優(yōu)選地，本發(fā)明的篩選方法中，所述步驟3)中所述標(biāo)記方法為iTRAQ標(biāo)記試劑盒標(biāo)記。優(yōu)選地，本發(fā)明的篩選方法中，所述步驟4)中蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件為ProteomeDiscoverer；所述蛋白質(zhì)質(zhì)譜檢索軟件為mascot軟件。本發(fā)明還提供了上述維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)的哺乳動物血清差異蛋白體系，為進(jìn)一步開展異常黏液質(zhì)證及其相關(guān)疾病的機(jī)制研究、藥物篩選、轉(zhuǎn)化與防治研究奠定了基礎(chǔ)，提供了依據(jù)。由上可知，本發(fā)明的優(yōu)點在于：1、現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中沒有證候的概念，常用疾病與正常對照組之間尋找差異蛋白，而本專利發(fā)明人，基于對證候和病證的認(rèn)識與豐富的維吾爾醫(yī)學(xué)知識，運(yùn)用辯證與辨病相結(jié)合的方式，通過類比方法，在ZM與N組的差異蛋白與BM與N組的差異蛋白之間尋找共同蛋白，篩查出了異常黏液質(zhì)證(證候)的血清候選蛋白標(biāo)志物，并通過驗證，建立了異常黏液質(zhì)證(證候)哺乳動物血清蛋白標(biāo)志物，而該蛋白標(biāo)志物體系則更準(zhǔn)確的反映了維醫(yī)對證候的詮釋，體現(xiàn)了證候的本質(zhì)。2、本發(fā)明提供了37種維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)的哺乳動物血清差異蛋白，其中上調(diào)表達(dá)28種，下調(diào)表達(dá)蛋白9種(差異倍數(shù)大于1.2倍為上調(diào)表達(dá)，或者差異倍數(shù)小于0.8為下調(diào)表達(dá)，p值小于等于0.05)，通過實施例表明其在模式動物如大鼠中血清中差異蛋白的上調(diào)或者下調(diào)表達(dá)，表明這些差異蛋白在大鼠的異常黏液質(zhì)證及其相關(guān)疾病中的作用，最終確定異常黏液質(zhì)證(證候)的生物標(biāo)記物，可以針對所述生物標(biāo)記物進(jìn)行基礎(chǔ)研究，藥物篩選、轉(zhuǎn)化，并為防治哺乳動物特別是人的維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)相關(guān)疾病提供了理論基礎(chǔ)和實踐依據(jù)。附圖說明圖1為正常對照組、異常黏液質(zhì)證侯組和病證組大鼠模型的造模流程圖；圖2為維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)的哺乳動物血清差異蛋白體系的篩選流程圖；圖3為大鼠血清差異蛋白質(zhì)的完整性檢測的SDS-PAGE電泳圖譜；圖4為37種候選差異蛋白中任意選取8種蛋白的ELISA檢測圖。具體實施方式在本發(fā)明實施例中，實驗動物為：具有正常性能力的性成熟期SD雄性大鼠30只(體重200g左右)，雌性大鼠15只(體重180g左右)，由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供；在本發(fā)明實施例中，藥品與試劑：濕寒性飼料由新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心按前期研究中使用的要求配制；菠菜實與芫荽實等藥材購自于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院草藥房；戊巴比妥鈉；生理鹽水；阿撲嗎啡(90μg/kg)；雌二醇；黃體；主要檢測試劑：ELISA試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒等。在本發(fā)明實施例中，術(shù)語為以下含義：術(shù)語APO:阿撲嗎啡(Apomorphine)；術(shù)語iTRAQ：同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobarictagsforrelativeandabsolutequantitation)術(shù)語HPLC:高效液相色譜法(HighPerformanceLiquidChromatography)術(shù)語SDS：十二烷基硫酸鈉(sodiumdodecylsulfate,sodiumsalt)生物學(xué)表征觀測：定性指標(biāo)觀測：所述定性指標(biāo)觀測為皮膚毛發(fā)在日光下觀察，情緒反應(yīng)以一籠內(nèi)各大鼠相互反應(yīng)為主觀察30分鐘，行為狀態(tài)以此期間內(nèi)的活動為主、安靜環(huán)境下觀察30分鐘，興奮程度以夾尾實驗時的反應(yīng)為主，舌象舌苔在日光下觀察、記錄并拍照，飲食水狀態(tài)以各組同一時間喂飼觀察飲食水狀態(tài)，小便以各組大鼠當(dāng)日正排尿時顏色為主，大便狀態(tài)以當(dāng)日正排大便時大便形態(tài)為主。定量指標(biāo)為避免生理節(jié)奏的影響，每天固定于20:00-22:00收集各項資料，其中體重：每天按規(guī)定時間稱重并記錄，以每籠總體重除以該籠大鼠只數(shù)，得出平均體重，并按下述公式得出模型組各籠體重比值并記錄，體重比值＝模型組平均體重-模型組初始體重/正常組平均體重-正常組初始體重；飲食量：每天20:00添加飼料300g，次日20:00稱食物余量，根據(jù)下述公式得出100g體重相對應(yīng)的飲食量并記錄；飲水量：每天20:00給水500ml，次日20:00量剩余水量，計算得出100g體重相對應(yīng)的飲水量并記錄；尿量：造模第一天記錄好給的干墊料重量，第二天按規(guī)定時間稱含有尿液及大便的濕墊料的重量并記錄，然后在恒溫鼓風(fēng)干燥箱100℃下2小時烘干后再次稱重，計算各組尿量；大便量：計算100g體重相對應(yīng)的大便量并記錄。APO勃起試驗或APO實驗方法為參考Heaton等的方法，將試驗大鼠置于觀察箱中10～15min適應(yīng)環(huán)境，保持安靜，調(diào)暗燈光，在大鼠頸項皮膚注射阿撲嗎啡(APO)90μg/kg(0.5mg/kg維生素C于中溶解阿樸嗎啡后，與5mL/kg生理鹽水混勻)，注射后立刻觀察，計時器計時，觀測并記錄1800s內(nèi)大鼠的勃起潛伏期和勃起次數(shù)。陰莖勃起的標(biāo)準(zhǔn)：勃起時大鼠呈蹲踞位，陰莖體末端伸出，低頭舔舐陰莖頭。勃起潛伏期為注射后至第一次勃起的時間。勃起次數(shù)為注射后1800s內(nèi)大鼠出現(xiàn)陰莖勃起的次數(shù)。若1800s內(nèi)未見勃起，則該大鼠勃起次數(shù)記為0,勃起潛伏期記為1800s。交配實驗方法：將雄鼠和雌鼠(已進(jìn)行發(fā)情期制備)分別置于不同的觀察箱中適應(yīng)環(huán)境，10～15分鐘后按雌雄比例1:2放入同一個觀察箱中，觀測1800s內(nèi)雄性大鼠的爬背、插入和射精潛伏期以及爬背、插入和次數(shù)。若1800s內(nèi)雄性大鼠未進(jìn)行爬背，則該大鼠爬背潛伏期記為1800s，爬背次數(shù)記為0。插入與射精行為同理。在本發(fā)明實施例中，首先建造正常對照組(N)、異常黏液質(zhì)證候組(ZM)和異常黏液質(zhì)病證組(BM)大鼠。在本發(fā)明實施例中，對所述N組、ZM組和BM組大鼠的獲取方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的建立異常黏液質(zhì)證候動物模型的技術(shù)方案即可；在本發(fā)明實施例中，優(yōu)選具體包括以下步驟：選擇性成熟期雌鼠，去勢手術(shù)后常規(guī)條件下飼養(yǎng)，將所述雌鼠在發(fā)情期與雄鼠進(jìn)行交配實驗和APO實驗測試，得到有正常性功能的雄鼠。本發(fā)明對所述交配實驗和APO實驗的時間順序沒有特殊限制。所述交配實驗和APO實驗的對象為所述正常對照組和造模組大鼠。在本發(fā)明實施例中，所述交配的具體步驟優(yōu)選為將已進(jìn)行發(fā)情期的雄鼠和雌鼠分別置于不同的觀察箱中適應(yīng)環(huán)境，10～15min后按雌雄比例1:2放入同一個觀察箱中，觀測1800s內(nèi)雄性大鼠的爬背、插入和射精潛伏期以及爬背、插入和次數(shù)，若1800s內(nèi)雄性大鼠未進(jìn)行爬背，則該大鼠爬背潛伏期記為1800s，爬背次數(shù)記為0；插入與射精行為同理。本發(fā)明根據(jù)所述交配的結(jié)果將具有正常交配能力的雄鼠納入正常對照組和造模組，對無正常交配能力雄鼠進(jìn)行淘汰。在本發(fā)明實施例中，所述APO實驗具體步驟優(yōu)選為將實驗大鼠置于觀察箱中10～15min適應(yīng)環(huán)境，保持安靜，調(diào)暗燈光，在大鼠頸項皮膚注射90μg/kg阿撲嗎啡APO，注射后立刻觀察，計時器計時，觀測并記錄1800s內(nèi)大鼠的勃起潛伏期和勃起次數(shù)；所述勃起的標(biāo)準(zhǔn)為勃起時大鼠呈蹲踞位，陰莖體末端伸出，低頭舔舐陰莖頭；所述勃起潛伏期為注射后至第一次勃起的時間；所述勃起次數(shù)為注射后1800s內(nèi)大鼠出現(xiàn)陰莖勃起的次數(shù)；若1800s內(nèi)未見勃起，則該大鼠勃起次數(shù)記為0，勃起潛伏期記為1800s。本發(fā)明實施例中根據(jù)所述APO測試的結(jié)果將具有正常陰莖勃起功能的雄鼠納入正常對照組和造模組，對無正常陰莖勃起功能雄鼠進(jìn)行淘汰。在本發(fā)明實施例中，所述90μg/kg阿撲嗎啡溶液優(yōu)選包括90μg阿樸嗎啡溶解于0.5mg/kg維生素C和生理鹽水中，調(diào)整體積為5ml/kg。在本發(fā)明實施例中，所述正常對照組在常規(guī)環(huán)境中飼養(yǎng)，喂食的環(huán)境溫度為18～22℃，所述喂食環(huán)境的相對濕度為40～60％；造模組的喂食的環(huán)境溫度為8～12℃，所述喂食環(huán)境的相對濕度70～80％；正常對照組為普通飼料，造模組喂食飼料為濕寒性飼料。在本發(fā)明實施例中，所述生物學(xué)表征觀測是指定性和定量觀測和記錄。定性指標(biāo)觀測：所述定性指標(biāo)觀測為皮膚毛發(fā)在日光下觀察，情緒反應(yīng)以一籠內(nèi)各大鼠相互反應(yīng)為主觀察30分鐘，行為狀態(tài)以此期間內(nèi)的活動為主、安靜環(huán)境下觀察30分鐘，興奮程度以夾尾實驗時的反應(yīng)為主，舌象舌苔在日光下觀察、記錄并拍照，飲食水狀態(tài)以各組同一時間喂飼觀察飲食水狀態(tài)，小便以各組大鼠當(dāng)日正排尿時顏色為主，大便狀態(tài)以當(dāng)日正排大便時大便形態(tài)為主；定量指標(biāo)為避免生理節(jié)奏的影響，每天固定于20:00-22:00收集各項資料，其中體重：每天按規(guī)定時間稱重并記錄，以每籠總體重除以該籠大鼠只數(shù)，得出平均體重，并按下述公式得出模型組各籠體重比值并記錄，體重比值＝模型組平均體重-模型組初始體重/正常組平均體重-正常組初始體重；飲食量：每天20:00添加飼料300g，次日20:00稱食物余量，根據(jù)下述公式得出100g體重相對應(yīng)的飲食量并記錄；飲水量：每天20:00給水500ml，次日20:00量剩余水量，計算得出100g體重相對應(yīng)的飲水量并記錄；尿量：造模第一天記錄好給的干墊料重量，第二天按規(guī)定時間稱含有尿液及大便的濕墊料的重量并記錄，然后在恒溫鼓風(fēng)干燥箱100℃下2小時烘干后再次稱重，計算各組尿量；大便量：計算100g體重相對應(yīng)的大便量并記錄。得到有正常性功能(正常交配能力和陰莖勃起功能)的雄鼠后，本發(fā)明將得到的有正常性能的雄鼠分為正常對照組和造模組，所述正常對照組在常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)，所述造模組以濕寒性飼料喂養(yǎng)，在濕寒環(huán)境中飼養(yǎng)，觀察并記錄正常組和造模組的生物學(xué)表征觀。包括定性指標(biāo)和定量指標(biāo)。定性指標(biāo)觀測所有組大鼠的皮膚毛發(fā)、情緒反應(yīng)、興奮程度、睡眠狀態(tài)、飲水狀態(tài)、尿量性質(zhì)、大便狀態(tài)和舌象舌苔。定量指標(biāo)為記錄所有組大鼠的體重、飲食量、飲水量、尿量和大便量。在造模過程中發(fā)現(xiàn)大鼠皮膚毛發(fā)稍暗淡，無光澤；倦怠，蜷臥少動；對刺激敏感，喜扎堆，倦怠嗜睡；無爭水現(xiàn)象；尿量清，色淡，量多；大便時軟時溏；舌苔暗，舌苔白膩。且隨著造模時間的延長，造模組體重增長緩慢，飲食量增加，飲水量減少，大小便量顯著增多，上述生物學(xué)表征符合維醫(yī)臨床證侯特點，從而獲得了異常黏液質(zhì)證侯大鼠模型，且該模型具有良好的科學(xué)性、可靠性和穩(wěn)定性。通過APO和交配實驗從證候模型組中篩選出異常黏液質(zhì)型陽痿病證結(jié)合模型(陰莖勃起功能障礙和無交配能力)，從而獲得異常黏液質(zhì)病證動物模型。本發(fā)明對所述證候成模率達(dá)100％，病證模型成模率達(dá)到50％以上，病證模型的周期優(yōu)選為22～25周。在本發(fā)明實施例中，所述N組的大鼠數(shù)量優(yōu)選為10只。在本發(fā)明實施例中，所述常規(guī)環(huán)境下飼養(yǎng)的方法同上步驟中的常規(guī)環(huán)境飼養(yǎng)方法。本發(fā)明中，所述N組的喂養(yǎng)量優(yōu)選為每日300g的普通飼料。所述普通飼料為包括500ml水和80g墊料。本發(fā)明對所述墊料沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的墊料即可。本發(fā)明中，所述的實驗組的大鼠的數(shù)量優(yōu)選為20只。本發(fā)明中，所述的濕寒性飼料為菠菜實和芫荽實與常規(guī)飼料的混合物。在本發(fā)明實施例中，所述濕寒性飼料優(yōu)選為：每1kg常規(guī)飼料中包括100～200g芫荽實和100～200g菠菜實，更優(yōu)選每1kg常規(guī)飼料中包括150g芫荽實和150g菠菜實。本發(fā)明對常規(guī)飼料沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的用于飼養(yǎng)大鼠的飼料均可。本發(fā)明對所述菜實與芫荽實的來源也沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的菜實與芫荽實即可。在本發(fā)明實施例中，所述菜實與芫荽實的來源購自于新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院草藥房。本發(fā)明中，所述的濕寒性飼料的喂養(yǎng)量優(yōu)選為每日300g。本發(fā)明中，所述濕寒環(huán)境的溫度優(yōu)選為8～12℃，所述濕寒環(huán)境的濕度優(yōu)選為70～80％。本發(fā)明對提供所述濕寒環(huán)境的設(shè)施沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的提供濕寒環(huán)境的設(shè)施即可。本發(fā)明中實例中，提供濕寒環(huán)境的設(shè)施為人工氣候箱。本發(fā)明中，所述濕寒性飼料喂養(yǎng)的時間優(yōu)選為于北京時間09:00至21:00放入，其它時間放置于對照大鼠相同的飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。本發(fā)明中，所述APO實驗和交配實驗的方法和驗證結(jié)果同上述APO實驗和交配實驗的方法和驗證結(jié)果。本發(fā)明對所述采血前優(yōu)選對大鼠進(jìn)行麻醉。本發(fā)明對所述麻醉的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的麻醉方法即可。本發(fā)明實施例中，所述的麻醉方法為腹腔注射。本發(fā)明對所述麻醉過程中使用的麻醉劑優(yōu)選為戊巴比妥鈉。所述的戊巴比妥鈉的來源購自和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司。在本發(fā)明實施例中，所述采集外周血的具體方法優(yōu)選為將麻醉后的大鼠快速從腹主動脈取血。在本發(fā)明實施例中，所述分離血清的方法優(yōu)選為將新鮮大鼠全血立即置4℃環(huán)境，30～40min后以3000～3500rpm的速度離心5～10min，將得到的上清液在4℃條件下，以3000～3500rpm的速度再次離心，得到血清，將最終離心得到的血清放置于-80℃超低溫冰箱備用。所述的4℃環(huán)境優(yōu)選為4℃冰箱。得到血清后，本發(fā)明實施例對血清中提取蛋白質(zhì)，檢測，得到已知濃度血清蛋白質(zhì)。本發(fā)明實施例中，在提取蛋白前優(yōu)選按照組別分別進(jìn)行混樣，得到三組血清樣品。本發(fā)明實施例對所述提取蛋白質(zhì)的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的提取蛋白質(zhì)的方法即可。本發(fā)明實施例中，所述提取蛋白質(zhì)的方法為TCA-丙酮沉淀法。本發(fā)明實施例中，所述檢測優(yōu)選包括對蛋白質(zhì)含量的檢測和對蛋白質(zhì)完整性的檢測。本發(fā)明實施例中，所述對蛋白質(zhì)含量的檢測方法優(yōu)選為Bradford法，所述對蛋白質(zhì)完整性的檢測方法優(yōu)選為SDS-PAGE法。得到已知濃度的蛋白質(zhì)后，本發(fā)明實施例對所述蛋白質(zhì)用iTRAQ標(biāo)記試劑盒標(biāo)記，得到標(biāo)記的蛋白質(zhì)，經(jīng)純化，得到純化后肽段。在本發(fā)明實施例中，在所述標(biāo)記前優(yōu)選將得到的已知濃度的蛋白質(zhì)進(jìn)行消化。本發(fā)明實施例對所述消化的方法沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的蛋白質(zhì)消化方法即可。在本發(fā)明實施例所述消化采用胰蛋白酶消化法。本發(fā)明實施例對所述iTRAQ標(biāo)記試劑盒的來源沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的iTRAQ標(biāo)記試劑盒的市售商品即可。本發(fā)明實施例使用的試劑盒為Reagent-8PlexMultiplexKit(AppliedBiosystem)8標(biāo)iTRAQ試劑，其中包括8種等量的同位素試劑(報告基團(tuán)質(zhì)量113-121，不包括120)，能對蛋白質(zhì)酶解后肽段進(jìn)行標(biāo)記，從而結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜等方法，可以對肽段進(jìn)行精確鑒定和定量。在本發(fā)明實施例中，所述純化優(yōu)選采用HPLC進(jìn)行肽段的純化。所述進(jìn)行純化的儀器采用型號為(發(fā)明人提供)安捷倫常規(guī)液相。本發(fā)明實施例中使用SCX強(qiáng)陽離子交換柱分離，在pH＝3磷酸緩沖液中，使用20％-30％的梯度洗脫液(10mMKH2PO4,2MKCl,25％ACN，pH＝3)，洗脫條件和梯度參考儀器和耗材具體操作說明即可，洗脫消化后的肽段。洗脫后的跳段使用C18反相色譜脫鹽處理。得到純化肽段后，本發(fā)明實施例對所述純化的肽段經(jīng)質(zhì)譜檢測后得到質(zhì)譜總圖，將所述指紋圖譜在PD軟件中篩選，在本發(fā)明實施例中，所述質(zhì)譜檢測的儀器采用型號為ThermofisherQ-Exactive的質(zhì)譜儀。在本發(fā)明實施例中，所述PD軟件的版本為ProteomeDiscoverer1.3，購自美國thermo公司。本發(fā)明實施例中，質(zhì)譜篩選的參數(shù)如下：PD提取后的譜圖，用mascot搜索，得到搜索結(jié)果，使用PD軟件根據(jù)mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析。定性檢索參數(shù)如下：注：Fixedmodification是固定修飾；Carbamidomethyl(C)是還原烷基化處理后，半胱氨酸產(chǎn)生的脲甲基化。Variablemodification是可變修飾；Oxidation(M)是蛋氨酸的氧化；Gln→Pyro-Glu(N-termQ)是指肽段N端存在谷氨酰胺時，可能會產(chǎn)生自身環(huán)化，變成谷氨酸；iTRAQ8plex(K)，iTRAQ8plex(Y)，iTRAQ8plex(N-term)是iTRAQ試劑在不同位置的結(jié)合。peptidetol是一級質(zhì)譜的精度。MS/MStol是二級質(zhì)譜的精度。Maxmissedcleavages是酶解時最大允許漏切的數(shù)目。Enzyme是實驗所使用的酶種類。Database是檢索使用的數(shù)據(jù)庫。Timefilescompressed為數(shù)據(jù)庫建立時間。Numberofsequences為數(shù)據(jù)庫中序列數(shù)。定量檢索參數(shù)如下：參數(shù)名稱實驗選項ProteinratioTypemedianMinimumpeptides1NormalisationmethodmedianP-value<0.05注:ProteinratioType：用來定量的肽段取值方法，median指的是取中位置的方法。Minimumpeptides：用來定量的最少的uniquepeptide數(shù)Normalisationmethod：矯正方法，median指的是選取一組樣品中全部可定量蛋白的中位值來做矯正。P-value蛋白可信度評估，小于0.05代表蛋白可信度大于95％。根據(jù)所述搜索結(jié)果和篩選后的譜圖定量分析，得到的分析數(shù)據(jù)在大鼠數(shù)據(jù)庫(Uniprot-2014-rattus)中檢索，獲得血清總蛋白為318種，F(xiàn)DR<1％，具體見下表。參數(shù)名稱實驗選項Allspectra342077Matchedspectra31609Peptide2758ProteinGroup318注：Allspectra為全部的譜圖數(shù)；Matchedspectra為匹配上的譜圖數(shù)；Peptide為肽段種類數(shù)；ProteinGroup為匹配上的蛋白總數(shù)；FDR為假陽性率，本實施例使用的是假陽性率小于1％來過濾結(jié)果。按照軟件操作規(guī)程，使用相同參數(shù)及方法，鑒定篩選獲得大鼠血清蛋白質(zhì)318種。得到的三組(N、ZM和BM)血清蛋白質(zhì)后，本發(fā)明實施例對所述三組蛋白質(zhì)進(jìn)行維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)的哺乳動物血清差異蛋白的篩選。本發(fā)明實施例對所述異常黏液質(zhì)證(證候)組差異蛋白的篩選方法具體是：所述BM組與N組的血清蛋白質(zhì)相比較，得到BM/N的血清差異蛋白質(zhì)；將ZM組與N組的血清蛋白質(zhì)相比較，得到ZM/N的血清差異蛋白質(zhì)；統(tǒng)計所述BM/N和ZM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類和數(shù)量，得到異常黏液質(zhì)證(證候)組的血清差異蛋白質(zhì)。以下通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例11、造模與分組選用性成熟期雌鼠15只，去勢手術(shù)后正常條件下飼養(yǎng)，交配實驗備用。將雄性大鼠經(jīng)與發(fā)情期雌鼠進(jìn)行交配試驗并結(jié)合APO勃起實驗證實其具有正常性功能(無正常性功能者淘汰)，取30只進(jìn)入實驗，從中再隨機(jī)抽取10只大鼠設(shè)為正常對照組，飼養(yǎng)于常規(guī)環(huán)境下，溫度18～22℃，溫度喂養(yǎng)，環(huán)境相對濕度40～60％，余20只為造模組，以濕寒性飼料喂養(yǎng)，按維吾爾醫(yī)學(xué)對環(huán)境的看法采用人工氣候箱進(jìn)行造模，設(shè)置溫度：8～12℃，濕度為70～80％，12/12小時晝夜交替飼養(yǎng)，其它時間放置于正常組大鼠相同的飼養(yǎng)環(huán)境中飼養(yǎng)。當(dāng)造模組鼠出現(xiàn)皮膚毛發(fā)稍暗淡，無光澤；倦怠，蜷臥少動；對刺激敏感，喜扎堆，倦怠嗜睡；無爭水現(xiàn)象；尿量清，色淡，量多；大便時軟時溏；舌苔暗，舌苔白膩。且隨著造模時間的延長，與對照組相比，造模組體重增長緩慢，飲食量增加，飲水量減少，大小便量顯著增多，上述生物學(xué)表征符合維醫(yī)臨床證侯特點，從而獲得了異常黏液質(zhì)證侯大鼠模型。通過APO和交配實驗從證候模型組中篩選出無陰莖勃起功能和交配能力雄性大鼠，獲得異常黏液質(zhì)型陽痿病證動物模型。本發(fā)明對所述模率達(dá)到50％,以上病證模型的周期優(yōu)選為22～25周。從造模第一周開始每周記錄大鼠的生物學(xué)表征，根據(jù)生物學(xué)表征確定異常黏液質(zhì)證(證候)模型成模情況，本發(fā)明對所述證候模率達(dá)到100％的周期優(yōu)選為8-10周。并在此基礎(chǔ)上，每月進(jìn)行一次APO實驗及交配實驗，APO實驗通過統(tǒng)計勃起的次數(shù)和勃起潛伏期，判斷陰莖勃起功能，交配實驗通過統(tǒng)計爬被潛伏期/次數(shù)、插入潛伏期/次數(shù)和射精潛伏期/次數(shù)這幾項指標(biāo)判斷大鼠的交配能力，當(dāng)出現(xiàn)陰莖勃起功能障礙和交配能力障礙，即陽痿病證成模率達(dá)到50％以后，從異常黏液質(zhì)證(證候)模型組中通過APO實驗及交配實驗篩選陽痿病證大鼠，并納入BM組，余為ZM組。2、外周血采集、組織樣品取材與保存：戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，快速從腹主動脈取血，將新鮮大鼠全血立即置4℃冰箱，30分鐘后以3000rpm的速度離心5min，吸取上清液，再置高速低溫離心機(jī)，在4℃條件下，以3000rpm的速度離心再吸取上清液后，分裝置-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?、蛋白質(zhì)組樣品的制備蛋白質(zhì)提取方法采用TCA-冰丙酮提取。4、iTRAQ標(biāo)記及HPLC(1)iTRAQ標(biāo)記：取各組大鼠血清，按組別混樣后，提取各組蛋白質(zhì)，通過SDS檢測蛋白的完整性及使用Bradford法對蛋白進(jìn)行定量。蛋白質(zhì)經(jīng)Trypsin消化后用ITRAQ標(biāo)記試劑盒(Reagent-8PlexMultiplexKit(AppliedBiosystem))進(jìn)行標(biāo)記，后經(jīng)HPLC(安捷倫常規(guī)液相)進(jìn)行肽段的純化；三組大鼠的血清蛋白質(zhì)的濃度如表1所示。從附圖3中SDS-PAGE凝膠電泳圖片來看，提取的三組蛋白質(zhì)完整性較好，可以用于下游實驗。表1Bradford法對大鼠血清蛋白進(jìn)行定量結(jié)果樣品名稱NBMZM濃度(μg/μL)0.260.390.42定量后，將各組蛋白質(zhì)消化后，用ITRAQ標(biāo)記試劑盒。液相純化后的肽段經(jīng)質(zhì)譜(ThermofisherQ-Exactive質(zhì)譜儀)檢測后獲得指紋圖譜，將質(zhì)譜圖輸入到PD(ProteomeDiscoverer1.3，thermo)軟件后，軟件先對質(zhì)譜譜圖進(jìn)行篩選鑒定，種類，名稱，PD提取后的譜圖用mascot進(jìn)行搜索，搜索結(jié)束后，PD軟件根據(jù)mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析，最后檢索大鼠數(shù)據(jù)庫，獲得最終鑒定到大鼠血清蛋白質(zhì)共計318種，具體參數(shù)如下。本發(fā)明實施例中，質(zhì)譜篩選的參數(shù)如下：母離子質(zhì)量范圍350Da-6000Da二級質(zhì)譜圖中最小峰數(shù)10信噪比S/N域值1.5PD提取后的譜圖，用mascot搜索，得到搜索結(jié)果，使用PD軟件根據(jù)mascot搜索結(jié)果和第一步篩選后的譜圖進(jìn)行定量分析。定性檢索參數(shù)如下：注：Fixedmodification是固定修飾；Carbamidomethyl(C)是還原烷基化處理后，半胱氨酸產(chǎn)生的脲甲基化。Variablemodification是可變修飾；Oxidation(M)是蛋氨酸的氧化；Gln→Pyro-Glu(N-termQ)是指肽段N端存在谷氨酰胺時，可能會產(chǎn)生自身環(huán)化，變成谷氨酸；iTRAQ8plex(K)，iTRAQ8plex(Y)，iTRAQ8plex(N-term)是iTRAQ試劑在不同位置的結(jié)合。peptidetol是一級質(zhì)譜的精度。MS/MStol是二級質(zhì)譜的精度。Maxmissedcleavages是酶解時最大允許漏切的數(shù)目。Enzyme是實驗所使用的酶種類。Database是檢索使用的數(shù)據(jù)庫。Timefilescompressed為數(shù)據(jù)庫建立時間。Numberofsequences為數(shù)據(jù)庫中序列數(shù)。定量檢索參數(shù)如下：參數(shù)名稱實驗選項ProteinratioTypemedianMinimumpeptides1NormalisationmethodmedianP-value<0.05注:ProteinratioType：用來定量的肽段取值方法，median指的是取中位置的方法。Minimumpeptides：用來定量的最少的uniquepeptide數(shù)Normalisationmethod：矯正方法，median指的是選取一組樣品中全部可定量蛋白的中位值來做矯正。P-value蛋白可信度評估，小于0.05代表蛋白可信度大于95％。5、維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)大鼠模型血清差異蛋白的篩選方法(1)維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)大鼠模型血清差異蛋白的篩選方法將BM組與N組的血清蛋白質(zhì)相比較(取差異倍數(shù)大于1.2倍，或者差異倍數(shù)小于0.8，p值小于等于0.05)，使用上述軟件比較得到BM/N的血清差異蛋白質(zhì)；將ZM組與N組的血清蛋白質(zhì)相比較(取差異倍數(shù)大于1.2倍，或者差異倍數(shù)小于0.8，p值小于等于0.05)，使用上述軟件得到ZM/N的血清差異蛋白質(zhì)；統(tǒng)計所述BM/N和ZM/N的差異蛋白的共同蛋白的種類和數(shù)量，得到異常黏液質(zhì)證(證候)的血清差異蛋白質(zhì)共計37種，如下表2所示，其中上調(diào)表達(dá)蛋白28種(差異倍數(shù)大于1.2倍)，下調(diào)表達(dá)蛋白9種(差異倍數(shù)小于0.8)；因此本發(fā)明獲得了維醫(yī)異常黏液質(zhì)證(證候)血清標(biāo)志蛋白體系，如下表3所示：表2異常黏液質(zhì)證(證候)大鼠模型血清差異蛋白表3異常黏液質(zhì)證(證候)血清標(biāo)志蛋白體系6、異常黏液質(zhì)證(證候)大鼠模型血清候選差異蛋白的ELISA檢測隨機(jī)選擇8種血清候選差異蛋白，對異常黏液質(zhì)證(證候)大鼠模型組與對照組進(jìn)行ELISA檢測，以驗證本發(fā)明血清候選差異蛋白是否可以作為異常黏黏液質(zhì)證(證候)的標(biāo)志物：即隨機(jī)選擇檢測第10號蛋白P48199(c反應(yīng)蛋白)；第12號蛋白P26644(β-2-糖蛋白1)；第14號蛋白P20059(血紅素結(jié)合蛋白)；第21號蛋白P06238(α-2-巨球蛋白)；第24號蛋白P04916(視黃醇結(jié)合蛋白4)；第25號蛋白P02767(甲狀腺素運(yùn)載蛋白)；第26號蛋白P02764(α-1-酸性糖蛋白)和第28號蛋白P01015(血管緊張素原)。分別使用雙抗夾心ELISA試劑盒(大鼠C反應(yīng)蛋白(CRP)雙抗夾心試劑盒：伊萊瑞特生物科技有限公司；大鼠β2糖蛋白1(APOH)雙抗夾心試劑盒：武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；大鼠血紅素結(jié)合蛋白(HPx)雙抗夾心試劑盒：試劑盒：Abcam艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；大鼠α2巨球蛋白(α2MG)雙抗夾心試劑盒：試劑盒：武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；大鼠視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)雙抗夾心試劑盒：伊萊瑞特生物科技有限公司；大鼠甲狀腺素運(yùn)載蛋白(TTR)雙抗夾心試劑盒：試劑盒：Abnova亞諾法生技股份有限公司；大鼠α1酸性糖蛋白(α1AG)雙抗夾心試劑盒：Abcam艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司；大鼠血管緊張素原(AGT)雙抗夾心試劑盒：武漢優(yōu)爾生商貿(mào)有限公司；按照試劑盒說明書對正常對照組和證候組大鼠血清進(jìn)行ELSA檢測。測定結(jié)果如圖4A-H所示，由圖4可知，各個異常黏液質(zhì)證(證候)大鼠模型血清候選蛋白含量均高于對照組，這與iTRAQ結(jié)果相符，說明本發(fā)明方法獲得蛋白標(biāo)志物可以作為異常黏液質(zhì)證(證候)血清的生物標(biāo)志物，具體結(jié)果見下表：各組大鼠血清中蛋白含量(s)與N組相比*P<0.05以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3