本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，具體涉及一種9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法。

背景技術(shù)：

Ⅱ型囊泡單胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(VMAT2)是一種位于神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)囊泡膜上的膜蛋白，在單胺類遞質(zhì)的重?cái)z取過程中起著關(guān)鍵作用。分子克隆技術(shù)鑒定表明，VMAT2主要分布于人類及哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)與胰臟組織內(nèi)。VMAT2的變化與多種疾病有關(guān)，如帕金森病(PD)、阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓病(HD)、糖尿病等。近年來，以VMAT2為靶標(biāo)進(jìn)行放射性示蹤顯像，對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行早期診斷、分級(jí)、鑒別診斷、療效監(jiān)測(cè)研究，成為核醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。到目前為止，國內(nèi)外已成功應(yīng)用于臨床的VMAT2顯像劑，都是用于正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層(PET)成像的正電子示蹤藥物，如：¹¹C-α-DTBZ、¹⁸F-FP-α-DTBZ等。

9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪(9-DM-α-DTBZ)是制備PET顯像藥物¹¹C-α-DTBZ的標(biāo)記前體化合物，標(biāo)記過程如下所示：

由于¹¹C半衰期僅為20min，臨床上使用示蹤藥物¹¹C-α-DTBZ需要通過標(biāo)記前體化合物9-DM-α-DTBZ現(xiàn)場(chǎng)制備而得。標(biāo)記前體化合物9-DM-α- DTBZ中雜質(zhì)的含量影響到PET顯像藥物¹¹C-α-DTBZ的純度和標(biāo)記率，進(jìn)一步影響最終的顯像效果。

目前，已報(bào)道的9-DM-α-DTBZ常用的制備方法為：α-二氫丁苯那嗪(α-DTBZ)在氫化鈉、六甲基磷酰三胺及N-甲基苯胺的作用下脫除甲基生成9-DM-α-DTBZ(Chirality，1997，9：59-62)。實(shí)驗(yàn)表明，反應(yīng)完成后，反應(yīng)液中的溶劑和反應(yīng)原料氫化鈉、六甲基磷酰三胺在反應(yīng)后處理的過程中即可除去，而反應(yīng)原料α-DTBZ及N-甲基苯胺則較難去除干凈。因此，在9-DM-α-DTBZ的制備過程中，可能混有的主要雜質(zhì)為α-DTBZ及N-甲基苯胺。

到目前為止，還沒有關(guān)于9-DM-α-DTBZ及其雜質(zhì)α-DTBZ和N-甲基苯胺的分離測(cè)定方法的相關(guān)報(bào)道。盡管有文獻(xiàn)報(bào)道：HPLC法測(cè)定丁苯那嗪原料藥含量，然而，一方面由于9-DM-α-DTBZ原料藥所含雜質(zhì)(主要為α-DTBZ和N-甲基苯胺)和丁苯那嗪原料藥所含雜質(zhì)的差別，另一方面由于9-DM-α-DTBZ和丁苯那嗪化學(xué)結(jié)構(gòu)的差別，申請(qǐng)人通過研究發(fā)現(xiàn)，上述HPLC法測(cè)定丁苯那嗪原料藥含量并不能用于9-DM-α-DTBZ及其雜質(zhì)的分離測(cè)定，采用此HPLC法時(shí)9-DM-α-DTBZ與雜質(zhì)不能完全分離、分離度較差，進(jìn)而導(dǎo)致9-DM-α-DTBZ及其雜質(zhì)α-DTBZ和N-甲基苯胺的含量無法進(jìn)行測(cè)定，也就無法對(duì)9-DM-α-DTBZ的純度和含量進(jìn)行質(zhì)量控制，難以確保PET顯像藥物¹¹C-α-DTBZ的純度和標(biāo)記率，從而不利于PET顯像藥物¹¹C-α-DTBZ使用的有效性和安全性。

因此，建立一種9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的第一個(gè)技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥中的9-DM-α-DTBZ及其主要雜質(zhì)α-DTBZ和N-甲基苯胺完全分離的問題，本發(fā)明要解決的第二個(gè)技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)無法實(shí)現(xiàn)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥中的9-DM-α-DTBZ及其主要雜質(zhì)α-DTBZ和N-甲基苯胺的含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定的問題。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)α-DTBZ和N-甲基苯胺的分離測(cè)定方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一種9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，包括以下步驟：

稱取待測(cè)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥適量，加入體積比為40～90：10～60的醋酸銨緩沖液-甲醇進(jìn)行溶解，制成濃度為0.5～1.5mg/mL的溶液，作為供試品溶液；

照高效液相色譜法，以反相色譜柱為色譜柱，以體積比為40～90：10～60的醋酸銨緩沖液-甲醇為流動(dòng)相，流速為0.5～1.5mL/min，檢測(cè)波長為270～290nm，柱溫為20～35℃；

取所述供試品溶液5～15μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。

優(yōu)選地，本發(fā)明上述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，以體積比為50～75：25～50的醋酸銨緩沖液-甲醇為流動(dòng)相。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，

以體積比為70：30的醋酸銨緩沖液-甲醇為流動(dòng)相；或者

以體積比為50：50的醋酸銨緩沖液-甲醇為流動(dòng)相；或者

以體積比為75：25的醋酸銨緩沖液-甲醇為流動(dòng)相。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，所述醋酸銨緩沖液的濃度為40～60mM、pH值為4～5。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，所述醋酸銨緩沖液的濃度為50mM、pH值為4.5。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，所述反相色譜柱的填充劑為十八烷基硅烷鍵合硅膠。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，所述反相色譜柱的填充劑為粒徑5μm的十八烷基硅烷鍵合硅膠。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，所述反相色譜柱為5μm、4.6×150mm的Sunfire C18反相色譜柱。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，包括以下步驟：

稱取待測(cè)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥適量，加入體積比為70：30的醋酸銨緩沖液-甲醇進(jìn)行溶解，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為供試品溶液；

照高效液相色譜法，以5μm、4.6×150mm的Sunfire C18反相色譜柱為色譜柱，以體積比為70：30的醋酸銨緩沖液-甲醇為流動(dòng)相，流速為1mL/min，檢測(cè)波長為280nm，柱溫為25℃；所述醋酸銨緩沖液的濃度為50mM、pH值為4.5；

取所述供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定；或者

稱取待測(cè)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥適量，加入體積比為50：50的醋酸銨緩沖液-甲醇進(jìn)行溶解，制成濃度為1.0mg/mL的溶液，作為供試品溶液；

照高效液相色譜法，以5μm、4.6×150mm的Sunfire C18反相色譜柱為色譜柱，以體積比為50：50的醋酸銨緩沖液-甲醇為流動(dòng)相，流速為1mL/min，檢測(cè)波長為280nm，柱溫為25℃；所述醋酸銨緩沖液的濃度為50mM、pH值為4.5；

取所述供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定；或者

稱取待測(cè)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥適量，加入體積比為75：25的醋酸銨緩沖液-甲醇進(jìn)行溶解，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為供試品溶液；

照高效液相色譜法，以5μm、4.6×150mm的Sunfire C18反相色譜柱為色譜柱，以體積比為75：25的醋酸銨緩沖液-甲醇為流動(dòng)相，流速為1mL/min，檢測(cè)波長為280nm，柱溫為25℃；所述醋酸銨緩沖液的濃度為50mM、pH值為4.5；

取所述供試品溶液10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，還包括如下9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、N-甲基苯胺對(duì)照品溶液的制備和測(cè)定的步驟：

取9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為0.5～1.5mg/mL的溶液，作為9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為0.5～1.5mg/mL的溶液，作為α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取N-甲基苯胺的對(duì)照品適量，制成濃度為0.5～1.5mg/mL的溶液，作為N-甲基苯胺對(duì)照品溶液；

分別取所述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、所述α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液和所述N-甲基苯胺對(duì)照品溶液各5～15μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。

進(jìn)一步優(yōu)選地，本發(fā)明上述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，還包括如下9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、N-甲基苯胺對(duì)照品溶液的制備和測(cè)定的步驟：

取9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取N-甲基苯胺的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為N-甲基苯胺對(duì)照品溶液；

分別取所述9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、所述α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液和所述N-甲基苯胺對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的上述技術(shù)方案具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，以5μm、4.6×150mm的Sunfire C18反相色譜柱為色譜柱，以體積比為50～75：25～50的醋酸銨緩沖液-甲醇為流動(dòng)相，不僅可以使9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥中9-DM-α-DTBZ及其雜質(zhì)α-DTBZ和N-甲基苯胺實(shí)現(xiàn)完全分離，而且可以對(duì)9-DM-α-DTBZ及其雜質(zhì)α-DTBZ和N-甲基苯胺的含量同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，為9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥中9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪的含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)的含量測(cè)定提供了一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)方法，從而能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)9-DM-α-DTBZ原料藥進(jìn)行質(zhì)量控制，進(jìn)而確保PET顯像藥物¹¹C-α-DTBZ的純度和標(biāo)記率，有利于PET顯像藥物¹¹C-α-DTBZ使用的有效性和安全性。

附圖說明

為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明，其中：

圖1為實(shí)施例1中供試品溶液的HPLC色譜圖；

圖2為實(shí)施例1中9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品的HPLC色譜圖；

圖3為實(shí)施例1中α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品的HPLC色譜圖；

圖4為實(shí)施例1中N-甲基苯胺對(duì)照品的HPLC色譜圖；

圖5為實(shí)施例2中供試品溶液的HPLC色譜圖；

圖6為實(shí)施例3中供試品溶液的HPLC色譜圖；

圖7為對(duì)比例1中供試品溶液的HPLC色譜圖；

圖8為對(duì)比例2中供試品溶液的HPLC色譜圖；

圖9為對(duì)比例3中供試品溶液的HPLC色譜圖；

圖1-9中，9-DM-α-DTBZ表示的為9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪，α-DTBZ表示的為α-二氫丁苯那嗪。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明以下實(shí)施例和實(shí)驗(yàn)例中，9-DM-α-DTBZ表示的為9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪，α-DTBZ表示的為α-二氫丁苯那嗪。

實(shí)施例1

本實(shí)施例9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，包括以下步驟：

稱取待測(cè)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥適量，加入體積比為70：30的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-甲醇進(jìn)行溶解，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為供試品溶液；

取9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取N-甲基苯胺的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為N-甲基苯胺對(duì)照品溶液；

照高效液相色譜法，以Sunfire C18反相色譜柱(5μm、4.6×150mm)為色譜柱，以體積比為70：30的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-甲醇為流動(dòng)相，流速為1mL/min，檢測(cè)波長為280nm，柱溫為25℃；

分別取供試品溶液、9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液和N-甲基苯胺對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。

本實(shí)施例中供試品溶液、9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液和N-甲基苯胺對(duì)照品溶液的HPLC色譜圖分別如圖1-4所示。

由圖1-4可知，實(shí)施例1中，9-DM-α-DTBZ與反應(yīng)原料α-DTBZ、N-甲基苯胺的保留時(shí)間差異大，三者完全分離，分離效果良好；9-DM-α-DTBZ的保留時(shí)間為6.22min，含量為65.1％；α-DTBZ的保留時(shí)間為10.60min，含量為16.6％；N-甲基苯胺的保留時(shí)間為13.88min，含量為18.3％。

實(shí)施例2

本實(shí)施例9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，包括以下步驟：

稱取待測(cè)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥適量，加入體積比為50：50的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-甲醇進(jìn)行溶解，制成濃度為1.0mg/mL的溶液，作為供試品溶液；

取9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取N-甲基苯胺的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為N-甲基苯胺對(duì)照品溶液；

照高效液相色譜法，以Sunfire C18反相色譜柱(5μm、4.6×150mm)為色譜柱，以體積比為50：50的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-甲醇為流動(dòng)相，流速為1mL/min，檢測(cè)波長為280nm，柱溫為25℃；

分別取供試品溶液、9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液和N-甲基苯胺對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。

本實(shí)施例中供試品溶液的HPLC色譜圖分別如圖5所示。

由圖5可知，實(shí)施例2中，9-DM-α-DTBZ與反應(yīng)原料α-DTBZ分離效果稍差；9-DM-α-DTBZ的保留時(shí)間為2.45min，含量為65.4％；α-DTBZ的保留時(shí)間為3.02min，含量為15.4％；N-甲基苯胺的保留時(shí)間為6.68min，含量為19.2％。

實(shí)施例3

本實(shí)施例9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，包括以下步驟：

稱取待測(cè)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥適量，加入體積比為75：25的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-甲醇進(jìn)行溶解，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為供試品溶液；

取9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取N-甲基苯胺的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為N-甲基苯胺對(duì)照品溶液；

照高效液相色譜法，以Sunfire C18反相色譜柱(5μm、4.6×150mm)為色譜柱，以體積比為75：25的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-甲醇為流動(dòng)相，流速為1mL/min，檢測(cè)波長為280nm，柱溫為25℃；

分別取供試品溶液、9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液和N-甲基苯胺對(duì)照品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。

本實(shí)施例中供試品溶液的HPLC色譜圖分別如圖6所示。

由圖6可知，實(shí)施例3中，9-DM-α-DTBZ與反應(yīng)原料α-DTBZ、N-甲基苯胺的保留時(shí)間差異較大，三者完全分離，分離效果較好；9-DM-α-DTBZ的保留時(shí)間為9.65min，含量為66.2％；α-DTBZ的保留時(shí)間為16.28min，含量為16.7％；N-甲基苯胺的保留時(shí)間為18.79min，含量為17.1％。

實(shí)施例4

本實(shí)施例9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，包括以下步驟：

稱取待測(cè)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥適量，加入體積比為90：10的醋酸銨緩沖液(60mM、pH值為4)-甲醇進(jìn)行溶解，制成濃度為1.5mg/mL的溶液，作為供試品溶液；

取9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取N-甲基苯胺的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為N-甲基苯胺對(duì)照品溶液；

照高效液相色譜法，以Sunfire C18反相色譜柱(5μm、4.6×150mm)為色譜柱，以體積比為90：10的醋酸銨緩沖液(60mM、pH值為4)-甲醇為流動(dòng)相，流速為1.5mL/min，檢測(cè)波長為270nm，柱溫為35℃；

分別取供試品溶液、9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液和N-甲基苯胺對(duì)照品溶液各5μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。

實(shí)施例5

本實(shí)施例9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪及其雜質(zhì)的分離測(cè)定方法，包括以下步驟：

稱取待測(cè)9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪原料藥適量，加入體積比為40：60的醋酸銨緩沖液(40mM、pH值為5)-甲醇進(jìn)行溶解，制成濃度為0.5mg/mL的溶液，作為供試品溶液；

取9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取α-二氫丁苯那嗪的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液；

取N-甲基苯胺的對(duì)照品適量，制成濃度為1mg/mL的溶液，作為N-甲基苯胺對(duì)照品溶液；

照高效液相色譜法，以Sunfire C18反相色譜柱(5μm、4.6×150mm)為色譜柱，以體積比為40：60的醋酸銨緩沖液(40mM、pH值為5)-甲醇為流動(dòng)相，流速為0.5mL/min，檢測(cè)波長為290nm，柱溫為20℃；

分別取供試品溶液、9-去甲基-α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液、α-二氫丁苯那嗪對(duì)照品溶液和N-甲基苯胺對(duì)照品溶液各15μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。

實(shí)施例6

本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：流速為0.8mL/min；其余實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)操作步驟均與實(shí)施例1相同。

實(shí)施例7

本實(shí)施例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：流速為1.2mL/min；其余實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)操作步驟均與實(shí)施例1相同。

對(duì)比例1

本對(duì)比例與實(shí)施例1的區(qū)別僅在于：制備供試品溶液的步驟中，加入體積比為20：80的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-乙腈進(jìn)行溶解；作為供試品溶液以體積比為20：80的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-乙腈為流動(dòng)相；以Lichrospher C18反相色譜柱(5μm、4.6×250mm)為色譜柱；流速為0.8mL/min；其余實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)操作步驟均與實(shí)施例1相同。

本對(duì)比例中供試品溶液的HPLC色譜圖分別如圖7所示。

由圖7可知，對(duì)比例1中，9-DM-α-DTBZ與反應(yīng)原料α-DTBZ的保留時(shí)間基本一致，峰形幾乎重疊在一起，分離效果差；9-DM-α-DTBZ的保留時(shí)間為2.10min，α-DTBZ的保留時(shí)間為2.19min，N-甲基苯胺的保留時(shí)間為3.00min。

對(duì)比例2

本對(duì)比例與對(duì)比例1的區(qū)別僅在于：制備供試品溶液的步驟中，加入體積比為50：50的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-乙腈進(jìn)行溶解；作為供試品溶液以體積比為50：50的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-乙腈為流動(dòng)相；其余實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)操作步驟均與對(duì)比例1相同。

本對(duì)比例中供試品溶液的HPLC色譜圖分別如圖8所示。

由圖8可知，對(duì)比例2中，9-DM-α-DTBZ與反應(yīng)原料α-DTBZ的分離度為0.7，分離效果差；9-DM-α-DTBZ的保留時(shí)間為2.24min，α-DTBZ的保留時(shí)間為1.73min，N-甲基苯胺的保留時(shí)間為6.93min。

對(duì)比例3

本對(duì)比例與對(duì)比例1的區(qū)別僅在于：制備供試品溶液的步驟中，加入體積比為80：20的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-乙腈進(jìn)行溶解；作為供試品溶液以體積比為80：20的醋酸銨緩沖液(濃度為50mM、pH值為4.5)-乙腈為流動(dòng)相；其余實(shí)驗(yàn)條件和實(shí)驗(yàn)操作步驟均與對(duì)比例1相同。

本對(duì)比例中供試品溶液的HPLC色譜圖分別如圖9所示。

由圖9可知，對(duì)比例3中，9-DM-α-DTBZ與反應(yīng)原料α-DTBZ的峰形完全重疊在一起，分離效果差；9-DM-α-DTBZ的保留時(shí)間為6.60min，α-DTBZ的保留時(shí)間為6.50min，N-甲基苯胺的保留時(shí)間為9.96min。

顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無需也無法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。