本發(fā)明涉及一種肝素的定量檢測方法，特別涉及一種基于特異性多肽修飾的對肝素的電化學檢測方法。

背景技術：

肝素是一種天然存在的含高電荷密度的聚陰離子的生物大分子，是糖胺聚糖(GAG)家族中最結構復雜的成員。肝素通過與凝血酶抑制劑如抗凝血酶III(ATIII)的相互作用而在血液凝固級聯(lián)中起靜脈內抗凝劑作用。因此，肝素被認為是臨床中廣泛使用的預防和治療劑，特別是作為醫(yī)學上用于手術的抗凝血劑。傳統(tǒng)的血液中的肝素濃度檢測方法(例如aPTT技術、抗Xa測定法或血栓粘度計(TEG))存在一些難題，如成本昂貴，靈敏度低，有些不能提供精確定量的信息等。

近年來，電化學技術發(fā)展迅速，具有許多優(yōu)點，如高靈敏度、快速響應和使用價格低廉的儀器和試劑。而與此同時，多肽由于其對特異性分析物具有強的結合力、高生物相容性和在水溶液中的高溶解度而被廣泛用于生物傳感器。因此本發(fā)明開發(fā)出了一種選擇性高、敏感性高的檢測肝素的新方法。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術中存在的技術問題，本案提供一種肝素的定量檢測方法，采用電化學的方法，在金電極上修飾多肽后，浸入待測試樣品中，樣本中的肝素會與之結合，并且發(fā)生電化學阻抗譜(EIS)的響應，可通過電化學工作站讀出交流阻抗信息，經分析，其與肝素濃度在一定的濃度范圍內存在線性關系，檢測限為0.01μg/mL，遠低于臨床需要的肝素水平。此外，特異性多肽的結合顯示出很高的親和力，并且不受其他生物分子的干擾。所提出的方法也適用于人類全血中的肝素測量。

為實現(xiàn)上述目的，本案通過以下技術方案實現(xiàn)：

一種肝素的定量檢測方法，其包括：

1)以金電極作為工作電極，對金電極進行預處理；

2)將多肽修飾于所述金電極表面；

3)將巰基己醇修飾于所述金電極表面，用于對未修飾上多肽的金電極表面進行占位；

4)將所述金電極插入待測液中進行反應，并采集相應電化學阻抗譜，計算阻抗值；

5)根據阻抗值與肝素濃度的對應關系，獲得待測液中肝素的濃度；

其中，所述多肽序列為CGSGRKRLQVQLSIRT。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測方法，其中，對金電極進行預處理包括：

將金電極在修飾前浸泡于水虎魚洗液中，以除去電極表面吸附的雜質；其中，以體積比為計，所述水虎魚洗液的組成為98％H₂SO₄∶30％H₂O₂＝3∶1。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測方法，其中，對金電極進行預處理還包括：將金電極用碳化硅砂紙打磨至呈鏡面光滑，隨后將金電極分別在乙醇和蒸餾水中超聲清洗。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測方法，其中，對金電極進行預處理還包括：將金電極用0.5M H₂SO₄溶液清洗，隨后用氮氣干燥以待后續(xù)的修飾。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測方法，其中，將多肽修飾于所述金電極表面具體包括：將經預處理的金電極與100μM多肽溶液在常溫下反應16小時；其中，所述多肽溶液中包括有20mM的4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和10mM的三(2-羧乙基)膦(TCEP)。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測方法，其中，將巰基己醇修飾于所述金電極表面具體包括：將已修飾有多肽的金電極在1mM巰基己醇(MCH)溶液中浸泡30分鐘，隨后用雙蒸水徹底沖洗并在氮氣流中干燥待用。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測方法，其中，所述交流阻抗電化學法采用三電極系統(tǒng)，其中，工作電極為金電極，對電極為鉑電極，參比電極為飽和甘汞電極；交流阻抗所用緩沖液為含有KCl、[Fe(CN)₆]^3-和[Fe(CN)₆]^4-的水溶液。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測方法，其中，所述KCl的濃度為1M。

優(yōu)選的是，所述的肝素的定量檢測方法，其中，所述[Fe(CN)₆]^3-和[Fe(CN)₆]^4-的濃度之和為5mM。

本發(fā)明的有益效果是：本案提出的對肝素的檢測方法具有靈敏度高、快速、成本低的特點，檢測限為0.01μg/mL，通過設計的特異性多肽與電化學技術的結合，可以實現(xiàn)肝素生物傳感的應用。

附圖說明

圖1為本案肝素的電化學檢測示意圖。

圖2為金電極不同修飾階段的交流阻抗圖：(a)裸金電極；(b)多肽修飾后；(c)在與肝素相互作用后；(d)在肝素酶處理后。

圖3為血樣的TEG測試結果：(a)普通杯，(b)肝素酶杯。

圖4為結合肝素后的多肽修飾電極的Nyquist圖，(a-f)：0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0μg/mL。

圖5為肝素濃度相對應的阻抗值的標準曲線，圖中誤差條表示三次獨立測量的相對標準偏差。

圖6為肝素檢測量(10.0μg/mL)相對于其他過量的干擾生物分子(包括葡萄糖、ADP、DNA、BSA)的選擇性對比圖：(a)為電化學阻抗譜圖，(b)為電阻值的直方圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

本案列出一實施例的肝素的定量檢測方法，具體可包括：

1)實驗中使用金電極作為工作電極。電極在修飾前需在新配置的水虎魚洗液(98％H₂SO₄：30％H₂O₂＝3:1)中浸泡5分鐘，除去電極表面吸附的雜質。

2)用蒸餾水洗干凈后，將電極用碳化硅砂紙(3000目)打磨到鏡面光滑。然后，將電極分別在乙醇和蒸餾水中超聲清洗各5分鐘。接著，在使用前先在氮氣氛內干燥。

3)處理過的電極用0.5M H₂SO₄溶液進行電化學清洗。然后，將電極用氮氣干燥以進一步修飾。

4)將經預處理的電極與100μM多肽溶液(20mM HEPES和10mM TCEP，pH 7.0)在室溫下反應16小時。多肽序列為CGSGRKRLQVQLSIRT。將修飾的電極進一步在1mM MCH中浸泡30分鐘，用于對未修飾上多肽的金電極表面進行占位，從而可以防止電極界面上的物理吸附。然后，用雙蒸水徹底沖洗并在氮氣流中干燥用于以下實驗。

5)將多肽修飾的電極在室溫下浸入100μL具有不同濃度的肝素中。多肽可以將肝素定位在電極表面上。反應3小時后，用雙蒸水小心沖洗電極，除去非特異性吸附的肝素。

6)所有電化學實驗均使用計算機控制的CHI 660D電化學工作站(CH Instruments，中國)進行。使用三電極系統(tǒng)，其中工作電極是與鉑對電極和飽和甘汞參比電極結合的金電極(直徑2mm)。EIS的緩沖液為含有1M KCl的5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-溶液(5mM[Fe(CN)₆]^3-/4-表示[Fe(CN)₆]^3-和[Fe(CN)₆]^4-的濃度之和為5mM)。

此外，本案還使用了血栓彈力圖儀測試分析肝素來作為對照方法：收集靜脈血樣品并預先注射到檸檬酸鈉抗凝劑管中。將1mL血液樣品加入到標準高嶺土試劑中，充分混合，并靜置4分鐘用于活化。然后，儀器的兩個通道裝載普通杯(測試類型為CK-檸檬酸化高嶺土)和肝素酶杯(測試類型為具有肝素酶的CKH-檸檬酸化高嶺土)。接著，加入20μL CaCl₂試劑和340μL活化血液樣品，然后開始彈力測量，測量時間約30分鐘。測試結果參見圖3。

圖2中的EIS用于表征多步表面修飾階段電極的電化學性質，包括在電極上修飾多肽，肝素的組裝和進一步的肝素酶處理。隨著電化學頻率的增加，典型的阻抗譜通常包含與擴散狀態(tài)和電子轉移過程相對應的線性部分和半圓部分。半圓部分越大，阻抗越大。如圖2所示，在裸電極(曲線a)上沒有觀察到阻抗譜的明顯半圓區(qū)域，由于空間位阻和正電荷的平衡，在多肽修飾的電極(曲線b)上出現(xiàn)一個微小半圓區(qū)域。具有明顯擴大的半圓形區(qū)域的曲線c表示多肽修飾的電極可以特異性吸附肝素，這證明結合的肝素在電極的界面上有效地阻礙電荷轉移。在肝素通過肝素酶降解后觀察到阻抗譜的大幅減少(曲線d)。

圖3通過TEG的實驗驗證在肝素酶的作用下，樣本中的肝素會發(fā)生降解，從而抵消肝素對血液凝固的影響。該實驗結果可用于驗證圖2中肝素酶降解肝素從而使阻抗值恢復為原有水平這一現(xiàn)象。

圖4表明通過多肽修飾電極的肝素結合反應，可以通過電化學阻抗值讀數來評估不同的肝素水平。圖4顯示了不同濃度肝素的典型的nyquist圖。阻抗值隨著肝素濃度的增加而增加。

圖5表明阻抗值在0.05至10.0μg/mL的范圍內顯示與肝素濃度的對數呈線性關系?；貧w方程為y＝256.2x+1298.13(R²＝0.995，重復次數n＝3)，其中y是阻抗值，x是肝素濃度的對數。檢測限為0.01μg/mL，不僅優(yōu)于現(xiàn)有技術中的方法，而且遠低于手術后和長期治療的肝素治療劑量的最大水平。

圖6通過使用一些過量的干擾生物分子(包括葡萄糖，ADP，DNA和BSA)來驗證所提出的多肽方法的特異性。在肝素測定和對照實驗之間存在顯著的電化學信號差異。因此，實驗結果表明多肽-肝素的結合是有效和可靠的，而所有對照分子的阻抗可以忽略不計，證實了所提出方法的高選擇性。(ADP：二磷酸腺苷。BSA：牛血清白蛋白。)

盡管本發(fā)明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細節(jié)和這里示出與描述的圖例。

多肽序列為：CGSGRKRLQVQLSIRT