本發(fā)明屬于藥物分析
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體而言，涉及一種測定羧基麥芽糖鐵分子量及其分布的方法。
背景技術(shù)：
：缺鐵性貧血至今仍是全球普遍而重要的健康問題，尤其是發(fā)展中國家。缺鐵性貧血的治療方法一般采用補(bǔ)鐵藥物治療，目的在于補(bǔ)充血液和組織所缺的鐵，使血紅蛋白恢復(fù)正常水平，并補(bǔ)足貯存鐵?？诜a(bǔ)鐵劑有效、價廉且安全，是缺鐵性貧血的首選藥物。但口服鐵劑含鐵率低，生物利用度低，常有明顯的胃腸道不適癥狀，還受食物成份的干擾以及體內(nèi)鐵儲備的影響，從而影響鐵的吸收和利用，此時口服鐵劑效果往往很差或根本無效。尤其是在許多慢性疾病(包括慢性心功能衰竭、腎功能衰竭等)和腫瘤患者中，體內(nèi)炎性細(xì)胞介質(zhì)增多，炎癥介質(zhì)(如白細(xì)胞介素-6等)能誘導(dǎo)肝臟合成鐵調(diào)節(jié)蛋白，后者下調(diào)胃腸道及體內(nèi)貯鐵細(xì)胞表面膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，從而影響鐵的吸收和利用。此時，注射鐵劑成為首選藥物，它可更快地恢復(fù)鐵儲存，升高血紅蛋白水平。目前世界上供臨床應(yīng)用的注射鐵劑包括右旋糖酐鐵、復(fù)合葡萄糖酸鈉鐵、蔗糖鐵、山梨醇鐵、異麥芽糖酐鐵1000、ferumoxytol(多聚糖超順磁氧化鐵)和羧基麥芽糖鐵。其中羧基麥芽糖鐵由于具有良好的降解速率和物理化學(xué)特性，可以非常有效地將鐵轉(zhuǎn)運(yùn)至體內(nèi)貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，是一種比較理想的注射鐵劑。羧基麥芽糖鐵可以安全快速補(bǔ)鐵并可替代輸血，其克服了口服鐵制療程長、顯效慢、費(fèi)用高、胃腸道反應(yīng)大、一天多次用藥耐受性差的缺點(diǎn)，即使是消化道疾病引起的貧血也可使用；與低分子量的復(fù)合物如山梨醇鐵相比，本品更有效，且毒性更??；本品不受與蔗糖鐵和復(fù)合葡萄糖酸鈉鐵相同的高ph值和滲透壓限制，而導(dǎo)致給藥量受限，此外，其他靜脈鐵劑如蔗糖鐵由于ph值和滲透壓限制每次需要輸注長達(dá)3.5小時(500mg鐵)；從鐵轉(zhuǎn)運(yùn)和復(fù)合物穩(wěn)定性來看，本品與右旋糖酐具有可比性，但其大大降低了右旋糖酐在臨床應(yīng)用中發(fā)生抗體形成或過敏反應(yīng)的風(fēng)險。此外，本品也克服了輸血可能引發(fā)艾滋病、肝炎等感染風(fēng)險和溶血反應(yīng)，以及費(fèi)用也居高不下的缺點(diǎn)。羧基麥芽糖鐵由瑞士vifor公司研發(fā)，于2007年首先在德國上市，商品名ferinject。羧基麥芽糖鐵是一種與羧基麥芽糖復(fù)合的膠體鐵(iii)氫氧化物，是一種釋放鐵的糖聚物，其化學(xué)名稱為多核鐵(iii)氫氧化物4(r)-[聚-(1→4)-o-α-d-吡喃葡萄糖基]-氧基-2(r),3(s),5(r),6-四羥基己酸復(fù)合物，分子式：[feox(oh)y(h2o)z]n[{(c6h10o5)m(c6h12o7)}l]k，其中n≈103，m≈8，l≈11，k≈4(l代表配體的平均支化度)，相對分子量：約為150,000da。羧基麥芽糖鐵在制備過程中，由于反應(yīng)參數(shù)控制的不同，其分子量以及分布會有很大的不同。目前，測定高聚物多糖分子量的方法所采用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)往往與被測物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)不相同，再有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分子量范圍能否全覆蓋被測樣品分子量范圍等問題。由此建立的為相對標(biāo)準(zhǔn)曲線，所測結(jié)果為相對分子量。受到上述條件的影響，所測的結(jié)果與物質(zhì)的實(shí)際分子量有較大的誤差。因此，需要建立一種適合工業(yè)生產(chǎn)的羧基麥芽糖鐵分子量極其分布的測定方法。gpc-las聯(lián)用技術(shù)兼具了gpc法和激光光散射法的特點(diǎn)，不需要采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線而直接快速、準(zhǔn)確的測得羧基麥芽糖鐵的重均分子量及分子量分布。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種不需要采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線而直接快速、準(zhǔn)確的測得羧基麥芽糖鐵的重均分子量及分子量分布的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種羧基麥芽糖鐵分子量及分子量分布測定方法，其特征在于，具體步驟包括：將待檢測的羧基麥芽糖鐵用純水溶解后，加入流動相，調(diào)節(jié)ph值到5-7，過濾，利用gpc系統(tǒng)進(jìn)行分離的同時使用示差折光檢測器和激光光散射檢測器進(jìn)行檢測，將激光光散射檢測器檢測得到的分子量數(shù)據(jù)和示差折光檢測器檢測得到的濃度數(shù)據(jù)通過gpc軟件計算得出羧基麥芽糖鐵的分子量及分子量分布。優(yōu)選地，進(jìn)行分離和檢測時，采用的流動相為超純水、醋酸鈉鹽緩沖溶液、硝酸鈉溶液和磷酸鈉鹽溶液中的至少一種，分析柱為1-4根分離范圍為2,000，000～1000道爾頓的尺寸排阻色譜柱，柱溫保持在20℃-40℃，流速為0.2ml/min—1.0ml/min。更優(yōu)選地，進(jìn)行分離和檢測時，采用的流動相為ph＝5.0～7.0的0.15m醋酸鈉鹽緩沖液。更優(yōu)選地，進(jìn)行分離和檢測時，采用的分析柱為二根分離范圍為1,000,000—1000道爾頓的親水性凝膠柱串聯(lián)。更優(yōu)選地，進(jìn)行分離和檢測時，采用的柱溫為35℃。更優(yōu)選地，進(jìn)行分離和檢測時，采用的流速保持在0.8ml/min。更優(yōu)選地，所述的gpc系統(tǒng)、示差折光檢測器和激光光散射檢測器的儀器常數(shù)校正時采用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為peg，驗(yàn)證儀器常數(shù)用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為葡聚糖右旋糖酐。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用示差折光檢測儀與光散射檢測儀相連接(gpc-las法)測定羧基麥芽糖鐵分子量及其分布，激光光散射檢測器提供分子量的直接測量(無需校準(zhǔn)曲線)；使用示差折光檢測器采集測定濃度，雙檢測器采集的信息通過gpc軟件計算出分子量及其分布信息。本發(fā)明能夠快速、準(zhǔn)確的獲得羧基麥芽糖鐵的分子量及分子量分布，對提高該藥品的內(nèi)在品質(zhì)具有積極意義。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)羧基麥芽糖鐵在水中易溶,其分離用gpc柱為親水性球型高聚物為填充劑，該物質(zhì)的ph耐受范圍為3～11，通常在中性條件下使用。附圖說明圖1為柱溫35℃時的gpc-las圖譜；圖2為流速0.8ml/min時的gpc-las圖譜；具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例形式，對本發(fā)明涉及的羧基麥芽糖鐵分子量以及分布測定方法作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1(1)儀器：高效凝膠滲透色譜儀為英國馬爾文公司生產(chǎn)的omini工作站系統(tǒng)，optilabrex示差折光檢測器，waters公司生產(chǎn)；515hplc泵，waters公司生產(chǎn)；270dual激光光散射檢測器，英國馬爾文公司生產(chǎn)；ve7510gpc脫氣機(jī)，英國馬爾文公司生產(chǎn)。其他具有上述配件及功能的高效液相色譜儀器亦可。(2)色譜條件：色譜柱：色譜柱為shodexohpaksb-806mhq凝膠柱，日本shodex公司生產(chǎn)；流動相：以0.15mph為6.5的醋酸鈉鹽緩沖溶液為流動相。流速：0.8ml/min。進(jìn)樣量：200μl。精密稱取待檢測的羧基麥芽糖鐵供試品100mg，置于10ml容量瓶中，精密量取純水2.0ml加入容量瓶，溶脹并振搖溶液60min，使溶解；加流動相3ml，搖勻，精密量取0.5mol/l的氫氧化鈉溶液2.0ml加入容量瓶使ph調(diào)節(jié)約6.5，再加流動相至容量瓶刻度，搖勻，過0.22um尼龍濾膜濾，即得供試品溶液。吸取供試品溶液200μl，注入液相色譜儀，利用gpc系統(tǒng)進(jìn)行分離的同時使用示差折光檢測器和激光光散射檢測器進(jìn)行檢測，gpc軟件工作站采集示差折光檢測器和激光光散射檢測器信號，并處理得到圖譜。先后檢測得到柱溫為25℃，35℃，45℃時的gpc圖譜，其中圖形以35℃較好,見圖1。實(shí)施例2(1)儀器：高效凝膠滲透色譜儀為英國馬爾文公司生產(chǎn)的omini工作站系統(tǒng)，optilabrex示差折光檢測器，waters公司生產(chǎn)；515hplc泵，waters公司生產(chǎn)；270dual激光光散射檢測器，英國馬爾文公司生產(chǎn)；ve7510gpc脫氣機(jī)，英國馬爾文公司生產(chǎn)。其他具有上述配件及功能的高效液相色譜儀器亦可。(2)色譜條件：色譜柱：色譜柱為shodexohpaksb-806mhq凝膠柱，日本shodex公司生產(chǎn)；流動相：以0.15mph為6.5的醋酸鈉鹽緩沖溶液為流動相。柱溫：35℃。進(jìn)樣量：200μl。精密稱取待檢測的羧基麥芽糖鐵供試品100mg，置于10ml容量瓶中，精密量取純水2.0ml加入容量瓶，溶脹并振搖溶液60min，使溶解；加流動相3ml，搖勻，精密量取0.5mol/l的氫氧化鈉溶液2.0ml加入容量瓶使ph調(diào)節(jié)約6.5，再加流動相至容量瓶刻度，搖勻，過0.22um尼龍濾膜濾，即得供試品溶液。吸取供試品溶液200μl，注入液相色譜儀，利用gpc系統(tǒng)進(jìn)行分離的同時使用示差折光檢測器和激光光散射檢測器進(jìn)行檢測，gpc軟件工作站采集示差折光檢測器和激光光散射檢測器信號，并處理得到圖譜。先后檢測得到流速為0.5ml/min，0.8ml/min，1.0ml/min時的gpc圖譜，圖形以0.8ml/min為優(yōu),見圖2。實(shí)施例3(1)儀器：高效凝膠滲透色譜儀為英國馬爾文公司生產(chǎn)的omini工作站系統(tǒng)，optilabrex示差折光檢測器，waters公司生產(chǎn)；515hplc泵，waters公司生產(chǎn)；270dual激光光散射檢測器，英國馬爾文公司生產(chǎn)；ve7510gpc脫氣機(jī)，英國馬爾文公司生產(chǎn)。其他具有上述配件及功能的高效液相色譜儀器亦可。(2)色譜條件：色譜柱：選用二根分離范圍為1，000，000～1000道爾頓的不銹鋼尺寸排阻色譜柱串聯(lián)，所述的色譜柱為shodexohpaksb-806mhq凝膠柱，日本shodex公司生產(chǎn)；流動相：以0.15mph為6.5的醋酸鈉鹽緩沖溶液為流動相。柱溫：35℃；流速：0.8ml/min。進(jìn)樣量：200μl。(3)實(shí)驗(yàn)步驟：步驟a：精密稱取已知分子量的peg(mw150k)20mg加流動相稀釋，并攪拌45min，使其溶解制成濃度為10mg/ml的peg溶液，另取葡聚糖(mw200k)和右旋糖酐((mw100k))，同法制成濃度為10mg/ml的葡聚糖溶液。步驟b：取peg溶液200μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖由gpc軟件處理計算。用peg溶液獲得的數(shù)據(jù)校正儀器并建立方法，取葡聚糖溶液和右旋糖酐溶液200μl，注入液相色譜儀，再用葡聚糖溶液和右旋糖酐溶液的數(shù)據(jù)結(jié)果復(fù)核peg溶液數(shù)據(jù)校正儀器的準(zhǔn)確性，其結(jié)果應(yīng)在150k±5.0％。步驟c：精密稱取待檢測的羧基麥芽糖鐵供試品100mg，置于10ml容量瓶中，精密量取純水2.0ml加入容量瓶，溶脹并振搖溶液60min，使溶解；加流動相3ml，搖勻，精密量取0.5mol/l的氫氧化鈉溶液2.0ml加入容量瓶使ph調(diào)節(jié)約6.5，再加流動相至容量瓶刻度，搖勻，過0.22um尼龍濾膜濾，即得供試品溶液。步驟d：吸取供試品溶液200μl，注入液相色譜儀，加入到gpc系統(tǒng)中，利用gpc系統(tǒng)進(jìn)行分離的同時使用示差折光檢測器和激光光散射檢測器進(jìn)行檢測，將激光光散射檢測器檢測得到的分子量數(shù)據(jù)和示差折光檢測器檢測得到的濃度數(shù)據(jù)通過gpc軟件計算得出羧基麥芽糖鐵的分子量及分子量分布；為考察gpc-las系統(tǒng)的重現(xiàn)性，將一批羧基麥芽糖鐵重復(fù)進(jìn)樣5次。其結(jié)果見表1。表11批羧基麥芽糖鐵重復(fù)5次的gpc—las結(jié)果比較實(shí)施例4(1)儀器：高效凝膠滲透色譜儀為英國馬爾文公司生產(chǎn)的omini工作站系統(tǒng)，optilabrex示差折光檢測器，waters公司生產(chǎn)；515hplc泵，waters公司生產(chǎn)；270dual激光光散射檢測器，英國馬爾文公司生產(chǎn)；ve7510gpc脫氣機(jī)，英國馬爾文公司生產(chǎn)。其他具有上述配件及功能的高效液相色譜儀器亦可。(2)色譜條件：色譜柱：選用二根分離范圍為1，000，000～1000道爾頓的不銹鋼尺寸排阻色譜柱串聯(lián)，所述的色譜柱為shodexohpaksb-806mhq凝膠柱，日本shodex公司生產(chǎn)；流動相：以0.15mph為6.5的醋酸鈉鹽緩沖溶液為流動相。柱溫：35℃；流速：0.8ml/min。進(jìn)樣量：200μl。(3)實(shí)驗(yàn)步驟：步驟a：精密稱取已知分子量的peg(mw150k)20mg加流動相稀釋，并攪拌45min，使其溶解制成濃度為10mg/ml的peg溶液，另取葡聚糖(mw200k)和右旋糖酐((mw100k))，同法制成濃度為10mg/ml的葡聚糖溶液。步驟b：取peg溶液200μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖由gpc軟件處理計算。用peg溶液獲得的數(shù)據(jù)校正儀器并建立方法，取葡聚糖溶液和右旋糖酐溶液200μl，注入液相色譜儀，再用葡聚糖溶液和右旋糖酐溶液的數(shù)據(jù)結(jié)果復(fù)核peg溶液數(shù)據(jù)校正儀器的準(zhǔn)確性，其結(jié)果應(yīng)在150k±5.0％。步驟c：精密稱取待檢測的羧基麥芽糖鐵供試品100mg，置于10ml容量瓶中，精密量取純水2.0ml加入容量瓶，溶脹并振搖溶液60min，使溶解；加流動相3ml，搖勻，精密量取0.5mol/l的氫氧化鈉溶液2.0ml加入容量瓶使ph調(diào)節(jié)約6.5，再加流動相至容量瓶刻度，搖勻，過0.22um尼龍濾膜濾，即得供試品溶液。步驟d：吸取供試品溶液200μl，注入液相色譜儀，加入到gpc系統(tǒng)中，利用gpc系統(tǒng)進(jìn)行分離的同時使用示差折光檢測器和激光光散射檢測器進(jìn)行檢測，將激光光散射檢測器檢測得到的分子量數(shù)據(jù)和示差折光檢測器檢測得到的濃度數(shù)據(jù)通過gpc軟件計算得出羧基麥芽糖鐵的分子量及分子量分布；為考察gpc-las系統(tǒng)的重現(xiàn)性，測定三份不同批次(批號)羧基麥芽糖鐵的gpc—las圖譜，數(shù)據(jù)見表2。表2：3批羧基麥芽糖鐵分子量測定結(jié)果批次1#2#3#mw(道爾頓)161185167936205863rsd(％)4.82.93.6實(shí)施例5幾種分子量測定方法比較如下：一、本發(fā)明方法(gpc-las法)：儀器和色譜條件與實(shí)施例3相同，測定結(jié)果見表3；二、傳統(tǒng)gpc方法采用示差折光檢測器：取重均分子量(mw)分別為1.0、5.0、20.0、40.0、80.0、100.0萬道爾頓的葡聚糖各50mg加流動相溶解，得到濃度為10mg/ml的溶液，分別注入gpc系統(tǒng)，色譜條件與本發(fā)明方法相同，數(shù)據(jù)處理繪制成分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱定重均分子量(mw)20.0萬道爾頓的右旋糖酐50mg分別溶解，得到濃度為10mg/ml的右旋糖苷溶液；將批號1#的羧基麥芽糖鐵樣品作為供試品，精密稱取待檢測的羧基麥芽糖鐵供試品100mg，置于10ml容量瓶中，精密量取純水2.0ml加入容量瓶，溶脹并振搖溶液60min，使溶解；加流動相3ml，搖勻，精密量取0.5mol/l的氫氧化鈉溶液2.0ml加入容量瓶使ph調(diào)節(jié)約6.5，再加流動相至容量瓶刻度，搖勻，過0.22um尼龍濾膜濾，即得供試品溶液。測定結(jié)果見表3；三、傳統(tǒng)gpc方法采用示差折光檢測器：取重均分子量(mw)分別為1.0、5.0、20.0、40.0、80.0、100.0萬道爾頓的右旋糖酐各50mg加流動相溶解，得到濃度為10mg/ml的溶液，分別注入gpc系統(tǒng)，色譜條件與本發(fā)明方法相同，數(shù)據(jù)處理繪制成分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱定重均分子量(mw)20.0萬道爾頓的葡聚糖50mg分別溶解，得到濃度為10mg/ml的葡聚糖溶液；，將批號1#的羧基麥芽糖鐵樣品作為供試品，精密稱取待檢測的羧基麥芽糖鐵供試品100mg，置于10ml容量瓶中，精密量取純水2.0ml加入容量瓶，溶脹并振搖溶液60min，使溶解；加流動相3ml，搖勻，精密量取0.5mol/l的氫氧化鈉溶液2.0ml加入容量瓶使ph調(diào)節(jié)約6.5，再加流動相至容量瓶刻度，搖勻，過0.22um尼龍濾膜濾，即得供試品溶液。測定結(jié)果見表3；表3多種測定方法比較根據(jù)上述結(jié)果可以看出：本發(fā)明gpc—las法測定出的標(biāo)準(zhǔn)樣品數(shù)值與其報告標(biāo)定數(shù)值誤差≤5.0％，滿足gpc方法對分析檢測精度的要求；傳統(tǒng)gpc方法(葡聚糖校正曲線)在測定與自身相同的葡聚糖樣品時，其測定數(shù)值與其報告標(biāo)定數(shù)值誤差≤5.0％，精度較高，但在測定右旋糖酐標(biāo)準(zhǔn)樣品時結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)定值誤差大于20％；傳統(tǒng)gpc方法(右旋糖酐校正曲線)存在同樣的情況：在測定與自身相同的右旋糖酐樣品時，其測定數(shù)值與其報告標(biāo)定數(shù)值誤差≤5.0％，精度較高，但在測定葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)樣品時結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)樣品標(biāo)定值誤差大于25％：這些測定結(jié)果的偏差是由于這些不同的多糖對照樣品與測定樣品之間結(jié)構(gòu)差異所造成的。高分子多糖均有較長的主鏈或側(cè)鏈構(gòu)成。由于對照品與樣品的結(jié)果不同，造成的了在相同的色譜條件下，其在溶液中的主鏈或側(cè)鏈?zhǔn)嬲範(fàn)顟B(tài)差異較大。同等分子量的情況下，由于溶液中舒展?fàn)顟B(tài)的不同造成了體積的不同。根據(jù)gpc分離原理--尺寸排阻，即樣品溶液進(jìn)入色譜柱后根據(jù)分子體積大小，分子量大物質(zhì)的先分離流出，分子量小的后分離流出。分子量的大小確定是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時間或體積(分離時分子先后流出的時間或體積)繪制成得分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測樣品來對比保留時間或體積來計算。葡聚糖與右旋糖酐兩種多糖，在標(biāo)定分子量相同的情況下，由于在溶液中的分子舒展?fàn)顟B(tài)差異，造成了體積的差異，繼而在分離時產(chǎn)生了流出時間或體積的不同，從而造成測定結(jié)果較大的差異?？傊?，從上述的測定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的檢測方法，克服了傳統(tǒng)gpc的這些缺點(diǎn)，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。羧基麥芽糖鐵在沒有標(biāo)準(zhǔn)品做對照品的時候，本發(fā)明能快速、準(zhǔn)確地測定其分子量。當(dāng)前第1頁12