本發(fā)明屬于檢測(cè)分析領(lǐng)域，具體涉及DNA納米帶模板金顆粒一步法組裝納米項(xiàng)鏈及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

DNA納米技術(shù)源自美國(guó)科學(xué)家Seeman在上個(gè)世紀(jì)80年代提出來(lái)的一個(gè)想法：利用DNA的堿基互補(bǔ)所形成的周期性規(guī)律結(jié)構(gòu)作為蛋白等其他分子結(jié)晶的框架，這樣可以為晶體學(xué)提供一個(gè)理想的研究工具。而在2006年，Rothemund則進(jìn)一步利用M13噬菌體的長(zhǎng)度7249nt的基因組DNA作為主鏈，通過(guò)設(shè)計(jì)人工合成的216條短鏈將其彎曲“折”成了各種二維結(jié)構(gòu)，這就是所謂的“DNA折紙”。該技術(shù)具有過(guò)程簡(jiǎn)單、容易操作和極高產(chǎn)率等優(yōu)點(diǎn)，目前已廣泛應(yīng)用于生物傳感、物質(zhì)檢測(cè)、單分子水平分析、疾病診斷及治療等領(lǐng)域。

納米金即指金的微小顆粒，其直徑在1～100nm，由氯金酸通過(guò)還原法可以方便地制備各種不同粒徑的納米金，其顏色依直徑大小而呈紅色至紫色。納米金顆粒由于具有大的比表面積、高表面能、高的表面活性而展現(xiàn)出小尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)和量子表面尺寸效應(yīng)等特性，使其在催化、光學(xué)、電學(xué)及生物技術(shù)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。尤其是其能與多種生物大分子結(jié)合，且不影響其生物活性。

拉曼光譜(Raman spectra)，是一種散射光譜。拉曼光譜分析法是基于印度科學(xué)家C.V.Raman所發(fā)現(xiàn)的拉曼散射效應(yīng)，對(duì)與入射光頻率不同的散射光譜進(jìn)行分析以得到分子振動(dòng)、轉(zhuǎn)動(dòng)方面信息，并應(yīng)用于分子結(jié)構(gòu)研究的一種分析方法。Feldmann(ühler,P.,Roller,E.M.,Schreiber,R.,Liedl,T.,Lohmüller,T.,&Feldmann,J.Nano Letters,2014(5),2914-2919)和Finkelstein(Pilo-Pais,M.,Watson,A.,Demers,S.,Labean,T.H.,&Finkelstein,G.Nano Letters,2014(4),2099-2104.)兩位學(xué)者于2014年就DNA折紙組裝研究表面拉曼增強(qiáng)效應(yīng)，但迄今為止，尚沒(méi)有使用DNA納米帶將金納米顆粒組裝成納米結(jié)構(gòu)，用于拉曼檢測(cè)和其他方面的研究和專利文獻(xiàn)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出一種簡(jiǎn)單易操作的通過(guò)DNA納米帶和金納米顆粒組裝構(gòu)建納米項(xiàng)鏈的方法，通過(guò)合成金納米顆粒，與DNA納米帶組裝，構(gòu)建成納米項(xiàng)鏈結(jié)構(gòu)，納米項(xiàng)鏈有序的結(jié)構(gòu)經(jīng)過(guò)拉曼信號(hào)分子修飾后可以使得信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)，豐富了DNA納米結(jié)構(gòu)的檢測(cè)手段。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：基于DNA納米帶模板金顆粒組裝納米項(xiàng)鏈的方法，包含以下步驟：

A：合成制備金納米顆粒；

B：將摩爾濃度為1μmol/L～5μmol/L的DNA骨架鏈與摩爾濃度為1μmol/L～5μmol/L的訂書(shū)釘單鏈按按體積比1:1～1:5混合；

C：加入金納米顆粒，并攪拌混勻；

D：將步驟C的溶液在45℃～25℃條件下梯度退火，形成納米項(xiàng)鏈結(jié)構(gòu)。

進(jìn)一步，上述金納米顆粒由以下方法制備：

(2.1)將濃度為1％～2％的氯金酸溶液置于加蓋的容器中，攪拌并油浴煮沸；

(2.2)往步驟2.1中的溶液加入摩爾濃度為0.01mol/L～1mol/L的檸檬酸鈉，煮沸

并大力攪拌1min～30min；

(2.3)關(guān)閉熱源，大力攪拌1min～30min，靜置直至室溫。

作為優(yōu)選，上述金納米顆粒為20nm金顆粒。

為進(jìn)一步增強(qiáng)拉曼光譜分析時(shí)的信號(hào)，上述金納米顆粒可以經(jīng)ssDNA1所示核苷酸序列修飾，包含以下步驟：

(3.1)金納米顆粒溶液與ssDNA1所示核苷酸序列按摩爾比為100:1～20:1混合，攪拌混勻，在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(3.2)將步驟3.1溶液滴加氯化鈉溶液，滴加3～5次，每次滴加不超過(guò)5μL，間隔時(shí)間0.5～1h，滴加完畢后在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(3.3)采用離心提純法濃縮步驟3.2獲得的溶液，將離心產(chǎn)物常溫保存。

上述離心提純法的離心提純參數(shù)優(yōu)選為9000rpm，10min，離心提純?nèi)巍?/p>

作為優(yōu)選，上述2.1步驟中的容器為三頸燒瓶。

作為優(yōu)選，上述2.1步驟中的油浴的溫度為150℃。

本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn)：

(1)DNA納米帶結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，形成產(chǎn)率高，對(duì)外界環(huán)境要求低，同時(shí)具有精確的空間可尋址性，加入納米金顆粒后避免了繁瑣的標(biāo)記步驟；

(2)金納米顆?？梢酝ㄟ^(guò)化學(xué)方法大量合成，大大降低成本；

(3)4-mba信號(hào)分子具有很強(qiáng)的拉曼信號(hào)，修飾納米項(xiàng)鏈，使其在拉曼檢測(cè)中更具有優(yōu)勢(shì)；

(4)借助原子力顯微鏡和透射電鏡對(duì)納米項(xiàng)鏈進(jìn)行表征，因此具有簡(jiǎn)便、可靠、低成本、較低的實(shí)驗(yàn)條件要求等優(yōu)勢(shì)。

附圖說(shuō)明

圖1為納米項(xiàng)鏈結(jié)構(gòu)組裝和檢測(cè)示意圖；

圖2為合成20nm金納米顆粒透射電鏡圖；

圖3為合成DNA納米帶AFM圖；

圖4為一步法合成金納米項(xiàng)鏈AFM圖；

圖5為對(duì)納米項(xiàng)鏈上修飾4-MBA的拉曼信號(hào)檢測(cè)結(jié)果，其中包含納米項(xiàng)鏈的透射電鏡圖。

具體實(shí)施方式

現(xiàn)結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，以使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚。

本發(fā)明中，20nm金納米顆?？梢杂梢韵路椒ㄖ频茫?/p>

(1.1)將濃度為1％～2％的氯金酸溶液置于加蓋的三頸燒瓶中，攪拌并油浴煮沸；

(1.2)往步驟1.1中的溶液加入摩爾濃度為0.01mol/L～1mol/L的檸檬酸鈉，煮沸并大力攪拌1min～30min。

(1.3)關(guān)閉熱源，大力攪拌1min～30min，靜置直至室溫待用。

金納米顆粒為經(jīng)ssDNA1所示核苷酸序列修飾后的金納米顆粒，由以下方法制得：

(2.1)金納米顆粒溶液與ssDNA1所示核苷酸序列按摩爾比為100:1～20:1混合，攪拌混勻，在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(2.2)將步驟2.1溶液滴加氯化鈉溶液，滴加3～5次，每次滴加不超過(guò)5μL，間隔時(shí)間0.5～1h，滴加完畢后在20～40℃條件下震蕩孵育2～10h；

(2.3)采用離心提純法濃縮步驟2.2獲得的溶液，將離心產(chǎn)物常溫保存。

在上述準(zhǔn)備的基礎(chǔ)上，納米項(xiàng)鏈可以通過(guò)以下方法制備：

(3.1)將摩爾濃度為1μmol/L～5μmol/L的DNA骨架鏈與摩爾濃度為1μmol/L～5μmol/L的訂書(shū)釘單鏈按按體積比1:1～1:5混合，加入離心產(chǎn)物并攪拌混勻；

(3.2)將步驟3.1的溶液在45℃～25℃條件下梯度退火。

本發(fā)明所述納米項(xiàng)鏈結(jié)構(gòu)構(gòu)建方法，如圖1所示，如下：在DNA納米帶中的訂書(shū)釘鏈伸出捕獲立鏈，利用DNA特異性雜交，將修飾上巰基DNA的金納米顆粒組裝上DNA納米帶，經(jīng)4-MBA拉曼信號(hào)分子修飾后使用拉曼儀器檢測(cè)其信號(hào)強(qiáng)度。

為便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解和實(shí)施本發(fā)明，現(xiàn)提供如下的相關(guān)實(shí)施例：實(shí)施例1：關(guān)于如何制備20nm金納米顆粒

(1)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的氯金酸溶液置于加蓋的三頸燒瓶中，攪拌并油浴(150℃)煮沸；

(2)往步驟(1)中的溶液加入摩爾濃度為40mmol/L的檸檬酸鈉，煮沸并大力攪拌10min，使溶液混勻；

(3)關(guān)閉熱源，大力攪拌15min，溶液從黃色變成紅色，靜置直至室溫；

(4)反應(yīng)結(jié)束后，采用離心提純法濃縮步驟(3)獲得的溶液，將離心產(chǎn)物分散到超純水中。

通過(guò)透射電子顯微鏡表征本實(shí)施例制備獲得的20nm金納米顆粒的形貌，結(jié)果如圖2所示。從TEM圖結(jié)果可見(jiàn)，本實(shí)施例制備獲得的金納米顆粒材料粒徑均一、分布均勻，進(jìn)過(guò)測(cè)量統(tǒng)計(jì)，金納米顆粒的直徑為20±2nm。實(shí)施例1制備獲得的金納米顆粒溶液用于實(shí)施例2中制備經(jīng)ssDNA1修飾的金納米顆粒的原料。

實(shí)施例2：關(guān)于制備經(jīng)ssDNA1修飾的金納米顆粒

取實(shí)施例1中150μL金納米顆粒溶液，制備ssDNA1修飾的金納米顆粒：

(1)將150μL金納米顆粒溶液離心清洗1次，9000rpm離心10分鐘，將離心產(chǎn)物分散到100μL超純水中；

(2)取5μL 100μM的ssDNA1加入到步驟(1)中的溶液，同時(shí)加入1.5μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1％的十二烷基硫酸鈉溶液，震蕩混勻，置于溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為250rpm的恒溫?fù)u勻儀，震蕩孵育4h；

(3)往步驟(2)溶液中滴加2mol/L的氯化鈉溶液，每次滴加2.5μL，間隔半小時(shí)，滴加4次，滴加完畢后，置于溫度為37℃、轉(zhuǎn)速為250rpm的恒溫?fù)u勻儀，震蕩孵育8h；

(4)步驟(3)反應(yīng)結(jié)束后，采用離心提純法濃縮步驟(3)獲得的ssDNA1修飾的納米金棒，離心提純參數(shù)為9000rpm，10min，離心提純?nèi)?，最終得到15μL的濃縮金納米顆粒溶液，常溫放置待用。

其中，與末端修飾捕獲鏈的訂書(shū)釘鏈互補(bǔ)的SH-DNA序列如下：

5’-TTTTTTTTTTTTTTT AGCGA-3’，(ssDNA1)。

實(shí)施例3：關(guān)于基于DNA納米帶模板金顆粒的組裝方法

(1)將摩爾濃度為4μmol/L的DNA骨架鏈(nanoribbon-scafford)與摩爾濃度為4μmol/L的訂書(shū)釘單鏈(nanoribbon-staple1,Modificatory nanoribbon-staple1,nanoribbon-staple2,nanoribbon-staple3,Modificatory nanoribbon-staple3)按等體積混合，每種鏈各取2μL，加入10μL 1×TAE-Mg緩沖液至20μL，震蕩混勻。再加入例2中濃縮金納米顆粒溶液10μL，震蕩混勻。

(2)將步驟(1)混合溶液置于PCR儀中以0.1℃/10s的速率從45℃～25℃退火，取新解離的云母片，滴入5μL反應(yīng)后的上述混合物，干燥后，采用原子力顯微鏡進(jìn)行表征，表征結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。

從圖3中可以看出合成的DNA納米帶產(chǎn)率極高，納米帶的長(zhǎng)度大概在1μm左右。在圖4中，大部分的DNA納米帶都已與金納米顆粒組裝，組裝金顆粒數(shù)目最多的有25個(gè)，因?yàn)榧{米帶的長(zhǎng)度不均一，所以組裝上的金顆粒數(shù)目也不一樣。

其中，DNA骨架鏈和訂書(shū)釘單鏈的序列如下：

5’-CAGGGCTGGGCATAGAAGTCAGGGCAGAGACGAGTTGAGAATACGAGTTGAGAATACGAGTTGAGAATCCGACCATTGTGCGCTATCTTCATCTTA-3’，(nanoribbon-scafford)。

5’-CAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’，(nanoribbon-staple1)。

5’-AAAAAAAAAAAAAAACAGCCCTGTAAGATGAAGATAGCGTCTATGCC-3’(Modificatory nanoribbon-staple1)。

5’-CCCTGACTCACAATGGTCGGATTCCGTCTCTG-3’，(nanoribbon-staple2)。

5’-TCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’，(nanoribbon-staple3)。

5’-AAAAAAAAAAAAAAATCTCAACTTCAACTCGTATTCTCAACTCGTAT-3’(Modificatory nanoribbon-staple3)。

實(shí)施例4：關(guān)于對(duì)納米項(xiàng)鏈拉曼信號(hào)檢測(cè)

取300目碳支持膜，滴入10μL例3反應(yīng)后的溶液，常溫干燥后采用透射電子顯微鏡進(jìn)行表征，表征結(jié)果如圖5中的小圖所示，我們可以看到形成的金納米項(xiàng)鏈中各個(gè)金納米顆粒間距均一，且平均間距小于5nm。

取長(zhǎng)寬為1cm×1cm的硅片，在其光滑面滴入5μL的DNA納米帶、20nm金顆粒和金納米項(xiàng)鏈溶液，靜置10min，使樣品吸附到硅片表面。再往20nm金顆粒和金納米項(xiàng)鏈溶液中滴加4-MBA拉曼信號(hào)分子，靜置2h，4-MBA充分附著到金納米顆粒表面。使用拉曼顯微鏡測(cè)試三個(gè)樣品的拉曼信號(hào)(激發(fā)光波長(zhǎng)為633nm)，結(jié)果如圖5所示，信號(hào)最低的為DNA納米帶，接近為0；金納米顆粒修飾上4-MBA拉曼信號(hào)分子后的信號(hào)強(qiáng)度較DNA納米帶高，1075cm^-1和1580cm^-1兩處為4-MBA的信號(hào)強(qiáng)度峰；金納米項(xiàng)鏈修飾上4-MBA拉曼信號(hào)分子后的信號(hào)最強(qiáng)，大約為金納米顆粒的3倍。有以上結(jié)果可以得出以下結(jié)論：經(jīng)DNA納米帶組裝的金納米顆粒，由于顆粒間距得以控制，使得拉曼信號(hào)分子的檢測(cè)強(qiáng)度得到成倍的增強(qiáng)，有力地證實(shí)了本發(fā)明所述的DNA納米結(jié)構(gòu)檢測(cè)信號(hào)分子的可靠性。

本發(fā)明利用DNA納米結(jié)構(gòu)和納米金獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，將DNA納米帶和20nm金顆粒組裝成金納米項(xiàng)鏈，該結(jié)構(gòu)與信號(hào)分子的結(jié)合的方法為各種信號(hào)分子的檢測(cè)拓展了思路，開(kāi)辟了新的路徑。

最后說(shuō)明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通過(guò)上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明所限定的范圍。