本發(fā)明涉及到一種人參葉中人參皂苷類成分的含量測定方法，屬中藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的，涉及一種人參葉中人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rb₂、20(S)-人參皂苷F 1和人參皂苷Rd六種成分同時測定的含量測定方法。

背景技術(shù)：

人參葉為五加科植物人參Panax ginseng C.A.Mey.的干燥葉。秋季采收，晾干或烘干。人參葉苦、甘、寒，歸肺、胃二經(jīng)，始載于《本草綱目拾遺》，具有“清肺，生津，止渴”、“補中帶表，生胃津，祛暑氣，降虛火，利四肢頭目”、“生津潤燥，益肺和肝，培補元氣”等功能?，F(xiàn)代研究表明，人參葉的藥理作用與人參極為相似，對腫瘤、肝炎、冠心病、阿狄森氏病有較好的治療效果。同時，人參葉也能提高神經(jīng)活動過程的靈活性。可改善睡眠和情緒，提高腦力、體力等人體機能，有顯著的抗疲勞、利尿及抗輻射作用。能增加機體對各種有害刺激的防御能力。對心肌營養(yǎng)不良、冠狀動脈硬化、神經(jīng)衰弱等均有一定的防治作用。人參葉雖好，不可濫用，隨著人參葉的功效漸漸為人們所熟知，近年來漸有濫用之勢，甚至造成多種毒副作用的出現(xiàn)。科學(xué)、合理地使用人參葉已成為不可忽視的問題，因此，人參葉的質(zhì)量標準有待進一步的提高完善。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供了一種人參葉中人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁、人參皂苷Rb₂、20(S)-人參皂苷F1和人參皂苷Rd 六種成分同時測定的含量測定方法。

本發(fā)明含量測定方法采用超高效液相色譜法，該方法如下：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的微經(jīng)柱；以乙腈為流動相A，水為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動相A由18％漸變至20％；9～13分鐘，流動相A由20％漸變至28％；13～28分鐘，流動相A為28％漸變至35％；檢測波長為203nm；流速0.4ml/min；

混合對照品溶液的制備

稱取人參皂苷Rg₁對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb₁對照品、人參皂苷Rb₂對照品、20(S)-人參皂苷F1對照品、人參皂苷Rd對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg₁ 100μg、人參皂苷Re 500μg、人參皂苷Rb₁ 50μg、人參皂苷Rb₂ 80μg、20(S)-人參皂苷F1 50μg、人參皂苷Rd 200μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備取人參葉粉末，過四號篩，約0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60～80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置75～82℃水浴上回流提取2.5～3小時，放冷，再稱定重量，用同濃度甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1～2μl，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算含量，即得。

本發(fā)明含量測定方法中，供試品溶液制備中水浴回流提取時間優(yōu)選為2.5小時；測定法中分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液的量優(yōu)選為2μl，注入液相色譜儀。

本發(fā)明含量測定方法最優(yōu)的技術(shù)方案為：

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的微經(jīng)柱；以乙腈為流動相A，水為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動相A由18％漸變至20％；9～13分鐘，流動相A由20％漸變至28％；13～28分鐘，流動相A為28％漸變至35％；檢測波長為203nm；流速0.4ml/min；

混合對照品溶液的制備

稱取人參皂苷Rg₁對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb₁對照品、人參皂苷Rb₂對照品、20(S)-人參皂苷F1對照品、人參皂苷Rd對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg₁ 100μg、人參皂苷Re 500μg、人參皂苷Rb₁ 50μg、人參皂苷Rb₂ 80μg、20(S)-人參皂苷F1 50μg、人參皂苷Rd 200μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備取人參葉粉末，過四號篩，約0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置82℃水浴上回流提取2.5小時，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算含量，即得。

為了驗證測定含量方法的穩(wěn)定性、準確性、專屬性及系統(tǒng)適應(yīng)性，對方法進行了以下方法學(xué)驗證實驗，以確保該含量測定方法可以用于人參葉的質(zhì)量控制。

1、儀器與試藥

儀器：Acquity超高效液相色譜儀(二元泵，DAD檢測器)

Ultimate 3000超高效液相色譜儀(四元泵，DAD檢測器)

LC20～AT超高效液相色譜儀(二元泵，DAD檢測器)

對照品：人參皂苷Rg1(中檢院，批號：110703～201530)

人參皂苷Re(中檢院，批號：110754～201525)

人參皂苷Rb₁(中檢院，批號：110704～201424)

人參皂苷Rb₂(中檢院，批號：111715～201203)

20(S)-人參皂苷F1(南通飛宇生物科技有限公司，批號：FY15401226)

人參皂苷Rd(中檢院，批號：111818～201302)

試劑：乙腈為色譜純，水為去離子水，其它試劑均為分析純。

2.色譜條件的確定

參照中國藥典2015年版一部收載的人參色譜條件，確定本品色譜條件為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(微經(jīng)柱)；以乙腈～水為流動相進行梯度洗脫，經(jīng)反復(fù)試驗確定以下的梯度洗脫程序(見表1)。流速：0.4mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：203nm，進樣量：2μl。理論板數(shù)按人參皂苷Re峰計算應(yīng)不低于10000。

表1 流動相梯度洗脫表

3.提取方法的確定

3.1提取方式的選擇

取同一批樣品適量，選取80％甲醇作為提取溶劑，分別采用超聲、回流兩種提取方式進行試驗，按擬定色譜條件測定。結(jié)果表明，采用回流的方式，六種成分的含量測定結(jié)果均高于超聲，因此選用回流作為本實驗的提取方式(結(jié)果見表2)。

表2 不同提取方式六種成分的含量測定結(jié)果

3.2提取溶劑選擇

取同一批樣品適量，分別以甲醇、80％甲醇、60％甲醇、40％甲醇作為提取溶劑，回流提取2h。結(jié)果表明，人參皂苷Rg₁采用以上四種提取溶劑含量測定結(jié)果無明顯差別；人參皂苷Re的含量隨提取溶劑中水量的增加而略有上升；人參皂苷Rb₁、20(S)人參皂苷F1與人參皂苷Rb₂采用80％甲醇與60％甲醇提取時含量較高；人參皂苷Rd采用40％甲醇提取時含量最低，其余三種溶劑差別太大。綜合以上結(jié)果考慮，選用80％甲醇作為本實驗的提取溶劑(結(jié)果見表3)。

表3 不同提取溶劑六種成分的含量測定結(jié)果

3.3回流時間的選擇

取同一批樣品適量，回流提取時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h，按擬定色譜條件測定。結(jié)果表明回流時間在2.5h之內(nèi)時，隨著回流時間的增加，所測成分的含量明顯增加，而在2.5h之后，六種成分的含量測定結(jié)果沒有明顯區(qū)別，故選擇提取時間為2.5h。(結(jié)果見表4)

表4 不同提取時間六種成分的含量測定結(jié)果

通過實驗，提取方法確定為：取本品粉末(過四號篩)約0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置82℃水浴上回流提取2.5小時，取出，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

對照品和供試品色譜圖見圖1。由圖1可見，人參皂苷類各成分峰形對稱，分離良好，樣品中也沒有相應(yīng)干擾峰存在，專屬性較好。

4.方法學(xué)考察

4.1線性考察

分別精密吸取不同濃度的人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁、20(S)-人參皂苷F1、人參皂苷Rb₂、人參皂苷Rd對照品溶液，分別注入超高效液相色譜儀，按2.3項下的色譜條件測定，以對照品進樣量(μg)為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標，繪制標準曲線。人參皂苷Rg₁在0.01922μg～1.922μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝895293x+461(r＝0.9999)；人參皂苷Re在0.09687μg～9.687μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝775587x+18759(r＝0.9999)；人參皂苷Rb₁在0.01162μg～1.162μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝644122x+2088(r＝0.9999)；20(S)-人參皂苷F1在0.01230μg～1.230μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝1044583x+5271(r＝0.9999)；人參皂苷Rb₂在0.01164μg～1.164μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝681704x+1356(r＝0.9999)；人參皂苷Rd在0.03802μg～3.802μg之間呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y＝760002x+2946(r＝0.9999)。(實驗結(jié)果見表5、表6)。

表5 線性關(guān)系考察結(jié)果(1)

表6 線性關(guān)系考察結(jié)果(2)

4.2重復(fù)性試驗

取同一人參葉樣品(2號)適量，粉碎，過四號篩，混勻，共稱取9份，編號為1～9，其中1～3號0.2g，4～6號0.4g，7～9號0.6g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，依法制成供試品溶液，測定含量。結(jié)果見表7，表明重復(fù)性良好。

表7 重復(fù)性試驗結(jié)果(未折水分)

4.3加樣回收率試驗

取同一批人參葉樣品(2號)適量，粉碎，過四號篩，混勻，取粉末9份，每份約0.2g精密稱定，每三份為一組，分別加入用80％甲醇溶液配制的低、中、高三個濃度的對照品溶液25ml，按供試品溶液制備項下方法制備供試品溶液。按擬定的色譜條件測定，計算回收率。結(jié)果見表8～13。表明本方法回收率較好。

表8 人參皂苷Rg₁回收率試驗結(jié)果

表9 人參皂苷Re回收率試驗結(jié)果

表10 人參皂苷Rb₁回收率試驗結(jié)果

表11 20(S)-人參皂苷F₁回收率試驗結(jié)果

表12 人參皂苷Rb₂回收率試驗結(jié)果

表13 人參皂苷Rd回收率試驗結(jié)果

結(jié)論：經(jīng)試驗，人參皂苷Rg₁、人參皂苷Re、人參皂苷Rb₁、20(S)-人參皂苷F1、人參皂苷Rb₂、人參皂苷Rd的加樣回收率分別為99.3％、101.8％、98.3％、99.95％、101.0％、101.4％，RSD分別為1.5％、1.0％、1.8％、0.9％、1.5％、1.1％，表明各成分加樣回收率良好。

4.4穩(wěn)定性試驗

依次在0、2、6、10、16、24h精密吸取同一供試品溶液注入超高效液相色譜儀，測定，結(jié)果見表13，表明供試品溶液至少在24小時內(nèi)穩(wěn)定。

表13 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

4.5樣品測定

取收集到的人參葉共10批，測定，計算含量，結(jié)果見表14。

表14 人參葉樣品含量測定結(jié)果

附圖說明

圖1人參葉中六種人參皂苷類成分含量測定色譜圖(峰1：人參皂苷Rg₁；峰2：人參皂苷Re；峰3：人參皂苷Rb₁峰；4：人參皂苷F₁；峰5：人參皂苷Rb₂；峰6：人參皂苷Rd)；

具體實施方式

實施例1

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的微經(jīng)柱；以乙腈為流動相A，水為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動相A由18％漸變至20％；9～13 分鐘，流動相A由20％漸變至28％；13～28分鐘，流動相A為28％漸變至35％；檢測波長為203nm；流速0.4ml/min；

混合對照品溶液的制備

稱取人參皂苷Rg₁對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb₁對照品、人參皂苷Rb₂對照品、20(S)-人參皂苷F1對照品、人參皂苷Rd對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg1 100μg、人參皂苷Re500μg、人參皂苷Rb₁50μg、人參皂苷Rb₂80μg、20(S)-人參皂苷F1 50μg、人參皂苷Rd200μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備取人參葉粉末，過四號篩，約0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置75℃水浴上回流提取2.5小時，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算含量，即得。

實施例2

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的微經(jīng)柱；以乙腈為流動相A，水為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動相A由18％漸變至20％；9～13分鐘，流動相A由20％漸變至28％；13～28分鐘，流動相A為28％漸變至35％；檢測波長為203nm；流速0.4ml/min；

混合對照品溶液的制備

稱取人參皂苷Rg₁對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb₁對照品、人參皂苷Rb₂對照品、20(S)-人參皂苷F1對照品、人參皂苷Rd對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg₁100μg、人參皂苷Re500μg、人參皂苷Rb₁50μg、人參皂苷Rb₂80μg、20(S)-人參皂苷F1 50μg、人參皂苷Rd200μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備取人參葉粉末，過四號篩，約0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入60％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置82℃水浴上回流提取3小時，放冷，再稱定重量，用60％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各1μl，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算含量，即得。

實施例3

色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗色譜柱采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的微經(jīng)柱；以乙腈為流動相A，水為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫梯度為：0～9分鐘，流動相A由18％漸變至20％；9～13分鐘，流動相A由20％漸變至28％；13～28分鐘，流動相A為28％漸變至35％；檢測波長為203nm；流速0.4ml/min；

混合對照品溶液的制備

稱取人參皂苷Rg₁對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rb₁對照品、人參皂苷Rb₂對照品、20(S)-人參皂苷F1對照品、人參皂苷Rd對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1ml含人參皂苷Rg₁100μg、人參皂苷Re500μg、人參皂苷Rb₁50μg、人參皂苷Rb₂80μg、20(S)-人參皂苷F1 50μg、人參皂苷Rd200μg的混合溶液，即得；

供試品溶液的制備取人參葉粉末，過四號篩，約0.4g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80％甲醇25ml，密塞，稱定重量，置75℃水浴上回流提取3小時，放冷，再稱定重量，用80％甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得；

測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各2μl，注入液相色譜儀，測定，以外標法計算含量，即得。

上述實施例均按照藥典進行方法學(xué)驗證，結(jié)果顯示方法準確可靠、靈敏、專屬，各項指標均符合質(zhì)量控制的要求。