本發(fā)明涉及一種高效液相色譜(HPLC)檢測方法，特別涉及一種高效液相色譜聯(lián)合質(zhì)譜-質(zhì)譜同時檢測飼料中多種維生素的方法，包括脂溶性維生素和水溶性維生素的同時檢測。

背景技術(shù)：

由于水溶性維生素和脂溶性維生素溶解性差異大，其同時測定的方法報道較少。

Semahat Kucukkolbasi等報道了同時測定復(fù)合維生素藥片中水溶性維生素和脂溶性維生素含量的方法。該方法采用三氟乙酸-甲醇(TFA-MeOH)體系提取復(fù)合維生素藥片中的維生素，TFA-MeOH體系為流動相梯度洗脫，在Phenomenex Gemini C18柱中分離維生素，采用二極管陣列檢測器(DAD)在不同波長處檢測維生素B₁、B₃、B₉、B₁₂、V_C、p-氨基苯甲酸(PABA)、A、D₃和K，熒光檢測器(FLD)在不同波長處檢測維生素E和B₂。該方法在40分鐘內(nèi)同時檢測了11種維生素，適用于復(fù)合維生素藥片中維生素的檢測。但是，其對于維生素含量低的飼料樣品的測定有待進一步研究。

盧燕等采用雙三元高效液相色譜多閥多柱技術(shù)，同時分析了樣品中21種維生素。該方法采用水提取樣品中水溶性維生素，甲醇-二氯甲烷體系提取樣品中脂溶性維生素。水溶性維生素進入Acclaim PA色譜柱，用磷酸緩沖液、乙腈-磷酸緩沖液、甲醇-甲基丁基醚為流動相梯度洗脫；脂溶性維生素進入Acclaim C18色譜柱，用甲醇-乙腈、甲基丁基醚為流動相梯度洗脫。VWD 3400RS紫外檢測器在不同波長處檢測維生素。實際樣品分析結(jié)果顯示，該方法適用于富含維生素的維生素補充藥品等的檢測，但是，在飲料中，由于其溶解性的限制，只檢測到幾種水溶性維生素，同理，雞飼料樣品中也有部分低含量維生素未檢出。

配合飼料中原料組成復(fù)雜，維生素來源較多，含量較低，用以上兩種方法可能無法檢出。亟待開發(fā)一種新的方法，用以同時檢測飼料等低維生素含量樣品中的水溶性維生素和脂溶性維生素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中對于配合飼料中成分復(fù)雜，維生素來源較多，含量較低，無法在一次檢測中實現(xiàn)同時完全檢測的不足，提供一種同時檢測飼料中的脂溶性維生素和水溶性維生素的方法。本發(fā)明方法能夠在一次檢測的過程中完成配合飼料中多種維生素的檢測分析，具有監(jiān)測分析效率高的特點，能夠極大的簡化對于配合飼料的多重檢測分析。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了以下技術(shù)方案：

一種同時檢測飼料中的脂溶性維生素和水溶性維生素的方法，包括以下步驟：

(1)根據(jù)檢測需要，制備多種維生素標(biāo)準溶液，(制備的維生素標(biāo)準溶液)包括以下維生素中的至少兩種以上：VB₁、VB₃、VB₆、VB₂、VB₇、VB₁₂、維生素A醋酸酯、維生素D₃、維生素E乙酸酯(的標(biāo)準溶液)。特別是水溶性維生素和脂溶性維生素各自至少一種的情況。優(yōu)選的，具體而言是，水溶性維生素：VB₁、VB₃、VB₆、VB₂、VB₇、VB₁₂中至少一種，和脂溶性維生素：維生素A醋酸酯、維生素D₃、維生素E乙酸酯中至少一種。即上述的水溶性維生素中至少一種的標(biāo)準溶液，以及上述脂溶性維生素中至少一種的標(biāo)準溶液。根據(jù)實際的檢測目的調(diào)整相應(yīng)的標(biāo)準溶液的配制情況，配制出同時含有水溶性維生素和脂溶性維生素標(biāo)準溶液，也可以是多個不同的維生素的標(biāo)準溶液。

采用HPLC-MS/MS檢測標(biāo)準溶液，得到標(biāo)準曲線方程。

檢測過程中的采用梯度洗脫。流動相包括流動相A：甲醇水溶液相，和流動相B：甲酸水溶液相。

其中流動相A：甲醇水溶液中甲醇的體積比例大于95v％；流動相B：甲酸水溶液中甲酸的含量低于1wt％。

(2)稱取樣品，優(yōu)選稱取5-10g樣品，置于容量瓶中，優(yōu)選使用100毫升棕色容量瓶，加入提取溶液超聲提取10-30min，優(yōu)選為15-25min，最好是20min；冷卻定容，離心，用0.22μm有機相濾膜過濾上機，采用與步驟1相同的色譜參數(shù)(包括梯度洗脫程序)和質(zhì)譜檢測參數(shù)進行分析測試。

所述提取溶液是，由提取溶液第一組分和提取溶液第二組分按照25-35：65-75體積比例混合配制而成的溶液。

所述提取溶液第一組分是0.03-0.07v％氨水溶液(體積比)。

所述提取溶液第二組分是0.1-0.3％BHT甲醇溶液(m/vol，質(zhì)量體積百分比，g/L)。

(3)根據(jù)步驟1和步驟2的檢測結(jié)果計算得出樣品中的多種維生素的含量。

本發(fā)明的檢測方法設(shè)計了具有針對性的提取方案，將復(fù)雜的配合飼料成分中的多種來源的維生素成分充分提取，然后結(jié)合經(jīng)過調(diào)整優(yōu)化的梯度洗脫溶液組合，實現(xiàn)對于多種維生素的一次性連續(xù)檢測分析處理，使得配合飼料中的多種維生素成分快速連續(xù)檢測分析，能夠顯著的優(yōu)化現(xiàn)有的配合飼料中的多種維生素的檢測效率及準確率的問題，減少檢測分析耗時，提高檢測分析的效率，避免現(xiàn)有檢測分析工作繁瑣的問題。

進一步，所述提取溶液是：0.05v％氨水溶液：0.2(g/L)％BHT甲醇＝25-35：65-75體積比配制成的混合溶液。最優(yōu)選的，所述提取溶液是：0.05％氨水溶液：0.2％BHT甲醇＝30：70溶液。舉例如下，所述BHT甲醇溶液是將20mg的BHT溶解于100mL甲醇當(dāng)中得到的。

進一步，采用梯度洗脫過程中，流動相有兩種，分別是：流動相A：含0.01-0.03v％氨水的96-99v％甲醇水溶液，流動相B：0.01-0.03wt％甲酸水溶液。梯度洗脫的過程中，先用流動相B為主要溶液進行洗脫，然后逐漸過渡到流動相A為主要溶液進行洗脫，最后恢復(fù)到流動相B為主要洗脫溶液。

舉例如下：流動相A配制，先將甲醇和水按體積比96-99:1-4混合均勻得到96-99v％的甲醇水溶液，然后上述甲醇水溶液和氨水按體積比例混合配制成氨水體積占比為0.01-0.03v％的混合溶液，即為流動相A。

舉例如下：流動相B配制，稱取10-30mg的甲酸加入到99.97-99.99g的水中，充分搖勻，即為流動相B，其中甲酸重量百分比例為0.01-0.03wt％。

進一步，梯度洗脫程序為：流動相A：含0.02v％氨水的98v％甲醇水溶液，流動相B：0.02wt％甲酸水溶液，流速為0.3mL/min，運行25min，采用梯度洗脫程序，梯度條件：0～2min，流動相A0.5～0.5％；2～8.5min，流動相A0.5～56％；8.5～8.6min，流動相A56.0～99.5％；8.6～20min，流動相A99.5～99.5％；20～20.01min，流動相A99.5～0.5％。

進一步，檢測分析過程中，色譜柱選用以下之一：C18-MGⅡ(pH 2-10)3μm2.0mmI.D.×150mm柱、C18-MGⅢ(pH 2-10)3μm 2.0mmI.D.×150mm柱、ADME 3μm 2.1mmI.D.×150mm柱(pH 2-10)(也稱Capcell PAK ADME 2.1mm I.D×150mm，3μm)、AQ 5μm 2.1mm I.D.×150mm柱、Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1×50mm柱、Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 3.0×50mm柱和Waters ACQUITY UPLC BEH 1.7μm 2.1×50mm柱。優(yōu)選色譜柱為：Capcell PAK ADME 2.1mm I.D×150mm，3μm，即ADME 3μm 2.1mmI.D.×150mm柱(pH 2-10)，使用pH范圍2-10。

進一步，質(zhì)譜儀工作參數(shù)優(yōu)選如下：ESI正離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)參數(shù)：干燥氣溫度325℃，干燥氣流速11L/min，霧化氣壓力45psi，鞘氣溫度300℃，流速9L/min，毛細管電壓4000V，噴嘴電壓500V。

進一步，質(zhì)譜儀檢測分析過程中，MRM監(jiān)測模式下多種維生素的檢測參數(shù)條件如表2所示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

1.本發(fā)明的同時檢測飼料中的多種脂溶性維生素和水溶性維生素的方法，根據(jù)飼料樣品中復(fù)雜的維生素來源情況，以及多種維生素的性質(zhì)特點，設(shè)計了相應(yīng)的提取方案以及色譜、質(zhì)譜參數(shù)，使得HPLC-MS/MS能夠在一次檢測分析過程中完成多種不同的維生素的檢測分析。

2.本發(fā)明的檢測方法中，特別優(yōu)化設(shè)計了現(xiàn)有的飼料原料的維生素提取方案，利用不同的提取方案使得飼料中的來源復(fù)雜的多種維生素成分能夠全部充分提取，進而在HPLC-MS/MS儀器上進行檢測分析的結(jié)果準確可靠。

3.本發(fā)明的檢測方法中，設(shè)計的流動相和梯度洗脫程序根據(jù)檢測分析的多種脂溶性和水溶性維生素的特點，實現(xiàn)高效分離，為后續(xù)的質(zhì)譜儀檢測分析定性、定量工作提供了可靠的基礎(chǔ)條件。

附圖說明：

圖1是肉雞料中9種維生素的MRM圖譜

圖2是采用0.02mol/L乙酸銨(pH＝4.0)：0.2％(g/L)BHT+0.05v％氨水甲醇溶液＝50：50作為流動相得到的色譜圖。

圖3是采用0.05v％氨水溶液：0.2％(m/vol)BHT甲醇＝30：70溶液作為流動相得到的色譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合試驗例及具體實施方式對本發(fā)明作進一步的詳細描述。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發(fā)明內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

1 儀器、試劑和樣品原料準備

(1)Agilent 1260-6460液相色譜—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀配電噴霧離子源ESI(美國安捷倫公司)。

(2)AB-135型電子分析天平(梅特勒托利多上海有限公司)。

(3)LD5-2B離心機(北京京立離心機有限公司)。

(4)KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

(5)旋渦混勻器MS3(德國IKA)。

(6)乙睛、甲醇(色譜純，默克公司。

(7)甲酸、乙酸銨、氨水(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)。

(8)氫氧化鈉、氯化鈉(分析純，上海國藥集團)。

(9)硫胺素(C₁₂H₁₇CLN₄OS.HCL，分子量：337.3)(含量99.5％.Sigma公司)。

(10)核黃素(C₁₇H₂₀N₄O₆，分子量：376)(含量99.5％.Sigma公司)。

(11)煙酸(C₆H₅NO₂，分子量：123)(含量99.5％.Sigma公司)。

(12)吡哆醇(C₈H₁₁NO₃.HCL，分子量：205.6)(含量99.5％.Sigma公司)。

(13)生物素(C₁₀H₁₆N₂O₃S，分子量：244.23)(含量99.5％.Sigma公司)。

(14)鈷胺素(C₆₃H₈₈CoN₁₄O₁₄P，分子量：1355.37)(含量99.5％.Sigma公司)。

(15)維生素A醋酸酯(C₂₂H₃₂O₂，分子量：328.5)。

(16)維生素E乙酸酯(C₃₁H₅₂O₃，分子量：472.74)。

(17)維生素D₃(C₂₇H₄₄O，分子量：384.63)。

魚料、肉雞料、仔豬料、蛋雞料、乳豬料和種豬料樣品由四川新希望畜牧科技有限公司提供。

2 提取溶液和九種混合維生素標(biāo)準溶液的配制

2.1 提取溶液的配制

提取溶液：0.05％氨水溶液：0.2％(m/vol)BHT甲醇＝30：70體積比混合得到提取溶液

2.2 九種混合維生素標(biāo)準溶液的配制

水溶性維生素混合標(biāo)準物質(zhì)儲備溶液：準確稱取5mg的VB₁、VB₃、VB₆；50mg VB₂、VB₇、VB₁₂標(biāo)準品于500mL棕色容量瓶中，用0.01mol乙酸銨(pH＝4.0)配制質(zhì)量濃度為10.0mg/L的混合標(biāo)準物質(zhì)儲備溶液(以VB₁計)。

脂溶性維生素標(biāo)準物質(zhì)儲備溶液和工作中間液：準確稱取100mg的維生素A醋酸酯、維生素E乙酸酯、維生素D₃標(biāo)準品，用甲醇(加入0.2％2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT))配制成質(zhì)量濃度為1000.0mg/L的標(biāo)準物質(zhì)儲備溶液。分別吸取1mL各標(biāo)準物質(zhì)工作中間液，用上述2.1中制備的提取溶液，配成濃度以維生素A醋酸酯、維生素D₃濃度為1mg/L、維生素E乙酸酯濃度為20μg/L的混合標(biāo)準物質(zhì)工作液。

混合維生素標(biāo)準物質(zhì)工作中間液：準確移取1mL水溶性維生素混合標(biāo)準物質(zhì)儲備溶液、1mL維生素A醋酸酯、維生素E乙酸酯、維生素D₃標(biāo)準物質(zhì)工作中間液，于100mL棕色容量瓶中，用0.2％BHT的70％甲醇水溶液定容，配制成濃度為：水溶性維生素濃度100μg/L(以VB1計)、脂溶性維生素20μg/L(以VE計)的混合維生素標(biāo)準工作液。

混合標(biāo)準工作系列：取混合標(biāo)準物質(zhì)工作液2、4、10、20mL分別置于100mL棕色容量瓶中，稀釋成以VE(維生素E乙酸酯)計，濃度為0.4、0.8、2、4、20μg/L的標(biāo)準系列。

3 樣品處理

稱取5-10g樣品到100毫升棕色容量瓶中，加入提取溶液(上述2.1中制備的提取溶液)超聲提取20min，冷卻定容，離心，用0.22μm有機相濾膜，過濾上機。

4 色譜與質(zhì)譜條件

4.1 色譜條件

色譜柱：Capcell PAK ADME(2.1mmI.D×150mm，3μm)；流動相A：含0.02％氨水的98％甲醇水溶液，流動相B：0.02％甲酸水溶液，流速為0.3mL/min，運行25min，采用梯度洗脫程序，梯度條件為如表1所示。

表1 流動相洗脫梯度

4.2 質(zhì)譜條件

ESI正離子掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)參數(shù)：干燥氣溫度325℃，干燥氣流速11L/min，霧化氣壓力45psi，鞘氣溫度300℃，流速9L/min，毛細管電壓4000V，噴嘴電壓500V，其他質(zhì)譜優(yōu)化條件如表2所示。

表2 MRM監(jiān)測模式下9種維生素的儀器優(yōu)化條件

5 結(jié)果與討論

5.1 不同提取溶劑對9種混合維生素檢測結(jié)果的影響

為了能有簡便、快捷的方法分析樣品，比較了以下兩種復(fù)合溶液作為提取劑方案：

方案一：0.02mol/L乙酸銨(pH＝4.0)：0.2％(m/vol)BHT+0.05v％氨水甲醇溶液＝50：50。

方案二：0.02mol/L乙酸銨(pH＝4.0)：0.2％(m/vol)BHT+0.05％氨水甲醇溶液＝30：70。

結(jié)果分別如圖2和圖3所示，其中圖2是采用0.02mol/L乙酸銨(pH＝4.0)：0.2％(g/L)BHT+0.05％氨水甲醇溶液＝50：50作為流動相得到的色譜圖(方案一)。圖3是采用0.05％氨水溶液：0.2％(m/vol)BHT甲醇＝30：70溶液作為流動相得到的色譜圖(方案二)。

可以看出，兩種情況下脂溶性維生素能得到較好的分離。但是，當(dāng)提取溶液的pH或鹽分，離子含有乙酸銨的比例大的時候，對于維生素的HPLC分離過程中的維生素的峰形有較大的不利影響。由于方案一中鹽份比例較大，水溶性維生素出現(xiàn)了胖頭峰，得到的峰型不好。特別是當(dāng)存在鹽分時會導(dǎo)致峰型變寬、分離度較差等問題；當(dāng)pH<7的時候，會造成脂溶性維生素A峰型不好。

故采用了0.05％氨水溶液：0.2％(m/vol)BHT甲醇＝30：70左右比例的流動相對樣品進行處理，這樣既能滿足水溶性維生素的分離，也能滿足脂溶性維生素的分離。特別是，優(yōu)選使用0.05％氨水溶液：0.2％(m/vol)BHT甲醇＝30：70溶液作為樣品提取液，各檢測組分響應(yīng)值達到最優(yōu)。

5.2 不同色譜柱對9種混合維生素檢測結(jié)果的影響

分別用嘗試了使用以下7中不同的色譜柱進行同樣的分析測試工作：

C18-MGⅡ(pH 2-10)3μm 2.0mmI.D.×150mm柱、

C18-MGⅢ(pH 2-10)3μm 2.0mmI.D.×150mm柱、

ADME(pH 2-10)3μm 2.1mmI.D.×150mm柱、

AQ 5μm 2.1mm I.D.×150mm柱、

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18 2.1×50mm柱、

Waters ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 3.0×50mm柱

和Waters ACQUITY UPLC BEH 1.7μm 2.1×50mm柱。

對測試結(jié)果進行比較分析，發(fā)現(xiàn)不同的色譜柱的分離效果存在一定的差異。其中以AQ 5μm 2.1mmI.D.×150mm柱對6種水溶性維生素和3種脂溶性維生素的分離和保留時間控制最佳。所以，本發(fā)明的方案優(yōu)選使用AQ 5μm 2.1mm I.D.×150mm柱進行色譜分析。

5.3 不同流動相及洗脫梯度對9種混合維生素檢測結(jié)果的影響

由于水溶性維生素在酸性條件下比較穩(wěn)定，而脂溶性維生素A在酸性條件下沒有活性，故采用流動相A：含0.02v％氨水的98v％甲醇水溶液，流動相B：0.02wt％甲酸水溶液，進行梯度洗脫，這樣既能滿足水溶性維生素的分離，也能滿足脂溶性維生素的分離。

5.4 不同質(zhì)譜條件對9種混合維生素檢測結(jié)果的影響

試驗采用一定濃度的用0.05％氨水溶液：0.2％(m/vol，g/L)BHT甲醇＝30：70溶液配制好的單一的維生素標(biāo)準工作液在正離子模式下分別對其進行母離子MS2 SCAN，不難發(fā)現(xiàn)各目標(biāo)物的[M+H]+分子離子峰強度都高，離子源的溫度在260℃-350℃均無明顯變化，故選儀器設(shè)定溫度325℃作為離子源溫度，然后做MS2 SIM優(yōu)化Fragmentor，然后做Product lon，并優(yōu)化Collision Energy，得出具有特征的定性離子和定量離子。然后繼續(xù)對質(zhì)譜參數(shù)：流速，霧化氣壓力，鞘氣溫度，鞘氣流速，毛細管電壓，噴嘴電壓等進行優(yōu)化。

5.5 線性范圍、定量限、加標(biāo)回收率及相對標(biāo)準偏差

(1)線性范圍

配制與待測樣品相同基質(zhì)的混合標(biāo)準系列工作液，使其濃度為分別0.4、0.8、2、4、20μg/L以維生素E乙酸酯計)，以選定的定量離子峰面積對質(zhì)量濃度做標(biāo)準曲線，6種水溶性維生素和3種脂溶性維生素的線性方程及相關(guān)系數(shù)如表3所示。結(jié)果顯示，在6種水溶性維生素和3種脂溶性維生素在0.4～20μg/L(以維生素E乙酸酯計)范圍內(nèi)的線性相關(guān)系數(shù)(R²)為0.9982～0.9999，表明線性相關(guān)性良好。

表3 九種維生素標(biāo)準曲線及相關(guān)系數(shù)

(2)檢出限和定量限

采用空白提取液中添加目標(biāo)化合物的方法按上述步驟“3樣品處理”，進行處理后上機分析，以維生素E乙酸酯計，濃度為0.4μg/L得出的SNR。以3倍信噪比確定檢出限，以10倍信噪比確定定量下限，通過計算得出6種水溶性維生素何苦3種脂溶性維生素的檢出限和定量限如表4所示。

(3)加標(biāo)回收率

在溶劑空白中分別加入不同濃度的目標(biāo)維生素標(biāo)準品，按照步驟“3樣品處理”，對樣品進行處理，上機檢測其濃度，計算加標(biāo)回收率，加標(biāo)量、回收率及相對偏差如表4所示(n＝6)。

表4 加標(biāo)回收率、相對偏差、檢出限及定量限(μg/kg)

6 實際樣品的測定

應(yīng)用上述方法對魚料、肉雞料、仔豬料、蛋雞料、乳豬料和種豬料樣品進行檢測，幾種飼料樣品中均能檢測出VB₁、VB₂、VB₃、VB₆、VB₇、VB₁₂，其中VB₁的含量為3731～8939μg/kg，VB₂含量為8860～14880μg/kg，VB₃的含量為6744～14720μg/kg，VB₆的含量為2293～7136μg/kg，VB₇含量為356～457μg/kg，VB₁₂含量為339～485μg/kg，維生素D₃的含量為3731～18939μg/kg，維生素E乙酸酯含量為18576～38674μg/kg，維生素A醋酸酯的含量為12579～105648μg/kg。證明該方法切實可行。本方法能夠滿足配合飼料同時檢測9種維生素的需求。

表5 本發(fā)明方法檢測多種不同的樣品的結(jié)果

7 小結(jié)

本試驗建立了HPLC-MSMS同時檢測魚料、肉雞料、仔豬料、蛋雞料、乳豬料和種豬料等配合飼料中3種脂溶性維生素和6種水溶性維生素，共9種維生素的分析方法，且用該方法檢測9種維生素的加標(biāo)回收率為82.7％～102.6％，相對標(biāo)準偏差(n＝6)為3.9％～9.1％，各脂溶性維生素的檢出限為0.11～30.00μg/kg，定量下限為0.38～99.80μg/kg。該方法快捷、操作簡單、節(jié)能環(huán)保、結(jié)果準確，符合相關(guān)法律法規(guī)的要求，滿足日常檢測需要。

備注：

本文各種維生素含量均以質(zhì)量分數(shù)計，如需轉(zhuǎn)換為國際單位(IU)，轉(zhuǎn)換系數(shù)如下：

1國際單位VA(IU)＝0.344μg維生素A乙酸酯；

1國際單位VE(IU)＝1mg維生素E乙酸酯；

1國際單位VD₃(IU)＝0.025μg但膽鈣化醇。

BHT：2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚，butylated hydroxytoluene，俗稱，抗氧劑264。