本發(fā)明屬于斜生柵藻的技術(shù)領(lǐng)域，涉及用指示藻測(cè)定敵草凈生物毒性，具體涉及銨鹽環(huán)境下利用斜生柵藻熒光檢測(cè)敵草凈生物毒性的方法。本發(fā)明方法快速靈敏。

背景技術(shù)：

敵草凈英文名稱DesMetry，分子式C₈H₁₅N₅S，影響雜草光合作用，破壞細(xì)胞膜，除草效果為葉子的尖部、邊緣及葉脈間變黃變枯，最終達(dá)到除草目的。

敵草凈較好適用于棉花、大豆、麥類、花生、向日葵、馬鈴薯、果樹(shù)、蔬菜、茶樹(shù)及水稻田防除稗草、馬唐、千金子、野莧菜、蓼、藜、馬齒莧、看麥娘、繁縷、車前草等1年生禾本科及闊葉草。我國(guó)生產(chǎn)和使用敵草凈的歷史較短，但已有較大的污染事故發(fā)生，應(yīng)引起足夠的重視。敵草凈在土壤中不易降解，土壤中殘留的敵草凈還具有淋溶性，易被雨水、灌溉水淋溶至較深土層，或是隨地表徑流進(jìn)入河流、湖泊，對(duì)地下水和地表水造成污染。

敵草凈造成的水污染情況日益嚴(yán)重，對(duì)敵草凈的檢測(cè)手段主要集中在HPLC高效液相色譜法和氣相色譜法，但這兩種方法只能測(cè)定敵草凈的含量，用濃度表示出來(lái)，不能直觀反應(yīng)其在生物體上的毒性表現(xiàn)?，F(xiàn)在生物監(jiān)測(cè)方法越來(lái)越受到重視，因?yàn)槠淠苤苯臃磻?yīng)污染物對(duì)生物體生理特征的影響變化，直接反應(yīng)污染物的毒性。目前發(fā)光細(xì)菌法是比較成熟的生物毒性檢測(cè)方法，敵草凈對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性作用通過(guò)發(fā)光細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度的變化來(lái)反應(yīng)，從而確定敵草凈毒性，但是發(fā)光細(xì)菌法也存在發(fā)光細(xì)菌不穩(wěn)定和方法成本高等問(wèn)題，因此開(kāi)發(fā)一種穩(wěn)定的、低成本的測(cè)定敵草凈生物毒性的方法是迫切需要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種銨鹽環(huán)境下利用斜生柵藻熒光檢測(cè)敵草凈生物毒性的方法，可以全面了解敵草凈的毒性效應(yīng)，而且能更深入的了解污染物的毒理作用機(jī)制與途徑，更能體現(xiàn)實(shí)際環(huán)境中敵草凈暴露的現(xiàn)象和信息，可利用葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)檢測(cè)敵草凈的生物毒性。

本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)其目的采用的技術(shù)方案是：

銨鹽環(huán)境下利用斜生柵藻熒光檢測(cè)敵草凈生物毒性的方法，包括斜生柵藻藻種的培養(yǎng)、斜生柵藻藻液的制備，還包括銨鹽環(huán)境下敵草凈對(duì)斜生柵藻熒光效應(yīng)的影響測(cè)定：取系列濃度并填加有銨鹽溶液的敵草凈標(biāo)準(zhǔn)液加入到斜生柵藻藻液中，充分混合并搖勻，控制銨鹽溶液、敵草凈標(biāo)準(zhǔn)溶液和斜生柵藻藻液的體積比為2：(1-2)：(1-2)，同時(shí)設(shè)置蒸餾水代替敵草凈標(biāo)準(zhǔn)溶液的空白對(duì)照組，經(jīng)暗置10-15min后，用水樣熒光檢測(cè)儀測(cè)定斜生柵藻的各葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)，測(cè)定敵草凈的生物毒性。

斜生柵藻藻種的培養(yǎng)包括，選取斜生柵藻藻種，于無(wú)菌條件下將藻種接種至裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，接種完成，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，備用。

斜生柵藻藻液的制備包括，將在斜生柵藻藻種的培養(yǎng)過(guò)程中得到的對(duì)數(shù)期的斜生柵藻，通過(guò)顯微鏡鏡檢得出藻細(xì)胞密度，選擇細(xì)胞密度范圍在(1-2)×10⁶ind/·ml^-1的對(duì)數(shù)期斜生柵藻藻液，用于敵草凈生物毒性的測(cè)定。

所述的銨鹽溶液的濃度為0.1-0.2mol/L。

所述銨鹽選自硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、磷酸銨鹽中的一種或兩種以上組合。

恒溫光照培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件是：光照度為2000lx，溫度為25±2℃，濕度為75％RH，光暗周期為12h：12h，靜置培養(yǎng)，每日搖瓶2-3次，同時(shí)更換錐形瓶的位置。

所述液體培養(yǎng)基包括以下組分，300mL液體培養(yǎng)基中，KNO₃ 10-20mg，(NH₄)₂SO₄ 3-5mg，NH₄HCO₃ 3-5mg,MgSO₄·7H₂O 3-8mg，CaCl₂·2H₂O 1-5mg，Na₂CO₃ 1-2mg，F(xiàn)eCl₃·6H₂O 0.1-0.2mg，A₅液0.1-0.2mL,延胡索酸5-7mg，酒石酸鈉5-7mg，六偏磷酸鈉0.1-0.2mg，海藻酸鈉0.2-0.5mg，己內(nèi)酰胺0.1-0.5mg，余量為水。

接種時(shí)，控制斜生柵藻藻種與液體培養(yǎng)基的體積比為1：(5-6)。

系列濃度的敵草凈標(biāo)準(zhǔn)液的濃度依次為：10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明通過(guò)葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)方法可以快速、靈敏地研究各種逆境對(duì)斜生柵藻光合生理的影響，通過(guò)各種熒光參數(shù)的分析，可以得到光合作用的多種信息。本發(fā)明應(yīng)運(yùn)用于敵草凈的快速檢測(cè)，在添加銨鹽的情況下，應(yīng)用于可短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出水體中殘留的痕量敵草凈。本發(fā)明加銨鹽的作用是1.提升檢測(cè)靈敏度，更全面、直觀的了解敵草凈的生物毒性；2.可以用于證明銨鹽能促進(jìn)敵草凈對(duì)斜生柵藻的作用效果。

本發(fā)明斜生柵藻的培養(yǎng)為后續(xù)用于測(cè)定敵草凈生物毒性起到關(guān)鍵作用，斜生柵藻的培養(yǎng)直接影響藻液的懸浮穩(wěn)定性，而藻液的懸浮穩(wěn)定性影響敵草凈生物毒性的檢測(cè)，現(xiàn)有的斜生柵藻的培養(yǎng)基多采用BG-11液體培養(yǎng)基，其存在藻體沉降、懸浮于液體中的斜生柵藻分布不均的問(wèn)題，嚴(yán)重影響敵草凈生物毒性的測(cè)定，本發(fā)明液體培養(yǎng)基采用延胡索酸和碳酸鈉作為碳源，由于延胡索酸有很強(qiáng)的氧化能力，在酒石酸鈉存在條件下，可以對(duì)液體培養(yǎng)基的pH值起到緩沖和調(diào)節(jié)的作用，硫酸銨和碳酸氫銨作為氮源，硫酸銨由于伴隨離子是SO₄^2-，隨著NH₄⁺的利用，液體培養(yǎng)基中的H⁺越來(lái)越多，會(huì)導(dǎo)致液體培養(yǎng)基的pH值降低，影響液體培養(yǎng)基的穩(wěn)定性，本發(fā)明通過(guò)加入碳酸氫銨解決了該問(wèn)題，具體是隨著HCO₃^2-和NH₄⁺的利用產(chǎn)生OH^-，從而調(diào)節(jié)pH值升高，因此通過(guò)硫酸銨和碳酸氫銨的相互配合，既可以提供氮源，同時(shí)可以緩沖和調(diào)節(jié)pH值，穩(wěn)定液體pH值，pH值波動(dòng)小或無(wú)波動(dòng)提高了液體培養(yǎng)基的穩(wěn)定性。上述是通過(guò)對(duì)液體培養(yǎng)基穩(wěn)定性的控制，提高后續(xù)敵草凈生物毒性測(cè)定的效果，在液體培養(yǎng)基穩(wěn)定的條件下，斜生柵藻在液體培養(yǎng)基中的存在狀態(tài)，對(duì)后續(xù)敵草凈生物毒性的測(cè)定有著至關(guān)重要的作用，發(fā)明人為提高斜生柵藻在液體培養(yǎng)基中的懸浮穩(wěn)定性、降低斜生柵藻的沉降、提高斜生柵藻在液體培養(yǎng)基中的分散均勻度進(jìn)而進(jìn)一步提高后續(xù)敵草凈生物毒性測(cè)定的效果，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的創(chuàng)造性研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)向其中加入海藻酸鈉、六偏磷酸鈉、己內(nèi)酰胺，嚴(yán)格控制加入比例，結(jié)合酒石酸鈉的存在，使得斜生柵藻均一、穩(wěn)定的懸浮在液體培養(yǎng)基中，獲得的藻液懸浮穩(wěn)定、不分層、不下沉，在容器的上層、中間、底層及側(cè)壁處藻含量分散均勻，量取藻液時(shí)無(wú)需擔(dān)心有的地方含藻細(xì)胞多有的地方含藻細(xì)胞少而影響測(cè)定效果的問(wèn)題，量取更方便，效果更直觀。而采用其他液體培養(yǎng)基得到的藻液，如采用BG-11液體培養(yǎng)基等，藻液懸浮不穩(wěn)定，集中在容器的中間位置，上層和側(cè)壁處藻細(xì)胞含量與中間位置偏差大，在容器底部有大量的藻沉淀，測(cè)量效果體現(xiàn)不明顯，效果差。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例1敵草凈對(duì)斜生柵藻PSⅡ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Y(Ⅱ))影響曲線。

圖2是實(shí)施例1敵草凈對(duì)斜生柵藻非光化學(xué)淬滅(NPQ)影響曲線。

圖3是實(shí)施例1敵草凈對(duì)斜生柵藻光合電子傳遞效率(ETR)影響曲線。

圖4是實(shí)施例1敵草凈對(duì)斜生柵藻光化學(xué)淬滅(qP)影響曲線。

圖5是實(shí)施例1敵草凈對(duì)斜生柵藻PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)影響曲線。

圖6是實(shí)施例2敵草凈對(duì)斜生柵藻PSⅡ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Y(Ⅱ))影響曲線。

圖7是實(shí)施例2敵草凈對(duì)斜生柵藻非光化學(xué)淬滅(NPQ)影響曲線。

圖8是實(shí)施例2敵草凈對(duì)斜生柵藻光合電子傳遞效率(ETR)影響曲線。

圖9是實(shí)施例2敵草凈對(duì)斜生柵藻光化學(xué)淬滅(qP)影響曲線。

圖10是實(shí)施例2敵草凈對(duì)斜生柵藻PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)影響曲線。

圖11是實(shí)施例3敵草凈對(duì)斜生柵藻PSⅡ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Y(Ⅱ))影響曲線。

圖12是實(shí)施例3敵草凈對(duì)斜生柵藻非光化學(xué)淬滅(NPQ)影響曲線。

圖13是實(shí)施例3敵草凈對(duì)斜生柵藻光合電子傳遞效率(ETR)影響曲線。

圖14是實(shí)施例3敵草凈對(duì)斜生柵藻光化學(xué)淬滅(qP)影響曲線。

圖15是實(shí)施例3敵草凈對(duì)斜生柵藻PSⅡ的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)影響曲線。

具體實(shí)施方式

通過(guò)用斜生柵藻測(cè)定，發(fā)現(xiàn)敵草凈影響斜生柵藻的光合作用，通過(guò)其對(duì)斜生柵藻光合作用的影響，可直觀反應(yīng)其在生物體上的毒性表現(xiàn)，下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。

1、材料

藻種：本發(fā)明所用藻種斜生柵藻，藻種購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院野生生物質(zhì)庫(kù)——淡水藻種庫(kù)。

儀器：光照培養(yǎng)箱(E-30B0美國(guó)Percival)、Water-PAM水樣葉綠素?zé)晒鈨x(Walz，Germany)、熒光顯微鏡(德國(guó)蔡司)。

2、斜生柵藻的培養(yǎng)

斜生柵藻藻種的培養(yǎng)包括，選取斜生柵藻藻種，于無(wú)菌條件下將藻種接種至裝有液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，接種完成，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，備用，培養(yǎng)條件是：光照度為2000lx，溫度為25±2℃，濕度為75％RH，光暗周期為12h：12h，靜置培養(yǎng)，每日搖瓶2-3次，同時(shí)更換錐形瓶的位置，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，備用；

上述液體培養(yǎng)基為，300mL液體培養(yǎng)基中，含有KNO₃ 10-20mg，(NH₄)₂SO₄ 3-5mg，NH₄HCO₃ 3-5mg,MgSO₄·7H₂O 3-8mg，CaCl₂·2H₂O 1-5mg，Na₂CO₃ 1-2mg，F(xiàn)eCl₃·6H₂O 0.1-0.2mg，A₅液0.1-0.2mL,延胡索酸5-7mg，酒石酸鈉5-7mg，六偏磷酸鈉0.1-0.2mg，己內(nèi)酰胺0.1-0.5mg，海藻酸鈉0.2-0.5mg，余量為水；其中A₅液的配方見(jiàn)表1。

表1

3、斜生柵藻藻液的制備

斜生柵藻藻液的制備包括，將在上述2斜生柵藻藻種的培養(yǎng)過(guò)程中得到的對(duì)數(shù)期的斜生柵藻，通過(guò)顯微鏡鏡檢得出藻細(xì)胞密度，選擇細(xì)胞密度范圍在(1-2)×10⁶ind/·ml^-1的對(duì)數(shù)期斜生柵藻藻液，用于敵草凈生物毒性的測(cè)定。

4、敵草凈標(biāo)準(zhǔn)液的制備

10mg/L敵草凈儲(chǔ)備液：取10μl濃度為200g/L的敵草凈原液，加純水稀釋至200ml，得到敵草凈儲(chǔ)備液；

200μg/L敵草凈中間液：取2.0ml敵草凈儲(chǔ)備液于100ml容量瓶中,純水定容，得到敵草凈中間液；

敵草凈標(biāo)準(zhǔn)液：分別取2.5、5.0、7.5、10.0、12.5ml敵草凈中間液于5個(gè)50ml容量瓶中，純水定容，其敵草凈濃度分別是10μg/L、20μg/L、30μg/L、40μg/L、50μg/L。

實(shí)施例1

敵草凈對(duì)斜生柵藻熒光效應(yīng)影響的測(cè)定

在斜生柵藻生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(即培養(yǎng)5-6天)取斜生柵藻藻液、不同濃度的敵草凈標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水按體積比1：1：1進(jìn)行混合并搖勻，并同時(shí)設(shè)置空白組(蒸餾水代替敵草凈)對(duì)照?；旌弦航?jīng)暗置15min后，用水樣葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定斜生柵藻藻液葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)，包括光系統(tǒng)Ⅱ的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、光系統(tǒng)Ⅱ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Y(Ⅱ))、光合電子傳遞效率(ETR)、光化學(xué)淬滅(qP)和非光化學(xué)淬滅(NPQ)，進(jìn)行3組平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，取其平均值并記錄，得出空白組和實(shí)驗(yàn)組各熒光參數(shù)的變化，判斷敵草凈對(duì)斜生柵藻的各熒光參數(shù)的影響效果。

銨鹽環(huán)境下敵草凈對(duì)斜生柵藻熒光效應(yīng)影響的測(cè)定

選擇濃度為0.15mol/L的硫酸銨溶液，在斜生柵藻生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(即培養(yǎng)5-6天)取斜生柵藻藻液、不同濃度的敵草凈標(biāo)準(zhǔn)液和硫酸銨溶液按體積比1：1：1進(jìn)行混合并搖勻，并同時(shí)設(shè)置空白組(蒸餾水代替敵草凈)對(duì)照。混合液經(jīng)暗置15min后，用水樣葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定藻液葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)，同上，對(duì)比非銨鹽環(huán)境下和銨鹽環(huán)境下各熒光參數(shù)的變化差異，得出銨鹽環(huán)境下敵草凈對(duì)斜生柵藻的各熒光參數(shù)的影響效果。

實(shí)施例2

敵草凈對(duì)斜生柵藻熒光效應(yīng)影響的測(cè)定

在斜生柵藻生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(即培養(yǎng)5-6天)取斜生柵藻藻液、不同濃度的敵草凈標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水按體積比2：1：2進(jìn)行混合并搖勻，并同時(shí)設(shè)置空白組(蒸餾水代替敵草凈)對(duì)照?；旌弦航?jīng)暗置10min后，用水樣葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定斜生柵藻藻液葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)，包括光系統(tǒng)Ⅱ的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、光系統(tǒng)Ⅱ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Y(Ⅱ))、光合電子傳遞效率(ETR)、光化學(xué)淬滅(qP)和非光化學(xué)淬滅(NPQ)，進(jìn)行3組平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，取其平均值并記錄，得出空白組和實(shí)驗(yàn)組各熒光參數(shù)的變化，判斷敵草凈對(duì)斜生柵藻的各熒光參數(shù)的影響效果。

銨鹽環(huán)境下敵草凈對(duì)斜生柵藻熒光效應(yīng)影響的測(cè)定

選擇濃度為0.1mol/L的硝酸銨溶液，在斜生柵藻生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(即培養(yǎng)5-6天)取斜生柵藻藻液、不同濃度的敵草凈標(biāo)準(zhǔn)液和硝酸銨溶液按體積比2：1：2進(jìn)行混合并搖勻，并同時(shí)設(shè)置空白組(蒸餾水代替敵草凈)對(duì)照?；旌弦航?jīng)暗置10min后，用水樣葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定藻液葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)，同上，對(duì)比非銨鹽環(huán)境下和銨鹽環(huán)境下各熒光參數(shù)的變化差異，得出銨鹽環(huán)境下敵草凈對(duì)斜生柵藻的各熒光參數(shù)的影響效果。

實(shí)施例3

敵草凈對(duì)斜生柵藻熒光效應(yīng)影響的測(cè)定

在斜生柵藻生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(即培養(yǎng)5-6天)取斜生柵藻藻液、不同濃度的敵草凈標(biāo)準(zhǔn)液和蒸餾水按體積比1：1：2進(jìn)行混合并搖勻，并同時(shí)設(shè)置空白組(蒸餾水代替敵草凈)對(duì)照?；旌弦航?jīng)暗置12min后，用水樣葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定斜生柵藻藻液葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)，包括光系統(tǒng)Ⅱ的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、光系統(tǒng)Ⅱ的實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Y(Ⅱ))、光合電子傳遞效率(ETR)、光化學(xué)淬滅(qP)和非光化學(xué)淬滅(NPQ)，進(jìn)行3組平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，取其平均值并記錄，得出空白組和實(shí)驗(yàn)組各熒光參數(shù)的變化，判斷敵草凈對(duì)斜生柵藻的各熒光參數(shù)的影響效果。

銨鹽環(huán)境下敵草凈對(duì)斜生柵藻熒光效應(yīng)影響的測(cè)定

選擇濃度為0.2mol/L的銨鹽溶液，所述銨鹽為磷酸銨鹽和氯化銨的混合物，在斜生柵藻生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期(即培養(yǎng)5-6天)取斜生柵藻藻液、不同濃度的敵草凈標(biāo)準(zhǔn)液和銨鹽溶液按體積比1：1：2進(jìn)行混合并搖勻，并同時(shí)設(shè)置空白組(蒸餾水代替敵草凈)對(duì)照。混合液經(jīng)暗置12min后，用水樣葉綠素?zé)晒鈨x測(cè)定藻液葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)，同上，對(duì)比非銨鹽環(huán)境下和銨鹽環(huán)境下各熒光參數(shù)的變化差異，得出銨鹽環(huán)境下敵草凈對(duì)斜生柵藻的各熒光參數(shù)的影響效果。

7、結(jié)果

參見(jiàn)附圖1-15，在銨鹽溶液環(huán)境下敵草凈對(duì)斜生柵藻的熒光參數(shù)Y(II)、ETR、NPQ和qp有明顯的增強(qiáng)抑制效果，隨敵草凈濃度的升高，增強(qiáng)抑制效果越為明顯，50μg/L濃度的敵草凈抑制率經(jīng)對(duì)比，增強(qiáng)現(xiàn)象尤為顯著(參見(jiàn)附圖)，由此可見(jiàn)在銨鹽環(huán)境下隨敵草凈濃度的增加，對(duì)斜生柵藻熒光參數(shù)的增強(qiáng)抑制效果越為明顯，可更為直觀反應(yīng)出斜生柵藻在光合作用中光系統(tǒng)II的實(shí)際光能轉(zhuǎn)換效率、實(shí)際量子產(chǎn)量、相對(duì)線性電子流速率、光合活性和光保護(hù)能力明顯受到影響。

經(jīng)過(guò)分析研究發(fā)現(xiàn)，測(cè)定時(shí)加入的銨鹽可進(jìn)入藻細(xì)胞內(nèi)部參與新陳代謝活動(dòng)，從而影響其光合作用中的光系統(tǒng)II的生理反應(yīng)，所以銨鹽環(huán)境下斜生柵藻的熒光參數(shù)相比非銨鹽環(huán)境下的變化更為顯著，銨鹽可顯著提高敵草凈對(duì)斜生柵藻的影響效果，使得測(cè)定效果更為直觀、更為全面、更為快速，使得敵草凈的生物毒性一目了然。