本發(fā)明涉及檢測(cè)領(lǐng)域，特別是指一種通過(guò)水蒸餾提取煙葉中揮發(fā)性致香物構(gòu)建煙葉指紋圖譜的方法，本發(fā)明還涉及所述方法在煙葉揮發(fā)性致香物分析中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙草在我國(guó)種植歷史悠久，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一。煙葉質(zhì)量是反映和體現(xiàn)煙葉必要性狀均衡情況的綜合性概念,它包括外觀質(zhì)量和內(nèi)在質(zhì)量。長(zhǎng)期以來(lái)，煙葉品質(zhì)主要由四個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)和分類,即外觀質(zhì)量、感官評(píng)吸、化學(xué)分析、物理特性，從某個(gè)角度看，仍不能全面地滿足要求。如化學(xué)分析只有8、9個(gè)指標(biāo)，強(qiáng)調(diào)共性；外觀評(píng)價(jià)和感官評(píng)吸受主觀因素的影響較大。為此，國(guó)內(nèi)外專家做了大量的研究工作，以期客觀準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)煙葉質(zhì)量，化學(xué)成分分析就是其中一項(xiàng)主要的研究?jī)?nèi)容。

指紋圖譜是指某些復(fù)雜物質(zhì)，比如中藥，某種生物體或某種組織或細(xì)胞的DNA，蛋白質(zhì)經(jīng)適當(dāng)處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標(biāo)示其化學(xué)特征的色譜圖或光譜圖。

指紋圖譜主要分為中藥指紋圖譜，DNA指紋圖譜和肽指紋圖譜。中藥指紋圖譜是一種綜合的，可量化的鑒定手段，它是建立在中藥化學(xué)成分系統(tǒng)研究的基礎(chǔ)上，主要用于評(píng)價(jià)中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實(shí)性、優(yōu)良性和穩(wěn)定性。中藥及其制劑均為多組分復(fù)雜體系，因此評(píng)價(jià)其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)的，能提供豐富鑒別信息的檢測(cè)方法，建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)。在此基礎(chǔ)上，如果進(jìn)一步開(kāi)展譜效學(xué)研究，可使中藥質(zhì)量與其藥效真正結(jié)合起來(lái)，有助于闡明中藥作用機(jī)理?？傊兴幹讣y圖譜的研究和建立，對(duì)于提高中藥質(zhì)量，促進(jìn)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。

煙葉是煙草的主要經(jīng)濟(jì)部位，不同的品種，不同地區(qū)，甚至不同環(huán)境(如降雨量、施肥量等)都會(huì)對(duì)煙葉的品質(zhì)和風(fēng)味造成不同的影響，煙葉的風(fēng)味也是區(qū)分不同煙葉的主要標(biāo)準(zhǔn)，而煙葉風(fēng)味的形成，主要由內(nèi)部的幾種主要的組分構(gòu)成，尤其是具有揮發(fā)性的致香物。

但目前，這些物質(zhì)的檢測(cè)和評(píng)價(jià)，還主要集中在人工評(píng)價(jià)，以及一些簡(jiǎn)單的化學(xué)分析，在精準(zhǔn)度方面還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，并且，在不同的煙葉之間的區(qū)分，尤其是一些較為細(xì)微的區(qū)分，如前述一些種植過(guò)程中環(huán)境因素的變化，對(duì)于煙葉風(fēng)味的調(diào)整，常規(guī)的手段較為難以區(qū)分，這對(duì)于進(jìn)一步提升和改善煙葉的品質(zhì)，實(shí)現(xiàn)我國(guó)“卷煙上水平”戰(zhàn)略任務(wù)造成了困難。

因此，需要充分結(jié)合一些新興的技術(shù)，以及煙葉這一產(chǎn)品的特色，對(duì)煙葉的檢測(cè)方法和方式，都進(jìn)行改善。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提出一種通過(guò)水蒸餾提取煙葉中揮發(fā)性致香物構(gòu)建煙葉指紋圖譜的方法及其在煙葉揮發(fā)性致香物分析中的應(yīng)用，為煙葉的深入研究提供了更加科學(xué)可靠的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種通過(guò)水蒸餾提取煙葉中揮發(fā)性致香物構(gòu)建煙葉指紋圖譜的方法，包括：稱取烤煙葉，剪成小片裝入的圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入1000mL水，電熱套加熱；在另一250mL燒瓶中加入50mL石油醚，水浴加熱，同時(shí)蒸餾萃取2h后，保留石油醚萃取液，加無(wú)水硫酸鈉干燥24h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃水浴中將其濃縮至3mL左右，即得香氣濃縮物，供GC/MS分析。

進(jìn)一步，GC條件為：Ultra－2毛細(xì)管柱，載氣為N₂，柱頭壓170kPa。

進(jìn)一步，烤煙葉小片的大小為(0.5–1)×(0.5–1)cm。

進(jìn)一步，其中檢測(cè)器FID進(jìn)樣口溫度280℃，檢測(cè)器溫度280℃，進(jìn)樣量2μl，分流比10∶1。

進(jìn)一步，在GC/MS測(cè)定時(shí)，電離電壓70ev，離子源溫度200℃，傳輸線溫度220℃，使用Wiley譜庫(kù)進(jìn)行圖譜檢索。

一種通過(guò)水蒸餾提取煙葉中揮發(fā)性致香物構(gòu)建煙葉指紋圖譜的方法在煙葉揮發(fā)性致香物分析中的應(yīng)用。通過(guò)構(gòu)建出不同煙葉中揮發(fā)性致香物的指紋圖譜，形成煙葉揮發(fā)性致香物的指紋圖譜庫(kù)，并針對(duì)所述煙葉揮發(fā)性致香物的指紋圖譜庫(kù)進(jìn)行劃分，形成對(duì)不同煙葉揮發(fā)性致香物的分類與劃分。

本發(fā)明的所述通過(guò)水蒸餾提取煙葉中揮發(fā)性致香物構(gòu)建煙葉指紋圖譜的方法，結(jié)合指紋圖譜技術(shù)和煙葉的特質(zhì)，創(chuàng)造性的形成了對(duì)煙葉中揮發(fā)性致香物構(gòu)建煙葉指紋圖譜構(gòu)建，并具體采用了水蒸餾提取的方式，保證了煙葉中物質(zhì)的有效獲取，并防止物質(zhì)的損傷或者變化。所述通過(guò)水蒸餾提取煙葉中揮發(fā)性致香物構(gòu)建煙葉指紋圖譜的方法在煙葉揮發(fā)性致香物分析中的應(yīng)用，也為煙葉的風(fēng)味的深入研究提供了新的方法。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為南雄粵煙97(C3F)2008烤煙精油指紋圖譜；

圖2為南雄粵煙97(C3F)2009烤煙精油指紋圖譜。

圖3為南雄粵煙97(X2F)2009烤煙精油指紋圖譜。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

南雄粵煙97(C3F)2008烤煙揮發(fā)性香氣物組成成分指紋圖譜構(gòu)建分析

稱取50.00g烤煙葉,剪成小片(約0.5–1×0.5–1cm大小)裝入2000mL的圓底燒瓶?jī)?nèi),加入1000mL水,電熱套加熱；在另一250mL燒瓶中加入50mL石油醚,水浴加熱,同時(shí)蒸餾萃取2h后,保留石油醚萃取液,加無(wú)水硫酸鈉干燥24h,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃水浴中將其濃縮至3mL左右,即得香氣濃縮物,供GC/MS分析。

GC條件：Ultra－2毛細(xì)管柱(50m×0.2mm×0.33μm)，載氣為N₂，柱頭壓170kPa，檢測(cè)器FID，進(jìn)樣口溫度280℃,檢測(cè)器溫度280℃,程序升溫:80℃(1min),2℃/min,至280℃(30min)，進(jìn)樣量2μl，分流比10∶1。GC/MS測(cè)定時(shí)GC條件同上，電離電壓70ev，離子源溫度200℃，傳輸線溫度220℃，使用Wiley譜庫(kù)進(jìn)行圖譜檢索。

南雄粵煙97(C3F)2008烤煙揮發(fā)性香氣物組成成分分析結(jié)果見(jiàn)表1。從圖1可辯出10個(gè)峰，其中主要揮發(fā)性成份有：2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、尼古丁、大馬酮、2-叔丁基苯并噻吩、氧化茄酮、巨豆三烯酮-2(二個(gè)峰)、3-羥基馬鈴薯螺二烯酮、棕櫚酸和硬脂酸酸。它們的相對(duì)含量分別是：21.65％、4.84％、4.47％、3.76％、11.02％、18.44％、1.90％、4.01％、5.21％和3.30％。

表1南雄C3F煙葉精油主要致香成分(2008)

實(shí)施例2

南雄粵煙97(C3F)2009烤煙揮發(fā)性香氣物組成成分指紋圖譜分析

南雄粵煙97(C3F)2009烤煙揮發(fā)性香氣物組成成分分析結(jié)果見(jiàn)表2。從表2可以看出，粵煙97(C3F)烤煙精油中可檢測(cè)出67種成分，除鄰二甲苯、間二甲苯、苯并噻唑和四十四烷不為非香味成分外，其它63種為致香物質(zhì),它們的代謝途徑與主要致香物的分類如下：

代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有：

(1)類胡蘿卜素的降解和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有：香葉基丙酮1.06％、4-氧代異氟爾酮含量0.06％、β-環(huán)檸檬醛和藏紅花醛0.16％、二氫獼猴桃內(nèi)酯0.31％,β-紫羅蘭酮4.13％、4-(2,6,6-三甲基-1,3-環(huán)己二烯)-3-丁烯-2-酮(大馬酮)0.54％,4-羥大馬士酮0.1％、β-大馬烯酮含量4.13％、巨豆三烯酮11.83％；

(2)葉綠素分解代謝產(chǎn)物,新植二烯22.64％。

(3)苯丙氨酸和本質(zhì)素代謝產(chǎn)物有：苯甲醛0.15％,2,5-二甲基苯甲醛0.03％、苯乙醛0.4％,苯甲醇0.42％、苯乙醇0.46％

(4)類脂物的降解產(chǎn)物：亞油酸2.98％、亞麻酸甲酯、十四烷酸、十五烷酸、棕櫚酸、十七烷酸、硬脂酸、二十七烷酸和四十四烷酸,分別含量為1.2％、0.33％、26.39％、0.55％、1.2％、0.33％和0.33％、棕櫚酸甲酯0.29％。

(5)非酶棕化反應(yīng)產(chǎn)物有：2-戊基呋喃、2-甲基四氫呋喃-3-酮。

(6)西柏烯降解產(chǎn)物：茄酮2.51％。

致香物類型：

(1)酮類

2-戊基呋喃0.01％、2-甲基四氫呋喃-3-酮0.01％、2,3-辛二酮0.01％、6-甲基-5-庚烯-2-酮0.06％、4-氧代異氟爾酮0.06％、E-5-異丙基-8-甲基-6,8-壬二烯-2-酮(茄酮)2.51％、4-(2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-基)-3-丁烯-1-酮(4-羥大馬士酮)0.1％、香葉基丙酮1.06％、β-紫羅蘭酮0.19％、4-[2,2,6-三甲基-7-氧雜雙環(huán)[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮0.34％、4-(2,6,6-三甲基-1,3-環(huán)己二烯)-3-丁烯-2-酮(大馬酮)0.54％、植酮0.11％、巨豆三烯酮11.83％、法尼基丙酮0.42％、1-亞甲基-7-甲基-5-(二甲基亞甲基)雙環(huán)[5.3.0]-7-癸烯-3-酮0.22％。酮類占致香物的17.47％。

(2)醛類

壬醛0.02％、糠醛0.34％、癸醛0.03％、苯甲醛0.15％、反式-2-壬烯醛0.04％、β-環(huán)檸檬醛0.12％、藏紅花醛0.04％、苯乙醛0.4％、2,5-二甲基苯甲醛0.03％。醛類占致香物的1.17％。

(3)醇類

異辛醇0.22％、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇(沉香醇)0.10％、苯甲醇0.42％、苯乙醇0.46％、葉綠醇0.02％、9-(1,1-二甲基丙烯基)-5-香檸檬醇0.21％、西柏三烯二醇1.48％、1,5,9-三甲基-12-異丙基-4,8,13-環(huán)十四烯-1,3-二醇1.13％、柏木醇0.08％。醇類占致香物的4.12％。

(4)脂肪酸類

壬酸0.17％、肉豆蔻酸1.20％、十五烷酸0.33％、棕櫚酸26.39％、十七烷酸0.55％、硬脂酸1.20％、反油酸2.19％、亞油酸2.98％。脂肪酸類占致香物的35.01％。

(5)酯類

鄰苯二甲酸二異丁酯0.87％、棕櫚酸甲酯0.29％、二氫獼猴桃內(nèi)酯0.31％、亞麻酸甲酯4.03％。酯類占致香物的5.50％

(6)稠環(huán)芳香烴類

1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘0.02％、1,2-二氫-1,1,6-三甲基萘0.25％。稠環(huán)芳香烴類占致香物的0.27％。

(7)酚類

4-甲氧基苯酚0.08％、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚1.00％。酚類占致香物的1.08％。

(8)不飽和脂肪烴類

1-十四烯0.02％、3,6-二氧-1-甲基-8-異丙基-三環(huán)[6,2,2,0(2,7)]十二-4,9-二烯0.03％、(E,E)-7,11,15-三甲基-3-亞甲基-十六-1,6,10,14-四烯0.14％、(E)-1-疊氮基-2-苯乙烯0.06％。不飽和脂肪烴類占致香物的0.25％。

(9)烷烴類

7-甲基-四環(huán)[4.1.0.0(2.4).0(3.5)]庚烷0.01％、二十七烷0.33％、四十四烷0.33％。烷烴類占致香物的0.67％。

(10)生物堿類

煙堿1.51％、二烯煙堿0.05％。生物堿類占致香物的1.56％。

(11)萜類

新植二烯22.64％、角鯊烯0.36％。萜類占致香物的23.00％。

(12)雜環(huán)類

2-乙?；量?.12％、苯并噻唑0.1％。雜環(huán)類占致香物的0.22％。

(13)芳香烴類

2,3-二氫-1,1,5,6-四甲基-1H-茚0.03％。芳香烴類占致香物的0.03％。

表2南雄C3F煙葉精油主要致香成分(2009)

實(shí)施例3

南雄粵煙97(X2F)2009烤煙揮發(fā)性香氣物組成成分指紋圖譜分析

南雄粵煙97(X2F)2009烤煙揮發(fā)性香氣物組成成分分析結(jié)果見(jiàn)表3。從表3可以看出,粵煙97(X2F)烤煙精油中可檢測(cè)出68種成分,除對(duì)二甲苯、鄰二甲苯、間二甲苯、苯并噻唑和四十四烷為非香味成分外,其它63種為致香物質(zhì),它們代謝途徑與主要致香物的分類如下：

代謝轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有：

⑴類胡蘿卜素的降解和轉(zhuǎn)化產(chǎn)物有：香葉基丙酮1.23％、4-氧代異氟爾酮含量0.05％、β-環(huán)檸檬醛和藏紅花醛0.16％、二氫獼猴桃內(nèi)酯0.32％、β-紫羅蘭酮0.16％、4-(2,6,6-三甲基-1,3-環(huán)己二烯)-3-丁烯-2-酮(大馬酮)0.29％、4-羥大馬士酮0.15％、β-大馬烯酮含量3.86％、巨豆三烯酮8.56％。

⑵葉綠素分解代謝產(chǎn)物,新植二烯19.39％。

⑶苯丙氨酸和本質(zhì)素代謝產(chǎn)物有：苯甲醛0.06％、2,5-二甲基苯甲醛0.03％、苯乙醛0.11％,苯甲醇0.24％、苯乙醇0.19％。

⑷類脂物的降解產(chǎn)物：亞油酸5.26％、亞麻酸甲酯9.02％、十四烷酸1.29％、十五烷酸1.18％、棕櫚酸28.49％、十七烷酸0.54％、硬脂酸1.39％、反油酸2.53％、棕櫚酸甲酯0.44％。

⑸西柏烯降解產(chǎn)物：茄酮1.6％。

致香物類型：

⑴酮類

6-甲基-5-庚烯-2-酮0.13％、4-氧代異氟爾酮0.05％、E-5-異丙基-8-甲基-6,8-壬二烯-2-酮(茄酮)1.6％、4-(2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-基)-3-丁烯-1-酮(4-羥大馬士酮)0.15％、香葉基丙酮1.23％、β-紫羅蘭酮0.16％、β-大馬烯酮含量3.86％、4-[2,2,6-三甲基-7-氧雜雙環(huán)[4.1.0]庚-1-基]-3-丁烯-2-酮0.29％、4-(2,6,6-三甲基-1,3-環(huán)己二烯)-3-丁烯-2-酮(大馬士酮)0.36％、植酮0.14％、巨豆三烯酮8.56％、法尼基丙酮0.56％、1-硫茚-2,3-C-喹啉-6(5H)-硫酮0.02％、2-環(huán)戊烯-1,4-二酮0.02％、α-香附酮0.4％。酮類占致香物的17.53％。

⑵醛類

壬醛0.02％、糠醛0.18％、癸醛0.03％、苯甲醛0.06％、(E)-壬烯醛0.05％、反-2-順-6-壬二烯醛0.1％、β-環(huán)檸檬醛0.11％、藏紅花醛0.05％、苯乙醛0.11％、2,5-二甲基苯甲醛0.03％。醛類占致香物的0.74％。

⑶醇類

異辛醇0.23％、3,7-二甲基-1,6-辛二烯-3-醇(沉香醇)0.08％、苯甲醇0.24％、苯乙醇0.19％、反式橙花叔醇0.03％、金合歡醇0.04％、葉綠醇0.15％、9-(1,1-二甲基丙烯基)-5-香檸檬醇0.21％、西柏三烯二醇0.79％、柏木醇0.1％。醇類占致香物的2.06％。

⑷脂肪酸類

壬酸0.26％、肉豆蔻酸1.29％、十五烷酸1.18％、棕櫚酸28.49％、十七烷酸0.54％、硬脂酸1.39％、反油酸2.53％、亞油酸5.26％。脂肪酸類占致香物的40.94％。

⑸酯類

鄰苯二甲酸二異丁酯0.33％、棕櫚酸甲酯0.44％、二氫獼猴桃內(nèi)酯0.32％、亞麻酸甲酯9.02％。酯類占致香物的10.11％。

⑹稠環(huán)芳香烴類

1,2,3,4-四氫-1,1,6-三甲基萘0.03％、1,2-二氫-1,1,6-三甲基萘0.28％、三甲基四氫化萘0.02％。稠環(huán)芳香烴類占致香物的0.33％.

⑺酚類

鄰甲氧基苯酚0.05％、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚0.96％。酚類占致香物的1.01％。

⑻不飽和脂肪烴類

2,6-二甲基-2-反式-6-辛二烯0.03％、3,6-氧代-1-甲基-8-異丙基三環(huán)[6.2.2.0(2,7)]十二4,9-二烯0.03％、(E,E)-7,11,15-三甲基-3-亞甲基-1,6,10,14-十六碳烯0.11％。不飽和脂肪烴類占致香物的0.17％。

⑼烷烴類

戊基環(huán)丙烷0.02％、二十七烷0.22％、二十九烷0.73％％、三十五烷0.72％、四十四烷0.47％。烷烴類占致香物的2.16％。

⑽生物堿類

煙堿0.23％。生物堿類占致香物的0.23％

⑾萜類

新植二烯19.39％。萜類占致香物的19.39％。

⑿雜環(huán)類

3-乙基-2,4-二甲基吡啶0.02％、苯并噻唑0.16％。雜環(huán)類占致香物的0.18％。

表3：南雄粵煙97(X2F)2009烤煙精油香氣物組成

從上述實(shí)施例可以明顯的看出，即使是同一烤煙品種、同一采摘部分的不年份，或同一烤煙品種同一年份不同采摘部位，采用上述的方法進(jìn)行指紋圖譜的構(gòu)建后，都能夠進(jìn)行區(qū)分，并形成對(duì)同一品種的不同部位、不同年份的指紋圖譜分析，為深入分析南雄粵煙97的風(fēng)味提供了更為可靠科學(xué)的方法，為獲得更加具有特色風(fēng)味的烤煙提供了更好的思路與方法。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。