本發(fā)明涉及一種酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒以及農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法，更具體地說(shuō)，是一種利用酶聯(lián)免疫分析技術(shù)檢測(cè)水果盒蔬菜中嘧霉胺的殘留，屬于酶聯(lián)免疫檢測(cè)（elisa）技術(shù)領(lǐng)域。

技術(shù)背景

嘧霉胺（pyrimethanil）是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的一種苯胺基嘧啶類廣譜低毒殺菌劑，對(duì)果蔬中的枯萎病以及草莓、黃瓜等作物的灰霉病等具有極好的防治效果，此外，在果蔬運(yùn)輸過(guò)程中可作為抑霉劑，從而起到保鮮防腐的作用。嘧霉胺具有獨(dú)特的作用機(jī)理，可抑制病原菌中侵染酶的產(chǎn)生以阻止病原菌入侵，其具有葉片穿透及根部?jī)?nèi)吸活性，能迅速傳遞至作物體內(nèi)各部位。隨著農(nóng)作物病蟲(chóng)害發(fā)生率的日益增長(zhǎng)，農(nóng)藥的使用量也隨之增加，農(nóng)藥殘留問(wèn)題由此獲得國(guó)內(nèi)外科研工作者的廣泛關(guān)注。我國(guó)強(qiáng)制性國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定水果和蔬菜中嘧霉胺的最高殘留量為7mg/kg（柑橘類水果等）和3mg/kg（蔥、菜豆等），另外日本等國(guó)家也對(duì)我國(guó)出口的果蔬中嘧霉胺的殘留量制定了嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。

目前報(bào)道的有關(guān)嘧霉胺殘留的分析方法有氣相色譜法（npd檢測(cè)器）、高效液相色譜法、氣（液）相色譜-質(zhì)譜連用等，但這些方法都存在回收率低、檢測(cè)樣品前處理程序繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)等缺點(diǎn)。因此，迫切需要一種快速簡(jiǎn)便的新方法來(lái)檢測(cè)嘧霉胺。酶聯(lián)免疫法（elisa）是一種敏感、快速且效率極高的檢測(cè)分析方法與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，其具有樣品處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、方法簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。有關(guān)于果蔬中農(nóng)藥殘留檢測(cè)分析的elisa試劑盒方法的報(bào)道很多，但目前仍未見(jiàn)到利用酶聯(lián)免疫方法檢測(cè)嘧霉胺殘留的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了提供一種檢測(cè)水果和蔬菜中嘧霉胺殘留的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒以及檢測(cè)方法，其中，嘧霉胺多克隆抗體為該試劑盒中最為主要的成分，該試劑盒具有高靈敏度、高特異性等優(yōu)點(diǎn)，可高效、快速檢測(cè)果蔬中的嘧霉胺殘留，能批量制作應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中。

本發(fā)明提供的一種嘧霉胺多克隆抗體的制備方法，其特征在于：將乙腈、2-氯-4,6-二甲基嘧啶、吡啶加至三口燒瓶中，將燒杯置于磁力攪拌器上，并于反應(yīng)器內(nèi)放置溫度計(jì)，在50~60℃下滴加對(duì)氨基苯乙酸，反應(yīng)后，tlc跟蹤直至原料消失，然后降溫至30℃，將反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)層析柱子，收集半抗原產(chǎn)物；將半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)，得到嘧霉胺人工抗原；利用嘧霉胺人工抗原對(duì)小型哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫，所得到的多克隆抗體即為嘧霉胺多克隆抗體。

其中，包被有嘧霉胺包被抗原的酶標(biāo)板制備過(guò)程中所使用的包被抗原是嘧霉胺抗原與卵清蛋白的偶聯(lián)復(fù)合物，包被緩沖液為0.05mol/lph9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，封閉液為1%的bsa/pbs緩沖液。

其中，洗滌液為ph4.7的pbst溶液，其配制步驟如下：取na2hpo4·12h2o68.8g，nah2po46.9g，nacl45g，加雙蒸水至1000ml，ph調(diào)至7.4。

其中，酶標(biāo)記物為酶標(biāo)二抗，標(biāo)記酶為辣根過(guò)氧化物酶。

其中，底物顯色液為tmb-過(guò)氧化氫脲溶液，配制步驟如下：底物液a：取無(wú)水乙酸鈉8.2g，β-糊精2.5g，過(guò)氧化氫脲428.6mg，加雙蒸水至1000ml，調(diào)節(jié)ph至5.0，4℃保存；底物液b：取100mgtmb溶于10mldmso中，棕色瓶保存；使用前取14.6ml底物液a和0.45ml底物液b混合15min。終止液為1.25mol/l的h2so4。

本發(fā)明提供的利用試劑盒檢測(cè)嘧霉胺農(nóng)藥殘留的方法，步驟如下：

1、稱取果蔬中可食用部分10g放入研缽中，加入10ml提取液，充分研磨過(guò)濾，收集的濾液即為待測(cè)樣品。

2、取待測(cè)樣品和包被緩沖液加入孔內(nèi)，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（嘧霉胺標(biāo)準(zhǔn)品包被），37℃包被30min。洗滌，瀝干，其中，用洗滌液洗滌3次，每次3min。

3、每孔加入0.4ml封閉液封閉30min，清洗后瀝干。

4、每孔加入0.1ml嘧霉胺抗體，37℃孵育40min后洗滌3次。

5、每孔加入0.1ml酶標(biāo)二抗羊抗兔（hrp）抗體，37℃孵育40min后洗滌3次。

6、每孔加入0.1ml底物顯色液（現(xiàn)用現(xiàn)配）37℃孵育20min。

7、每孔加入0.05ml終止液。

8、利用酶標(biāo)儀于450nm、655nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔o(hù)d值。將嘧霉胺待測(cè)樣品od值與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行對(duì)比。

本發(fā)明試劑盒的分析原理是：

包被于微孔板上的嘧霉胺人工抗原與牛血清蛋白偶聯(lián)形成偶聯(lián)復(fù)合物，嘧霉胺待測(cè)樣品與嘧霉胺人工抗原相結(jié)合，而后與酶標(biāo)二抗（hrp）結(jié)合，形成“嘧霉胺人工抗原-嘧霉胺待測(cè)樣品-酶標(biāo)二抗”復(fù)合物，加入底物液，觀察顯色反應(yīng)結(jié)果，當(dāng)待測(cè)樣品中嘧霉胺濃度較高時(shí)，其顯色較深，酶標(biāo)儀檢測(cè)結(jié)果od值較高；反之，待測(cè)樣品中嘧霉胺濃度較低時(shí)，其顯色反應(yīng)較淺，od值相對(duì)較低。

本發(fā)明的積極效果：能快速靈敏地檢測(cè)果蔬中殘留的嘧霉胺，樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，處理時(shí)間少，并且方便同時(shí)檢測(cè)大量樣品，其成本低于傳統(tǒng)高效液相色譜、氣相色譜等方法。

具體實(shí)施方式

以下將結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步闡述，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1

嘧霉胺半抗原制備

分別取30ml的乙腈，1.5g的2-氯-4,6-二甲基嘧啶，3g的吡啶加入到三口燒瓶中，將燒杯置于磁力攪拌器上，并于反應(yīng)器內(nèi)放置溫度計(jì)，在50~60℃下滴加1.9g對(duì)氨基苯乙酸，滴加完畢后回流反應(yīng)5h，tlc跟蹤直至原料消失，然后降溫至30℃，將反應(yīng)產(chǎn)物過(guò)層析柱子，收集后的產(chǎn)物經(jīng)旋蒸后得純凈物質(zhì)1.5g。

實(shí)施例2

嘧霉胺人工抗原制備

稱取1.5g嘧霉胺半抗原，溶于2mldmf中，均勻攪拌，加入30μl三正丁胺，冰浴，加30μl溶解于dmf的氯甲酸異丁酯，攪拌1h。稱取3.2gbsa，溶于5mlph9.60.1mol/l檸檬酸鹽緩沖液中。將半抗原、dmf混合溶液逐滴加入bsa溶液中，4℃下攪拌5h，5000r/min離心20min后，棄掉沉淀，上清液透析三天，透析期間每隔8h更換一次透析液，最終得到嘧霉胺人工抗原。

實(shí)施例3

嘧霉胺多克隆抗體制備

取3mg嘧霉胺人工抗原溶于1ml生理鹽水中，將稀釋過(guò)后的嘧霉胺人工抗原與等體積的弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，隨后利用皮下多點(diǎn)注射方法將乳化后的嘧霉胺人工抗原注射于新西蘭大白兔體內(nèi)，每只大白兔一次用量為0.5mg/kg。15天后，將同樣用生理鹽水稀釋過(guò)的嘧霉胺人工抗原與等體積弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化，加強(qiáng)免疫，劑量為0.01mg/kg，15天后進(jìn)行第三次使用稀釋過(guò)嘧霉胺人工抗原與弗氏不完全佐劑乳化后進(jìn)行加強(qiáng)免疫，從此次加強(qiáng)免疫開(kāi)始，免疫7天后取血，并測(cè)定其抗血清效價(jià)，直到其效價(jià)達(dá)到一定數(shù)值，將制備好的多克隆抗體保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)施例4

嘧霉胺酶聯(lián)免疫吸附分析檢測(cè)試劑盒，其包括以下組分：

（1）包被有嘧霉胺包被抗原的酶標(biāo)板；

（2）嘧霉胺標(biāo)準(zhǔn)品；

（3）嘧霉胺多克隆抗體；

（4）辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體；

（5）洗滌液：na2hpo4·12h2o68.8g，nah2po46.9g，nacl45g；

（6）底物液：底物液a：無(wú)水乙酸鈉8.2g，β-糊精2.5g，過(guò)氧化氫脲428.6mg；底物液b：100mgtmb，10mldmso；

（7）反應(yīng)終止液：1.25mol/l的h2so4；

（8）說(shuō)明書(shū)一份。

實(shí)施例5

利用試劑盒檢測(cè)嘧霉胺殘留

（1）樣品前處理：稱取果蔬中可食用部分10g放入研缽中，加入10ml提取液，充分研磨過(guò)濾，收集的濾液即為待測(cè)樣品。

（2）取待測(cè)樣品和包被緩沖液加入孔內(nèi)，并設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照（嘧霉胺標(biāo)準(zhǔn)品包被），37℃包被30min。洗滌，瀝干，其中，用洗滌液洗滌3次，每次3min。

每孔加入0.4ml封閉液封閉30min，清洗后瀝干。

（3）在包被有抗原并封閉好的酶標(biāo)板孔中，加入相同體積的嘧霉胺抗體及待測(cè)樣品，37℃孵育40min后用洗滌液洗滌3次。

（4）加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔抗體0.1ml，37℃孵育40min后用洗滌液洗滌3次。

（5）加入新鮮配制的底酶標(biāo)板物顯色液0.1ml，37℃孵育20min.

（6）加入終止液0.05ml終止反應(yīng)。

（7）將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀中，于490nm波長(zhǎng)處測(cè)定檢測(cè)結(jié)果。