本發(fā)明是一種檢測(cè)NMP22含量的試劑盒及其制備方法，涉及雙抗體夾心吖啶酯標(biāo)記管式化學(xué)發(fā)光免疫分析法(Chemiluminesent Immunoassay，CLIA)檢測(cè)人尿液中NMP22濃度水平的試劑盒的制備工藝。

背景技術(shù)：

在泌尿系統(tǒng)腫瘤當(dāng)中，膀胱癌的發(fā)病率高居首位，近年來膀胱癌的發(fā)病率有上升趨勢(shì)。大部分膀胱癌患者確診時(shí)處于分化良好或中等分化的非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，其中約10％的患者最終發(fā)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌或轉(zhuǎn)移性膀胱癌在保留膀胱的各種手術(shù)治療中，約50％在2a內(nèi)腫瘤可能復(fù)發(fā)，約10％-15％的復(fù)發(fā)腫瘤惡性程度有增加趨勢(shì)，因此長(zhǎng)期隨訪早期發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)是膀胱腫瘤治療成功的關(guān)鍵之一。

目前，尋找特異、敏感、穩(wěn)定的早期診斷標(biāo)志物，對(duì)膀胱癌的早期診斷治療和預(yù)后判斷起到了積極的作用。膀胱鏡檢查及活檢是膀胱癌的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，但屬侵入性的檢查，且有較高的經(jīng)濟(jì)成本，并存在尿路感染的風(fēng)險(xiǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌患者細(xì)胞中核基質(zhì)蛋白(nuclear matrix protein)濃度為正常細(xì)胞的25倍。NMP22在細(xì)胞凋亡后，由細(xì)胞核釋出，以可溶性復(fù)合物或片段的形式存在于尿中，膀胱癌患者尿NMP22濃度水平為非癌對(duì)照組的20-80倍。臨床工作中，NMP22腫瘤標(biāo)記物在膀胱癌中的檢測(cè)對(duì)膀胱癌的早期診斷治療和預(yù)后判斷起到了積極的作用。

核基質(zhì)蛋白構(gòu)成了細(xì)胞核的內(nèi)部結(jié)構(gòu)框架，并與DNA復(fù)制、RNA合成、激素結(jié)合等功能有關(guān)。進(jìn)一步的研究表明NMP22參與了基因表達(dá)的調(diào)節(jié)和協(xié)調(diào)。Fey和Penman的研究表明，NMP的表達(dá)存在細(xì)胞間差異。

核有絲分裂器蛋白(NuMA)在核基質(zhì)蛋白中占有很大的比例。它在分裂間期的細(xì)胞核內(nèi)是分散的，在有絲分裂期位于紡錘體兩極。核有絲分裂器蛋白最初由Lydersen和Pettijohn在分析染色質(zhì)非組蛋白時(shí)首次報(bào)道22。隨后，核分裂器蛋白的其他功能被提了出來，包括維持細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，建立/維持有絲分裂紡錘體和有絲分裂后細(xì)胞核的重建。

在結(jié)構(gòu)上，這一240KD的核有絲分裂器蛋白含有球形的頭部和由中央螺旋竿分割開來的尾部結(jié)構(gòu)域。核有絲分裂器蛋白的cDNA已被數(shù)個(gè)研究小組克隆并測(cè)序，雖然所報(bào)道的序列有所差異。在腫瘤細(xì)胞內(nèi)，核有絲分裂器蛋白的升高與惡性細(xì)胞的細(xì)胞核結(jié)構(gòu)/形態(tài)改變相符合。由于細(xì)胞死亡(如凋亡)，該蛋白從細(xì)胞內(nèi)釋放出來，并達(dá)到可檢測(cè)的水平。利用識(shí)別核分裂器蛋白特定區(qū)域的單克隆抗體對(duì)尿液中由膀胱腫瘤細(xì)胞釋出的核分裂器蛋白進(jìn)行檢測(cè)。尿核基質(zhì)蛋白22(NMP22)檢測(cè)試劑盒(膠體金法)試驗(yàn)所檢測(cè)的核分裂器蛋白抗原部分被Matritech公司稱為NMP22。

目前市場(chǎng)中檢測(cè)NMP22的方法有膠體金法。其中膠體金法，靈敏度較低，易出現(xiàn)假陽性，其結(jié)果易受主觀因素的影響。本發(fā)明是采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)NMP22含量。

化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定(CLIA)技術(shù)是繼酶免技術(shù)(EIA)、放免技術(shù)(RIA)、熒光免疫技術(shù)(FIA)和時(shí)間分辨熒光免疫技術(shù)(TRFIA)之后發(fā)展的一項(xiàng)新興測(cè)定技術(shù)。根據(jù)發(fā)光物質(zhì)(原理)的不同，可以分為直接化學(xué)發(fā)光免疫分析和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析、以及電化學(xué)發(fā)光幾大類型。其中直接化學(xué)發(fā)光劑在發(fā)光免疫分析過程中不需酶的催化作用，直接參與發(fā)光反應(yīng)，它們?cè)诨瘜W(xué)結(jié)構(gòu)上有產(chǎn)生發(fā)光的特有基團(tuán)，可直接標(biāo)記抗原或抗體，而且采用納米磁性微珠分離。如用吖啶酯直接標(biāo)記抗體(抗原)，與待測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原(抗體)發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測(cè)抗原-吖啶酯標(biāo)記抗體復(fù)合物，這時(shí)只需加入氧化劑(H₂O₂)和NaOH使成堿性環(huán)境，吖啶酯在不需要催化劑的情況下分解、發(fā)光。CLIA特異性強(qiáng)、敏感性高，可檢測(cè)到10^-15mol/L的抗原量?？焖?，一般幾十分鐘或1～3小時(shí)內(nèi)完成；操作簡(jiǎn)便，可進(jìn)行固相和均相分析；試驗(yàn)重復(fù)性好，試劑易標(biāo)準(zhǔn)化和商品化，且不象放射分析那樣存在強(qiáng)烈的環(huán)境污染和健康危害，是一種非常優(yōu)秀的檢測(cè)分析方法。目前已用于多種藥物、激素、病原微生物及其代謝產(chǎn)物、抗體及其他生物活性物質(zhì)的測(cè)定，并在臨床尤其是大型醫(yī)院有著較為廣泛的應(yīng)用。納米磁性微珠分離是目前世界上最先進(jìn)的分離手段，直接發(fā)光法不易受到檢測(cè)樣品中其他物質(zhì)干擾，是目前世界技術(shù)最領(lǐng)先的發(fā)光模式。所以采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法測(cè)定NMP22濃度。

本發(fā)明利用單位及合作團(tuán)隊(duì)共同研制的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Caris200，測(cè)定NMP22含量的試劑盒，應(yīng)用于人尿液NMP22含量的檢測(cè)，從而輔助膀胱癌早期診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)等醫(yī)療需求。

本發(fā)明的試劑盒作為國(guó)內(nèi)首個(gè)適用于Caris200的配套的測(cè)定NMP22的試劑盒，并利用管式吖啶酯標(biāo)記的化學(xué)發(fā)光法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便及成本低廉等顯著優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明采用于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Caris 200檢測(cè)NMP22含量試劑盒(以下簡(jiǎn)稱NMP22-CLIA試劑盒)。該試劑盒采用雙抗體夾心免疫分析方法，利用化學(xué)發(fā)光磁性微球免疫技術(shù)，將抗-NMP22抗體-生物素-鏈霉親和素的磁性微球和反應(yīng)杯中的標(biāo)準(zhǔn)品/樣本中的NMP22特異結(jié)合，然后再與吖啶酯鹽標(biāo)記的另一株抗-NMP22抗體反應(yīng)形成免疫復(fù)合物，經(jīng)預(yù)激發(fā)液(Pre-Trigger)和激發(fā)液(Trigger)的酸堿化學(xué)反應(yīng)，即可測(cè)量化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的相對(duì)光單位(RLU/s)；標(biāo)準(zhǔn)品/樣本中NMP22的含量和光學(xué)系統(tǒng)所測(cè)量出的相對(duì)光單位(RLU/s)成正比關(guān)系，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，從而對(duì)可對(duì)尿液標(biāo)本中NMP22含量進(jìn)行定量測(cè)定。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，發(fā)明人采用了以下技術(shù)方案：

1)篩選確認(rèn)試劑反應(yīng)實(shí)現(xiàn)所需的核心原料，過程包括以下步驟：

①鏈霉親和素與磁性微球偶聯(lián)；

②親和素連接NMP22抗體；

③以吖啶酯標(biāo)記NMP22抗體；

④配制與吖啶酯作用的發(fā)光底物液：預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液；

⑤配制NMP22抗體的校準(zhǔn)品和質(zhì)控品；

⑥試劑盒的組裝；

2)試劑盒的性能評(píng)價(jià)，過程包括以下步驟：

①反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化：即繪制劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線并優(yōu)化生物素標(biāo)記抗體和吖啶酯標(biāo)記抗體濃度；

②實(shí)驗(yàn)室性能評(píng)估：即確定試劑盒的最低檢測(cè)量、準(zhǔn)確性、精密度和劑量-反應(yīng)曲線的線性；

③穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：即試劑盒在加速破壞實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定性測(cè)試，確定試劑盒的儲(chǔ)存條件；

④cut-off值的建立：即通過臨床樣本的檢測(cè)，設(shè)定試劑檢測(cè)時(shí)的NMP22尿液正常參考值范圍；

⑤臨床樣本的檢測(cè)：即檢測(cè)試劑盒的特異性。

本發(fā)明的試劑盒適用于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Caris 200。

利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)范圍寬(0～100IU/mL)，范圍較廣、無放射性污染的特點(diǎn)，非常適用于臨床檢測(cè)。

附圖說明

圖1 NMP22-CLIA試劑盒檢測(cè)劑量-反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

圖2 NMP22-CLIA試劑盒穩(wěn)定性。

圖3 NMP22-CLIA試劑盒反應(yīng)線性及HOOK效應(yīng)。

圖4 NMP22-CLIA試劑盒檢測(cè)健康者尿液濃度分布圖(n＝425)。

圖5 NMP22-CLIA試劑盒檢測(cè)100例尿液樣本的ROC曲線。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 鏈霉親和素包被磁性微球的制備方法

1、鏈霉的預(yù)處理：

(1)將0.1mg鏈霉親和素加入超濾離心管(10kDa)中，8000r/min離心5-6min。將離心濃縮后的鏈霉親和素加入200uL Binding Buffer，8000-9000r/min離心5-6min，棄掉濾液，再加入200uL Binding Buffer，按上述方法離心。

(2)將幾次離心后的離心管取出，棄掉濾液，把離心柱反轉(zhuǎn)，2000-3000r/min離心1min，收集濾液，整個(gè)過程收集鏈霉親和素大約200μL。

2、磁性微球的處理：

(1)用漩渦混合器充分混勻懸浮磁性微球，取20.0mg懸浮液到微量厚壁反應(yīng)瓶中；

(2)將微量厚壁反應(yīng)瓶置于磁分離架上約1分鐘，小心移去上清；

(3)加入1mL Binding Buffer，用漩渦混合器充分混勻懸浮磁性微球；

(4)將微量厚壁反應(yīng)瓶置于磁分離架上約1分鐘，小心移去上清；

(6)加入50.0μL Coupling Reagent，用漩渦混合器充分混勻懸浮磁性微球；

(7)用磁性微球混合器旋轉(zhuǎn)60分鐘；

(8)將微量厚壁反應(yīng)瓶置于磁分離架上約1分鐘，小心移去上清；

(9)加入1mL Binding Buffer，用漩渦混合器充分混勻懸浮磁性微球；

(10)將微量厚壁反應(yīng)瓶置于磁分離架上約1分鐘，小心移去上清；

(12)加入已經(jīng)預(yù)處理后的鏈霉親和素，用Binding Buffer稀釋至1mg/mL并用漩渦混合器充分混勻懸浮磁性微球；

(13)用磁性微球混合器，旋轉(zhuǎn)包被16～20小時(shí)；

(14)將微量厚壁反應(yīng)瓶置于磁分離架上約1分鐘，小心移去上清；

(15)加入1mL TBST Buffer，用漩渦混合器充分混勻懸浮磁性微球；

(16)將微量厚壁反應(yīng)瓶置于磁分離架上約1分鐘，小心移去上清；

(17)將包被鏈霉親和素的磁性微球用M試劑稀釋液稀釋至終濃度，存放于2-8℃。

實(shí)施例2 生物素連接NMP22抗體的制備方法

1、抗體的預(yù)處理：

(1)將1mg抗體加入超濾離心管(50kDa)中，8000r/min離心5～6min進(jìn)行濃縮。將濃縮后的抗體加入200uL PB Buffer，8000～9000r/min離心5～6min，棄掉濾液，再加入200uL PB Buffer。

(2)將幾次離心后的離心管取出，棄掉濾液，把離心柱反轉(zhuǎn)，2000～3000r/min離心1min，收集濾液，整個(gè)過程收集抗體大約200μL。

2、抗體的標(biāo)記：

用預(yù)處理后的抗體與生物素按50∶1質(zhì)量比充分混勻，震蕩16-20小時(shí)即可。然后經(jīng)純化儀進(jìn)行純化所得。將標(biāo)記生物素的抗體用R1稀釋液稀釋至終濃度，存放于2～8℃。

實(shí)施例3 吖啶酯標(biāo)記NMP22抗體的制備方法

1、抗體的預(yù)處理：

(1)將1mg抗體加入超濾離心管(50kDa)中，8000r/min離心5～6min進(jìn)行濃縮。將濃縮后的抗體加入200uL PB Buffer，8000～9000r/min離心5～6min，棄掉濾液，再加入200uL PB Buffer。

(2)將幾次離心后的離心管取出，棄掉濾液，把離心柱反轉(zhuǎn)，2000～3000r/min離心1min，收集濾液，整個(gè)過程收集抗體大約200μL。

2、抗體的標(biāo)記：用預(yù)處理后的抗體與吖啶酯按20∶1質(zhì)量比充分混勻，震蕩16-20小時(shí)即可。然后經(jīng)純化儀進(jìn)行純化所得。將標(biāo)記吖啶酯的抗體用R2稀釋液稀釋至終濃度，存放于2～8℃。

實(shí)施例4 發(fā)光底物液的制備方法

本發(fā)明所使用的吖啶酯的化學(xué)發(fā)光底物液的配制方法：

預(yù)激發(fā)液：

激發(fā)液：pH為9-12

實(shí)施例5 NMP22校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的制備方法

以含有明膠穩(wěn)定劑的1％Mopso緩沖液為基質(zhì)，加入核基質(zhì)蛋白22(NMP22)純品配制而成。制備的最終濃度為：

校準(zhǔn)品1：0IU/mL；校準(zhǔn)品2：5IU/mL；校準(zhǔn)品3：10IU/mL；校準(zhǔn)品4：20IU/mL；校

準(zhǔn)品5：50IU/mL；校準(zhǔn)品6：100IU/mL；

質(zhì)控品：C1：2.5IU/mL，C2：25IU/mL，C3：80IU/mL。

實(shí)施例6 試劑盒的使用方法

1.裝載試劑

1.1 M試劑為黃褐色磁性微球懸浮液，出現(xiàn)沉淀屬于正?，F(xiàn)象。首次將NMP22定量測(cè)定試劑裝載到Caris200系統(tǒng)上前，需對(duì)M試劑瓶進(jìn)行翻轉(zhuǎn)混勻。

1.2如果目測(cè)磁性微球依然附著于瓶壁上，則需要繼續(xù)翻轉(zhuǎn)，直至磁性微球重新懸浮為止。如果長(zhǎng)時(shí)間沒有懸浮，則該試劑不能使用。

1.3將NMP22試劑按儀器要求裝載于Caris200上，確保檢測(cè)所需試劑全部上機(jī)。確保所有試劑瓶蓋已經(jīng)去除。

2.計(jì)算所需樣本量

2.1首次進(jìn)行NMP22檢測(cè)時(shí)，需要先漿樣本進(jìn)行1∶10稀釋，然后在樣品杯中加入已稀釋后的175μL樣本，每增加一次檢測(cè)需要向同一樣本杯中加入50μL的樣本。

2.2如果上機(jī)時(shí)間＞3小時(shí)，為防止樣本蒸發(fā)對(duì)檢測(cè)造成不良影響，應(yīng)適當(dāng)增加樣本量。

3.裝載樣本

將樣本杯移入樣本架中，按儀器要求裝載樣本并輸入正確的樣本信息。

4.運(yùn)行儀器

按下儀器開始鍵，儀器將自動(dòng)執(zhí)行以下操作：

4.1移動(dòng)樣本到指定的位置；

4.2加載反應(yīng)管；

4.3吸取和轉(zhuǎn)移樣本入反應(yīng)管；

4.4移動(dòng)反應(yīng)管到指定位置，將M試劑和R1試劑加入反應(yīng)管；

4.5混勻、孵育、洗滌反應(yīng)混合物；

4.6添加R2試劑入反應(yīng)管；

4.7混合、孵育和洗滌反應(yīng)混合物；

4.8添加預(yù)激發(fā)液和激發(fā)液；

4.9測(cè)試化學(xué)發(fā)光的發(fā)光量；

4.10吸出反應(yīng)管中液體倒入廢液袋，卸載反應(yīng)管至固體垃圾箱；

4.11計(jì)算結(jié)果。

實(shí)施例7 反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

反應(yīng)模式的優(yōu)化：以Ms202作為包被抗體，Ms203作為檢測(cè)抗體，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，采用兩步法，兩步法則先加入包被鏈霉親和素、生物素標(biāo)記抗體和標(biāo)準(zhǔn)品37℃孵育15min，洗滌2次后加入檢測(cè)抗體，孵育10min，洗滌2次后加入預(yù)激發(fā)液上機(jī)檢測(cè)的同時(shí)加入激發(fā)液，測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。以抗原濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以發(fā)光值對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線(如圖1所示)。

生物素標(biāo)記抗體和吖啶酯標(biāo)記抗體濃度的優(yōu)化：將生物素標(biāo)記的Ms202抗體稀釋成一系列的稀釋度，稀釋比例為1∶200、1∶400、1∶800、1∶1200。將吖啶酯標(biāo)記的Ms203抗體稀釋成一系列的稀釋度，稀釋比例為1∶500、1∶1000、1∶1500。使用NMP22標(biāo)準(zhǔn)品作為檢測(cè)樣本，反應(yīng)完成后測(cè)量RLU值。選擇本底低，線性相關(guān)系數(shù)好的為最佳包被濃度和標(biāo)記比例。從表1可以看出：(1)隨著生物素標(biāo)記抗體稀釋度的降低，RLU值有明顯上升，但是本底變化不大，所以靈敏度有所提高。在達(dá)到1∶400后，與1∶200稀釋差別不明顯，說明1∶400稀釋已接近飽和。因此我們選擇1∶400為生物素標(biāo)記抗體的最佳稀釋度；(2)隨著標(biāo)記吖啶酯稀釋比例的提高，整體RLU值下降，當(dāng)稀釋比例為1000∶1時(shí)，本底低、靈敏度好。因此，選擇生物素標(biāo)記抗體的稀釋度為1∶400，吖啶酯標(biāo)記抗體的稀釋度為1∶1000為最佳稀釋比例。

表1最佳生物素標(biāo)記抗體和吖啶酯標(biāo)記抗體稀釋度的確定

實(shí)施例8 試劑盒穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將試劑盒的各組分(MP：鏈霉親和素包被磁性微球，R1：生物素標(biāo)記抗體R2：吖啶酯標(biāo)記抗體，STD：標(biāo)準(zhǔn)品)放于37℃7天，檢測(cè)工作曲線的發(fā)光值。如圖2所示，與4℃對(duì)照相比較，各組分放置37℃7天后整體曲線相關(guān)系數(shù)變化不大，與對(duì)照組無差異；各組分分別于對(duì)照相比，曲線相關(guān)性變化基本無差異。試劑盒在加速破壞實(shí)驗(yàn)中穩(wěn)定性能能良好。初步設(shè)定該試劑盒在4℃條件下可以穩(wěn)定儲(chǔ)存12個(gè)月。

實(shí)施例9 試劑盒的實(shí)驗(yàn)室性能

對(duì)實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室性能分析，結(jié)果如下：

1)最低檢測(cè)量：2.5IU/mL。

2)準(zhǔn)確性

用樣本稀釋液將NMP22抗原稀釋成10IU/mL、20IU/mL、40IU/mL、80IU/mL四個(gè)濃度，測(cè)定其回收率在91.05％-106.8％之間。取高、中、低濃度(200IU/mL、100IU/mL、20IU/mL)三份NMP22抗原，用樣本稀釋液成50，25，10，測(cè)其回收率，回收率在92.45％-108.69％之間。

3)劑量-反應(yīng)曲線的線性

將NMP22抗原稀釋成一系列濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3所示，在120IU/mL時(shí)出現(xiàn)HOOK效應(yīng)。故該檢測(cè)試劑的線性范圍為5～100IU/mL。

4)精密度(CV％)

將NMP22抗原用7.5％BSA稀釋液成(20IU/mL、40IU/mL、80IU/mL)3個(gè)濃度。在一日內(nèi)每份樣本重復(fù)檢測(cè)20次，結(jié)果顯示批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為0.98-2.53％，在三個(gè)獨(dú)立日內(nèi)每份樣本檢測(cè)10次，結(jié)果顯示批間變異系數(shù)為2.55-5.42％。

實(shí)施例10 試劑盒尿液檢測(cè)cut-off值的建立

425例正常人樣本，用于測(cè)定正常參考范圍，年齡范圍20-75歲，平均年齡51.52±16.22歲。50例臨床患者尿液，臨床診斷為膀胱癌患者，年齡范圍27-70歲，平均年齡52.2±16.27歲；對(duì)照組50例，年齡20-60歲，平均年齡48.41±10.90歲。用試劑盒在Caris200上進(jìn)行檢測(cè)。采用百分位法結(jié)合ROC曲線法，設(shè)定cut-off值。結(jié)果檢測(cè)的最低值為0.52IU/mL，最高值為9.73IU/mL，平均濃度(Mean)為3.65IU/mL，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)1.563IU/mL。從表2-1、2-2及圖4結(jié)果可以看出，95％樣本的濃度值在5.93IU/mL以下，均值加2倍標(biāo)準(zhǔn)差等于6.776IU/mL，而當(dāng)濃度值在6.776IU/mL以下時(shí)，包含了97.6％的標(biāo)本。100例樣本結(jié)果繪制ROC曲線，從圖5可以得出取正確診斷指數(shù)＝靈敏度-(1-特異度)＝Sensitivity-(1-Specificity)，AUC＞0.996時(shí)其檢測(cè)濃度為5.83。綜合其他人的研究及臨床現(xiàn)行參考值，建議設(shè)定本試劑檢測(cè)時(shí)的NMP22尿液正常參考值范圍為0-6IU/mL。

表2-1正常人尿液樣本的年齡統(tǒng)計(jì)分析(n＝425)

表2-2正常人尿液NMP22水平檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析(n＝425)

實(shí)施例11 試劑盒臨床標(biāo)本檢測(cè)分析

100例臨床尿液檢測(cè)結(jié)果表3所示：50例膀胱癌患者尿液NMP22濃度為46.67±24.26IU/mL；50例對(duì)照尿液NMP22濃度為3.21±1.93IU/mL。膀胱癌患者尿液NMP22濃度明顯高于對(duì)照組P＝0.002＜0.05，有顯著差異。說明NMP22在膀胱癌方面特異性較高。

表3 100例尿液標(biāo)本NMP22含量統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點(diǎn)來看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。不應(yīng)將權(quán)利要求中的人和附圖標(biāo)記視為限制所涉及的權(quán)利要求。