本實用新型涉及避免準(zhǔn)確性受測試過程中濕氣影響的測試卡，屬于免疫層析領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

免疫層析是80年代初開始興起的一種快速診斷技術(shù)，其原理是將特異的抗原或抗體先固定于硝酸纖維素膜(NC膜)的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端加入樣品(如尿液或血清)后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗原或抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗體或抗原即與該抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)特異性的免疫診斷。常用的免疫層析技術(shù)使特定區(qū)帶顯色或帶有熒光，再通過顏色深淺或熒光強弱判斷待測樣品濃度。免疫層析技術(shù)的優(yōu)點在于結(jié)構(gòu)簡單，操作簡便、快速、結(jié)果判讀容易(肉眼觀測或簡單儀器測量)，越來越廣泛地應(yīng)用于臨場快檢或即時檢驗(POCT)領(lǐng)域。

目前大部分免疫層析產(chǎn)品主要基于膠體金技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)，其主要制備工藝是先在硝酸纖維素膜膜上制作檢測帶(T帶)和質(zhì)控帶(C帶)，再用顯色或發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記可以與待測物質(zhì)特異性結(jié)合的單抗，并固定于單抗墊上，然后與樣品墊、吸水紙組裝成試條，最后將試條放入卡盒進行組裝，形成測試卡。上述測試卡在使用時環(huán)境濕度有較嚴(yán)格的要求，一般使用濕度為20％～60％，盡管部分測試卡可以在相對濕度<80％的環(huán)境下進行檢測，但這類測試卡在原材料選擇上相對比較嚴(yán)格，需要挑選濕度穩(wěn)定性、一致性好的NC膜，不具備普遍性，且對于特殊高濕環(huán)境(例如島礁、熱帶雨林或其他高濕度封閉環(huán)境)適應(yīng)性差。本領(lǐng)域技術(shù)人員長期想獲得適用于寬范圍及特殊高濕環(huán)境的測試卡，但目前國內(nèi)外還未出現(xiàn)這種明顯具有市場優(yōu)勢的測試卡。

另一方面，在檢測目標(biāo)物質(zhì)的選擇上，人們也提出了更多需求。隨著現(xiàn)代社會生活節(jié)奏的加快，工作壓力的增大，個人健康相關(guān)的POCT監(jiān)測越來越受到重視。其中對高壓力人群以及特殊工作環(huán)境下人群情緒的監(jiān)測是一項新興的關(guān)注重點，相關(guān)檢測指標(biāo)為硝基酪氨酸。

硝基酪氨酸指標(biāo)與機體的應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。機體在受到有害刺激時，會產(chǎn)生氧化應(yīng)激和硝化應(yīng)激，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)上酪氨酸的硝基化，生成3-硝基酪氨酸。在生理pH條件下，蛋白質(zhì)上的硝基酪氨酸會引起周圍化學(xué)環(huán)境改變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化等，最終導(dǎo)致病理損傷。另有研究表明，II型糖尿病患者胰島分泌胰島素功能與硝基酪氨酸水平關(guān)系密切。蛋白質(zhì)酪氨酸硝基化不僅會引起胰島β細(xì)胞損傷，還能引起胰島素空間結(jié)構(gòu)變化而影響其功能。同時，硝基酪氨酸也可以為評價特殊環(huán)境工作者機體應(yīng)激狀態(tài)提供客觀依據(jù)。由此可見，對硝基酪氨酸的檢測具有重要意義。

目前針對硝基酪氨酸的檢測產(chǎn)品種類有限，方法主要基于ELISA試劑盒，由于其原理所限，存在如下明顯不足：

(1)檢測時間長，檢測過程包括包板、孵育、洗滌、顯色等一系列過程，全過程所需時間要數(shù)小時，不能滿足現(xiàn)場檢測及快速檢測的要求。

(2)所需配套儀器繁瑣，檢測過程中需要恒溫設(shè)備、酶標(biāo)板清洗設(shè)備以及熒光讀取設(shè)備以及相關(guān)配套耗材，如酶標(biāo)板、八連排樣品管等，整體設(shè)備和耗材消耗量較大。

現(xiàn)有技術(shù)針對上述缺點進行改進，嘗試用免疫層析平臺檢驗硝基酪氨酸。如CN104198699A公開了一種基于上轉(zhuǎn)換熒光材料的硝基酪氨酸定量試紙條，可以實現(xiàn)對硝基酪氨酸的定量快速檢測，但是上述上轉(zhuǎn)換熒光顆粒對于檢測設(shè)備要求相對較高，需要配套的遠(yuǎn)紅外激發(fā)光源，試條的適用性較窄，且該案公布的試條在使用時同樣對環(huán)境濕度有較嚴(yán)格的要求，在一些特殊環(huán)境(如高濕度)下適應(yīng)性差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本實用新型的主要目的在于提供避免準(zhǔn)確性受測試過程中濕氣影響的測試卡。

為實現(xiàn)上述目的，本實用新型提供避免準(zhǔn)確性受測試過程中濕氣影響的測試卡，所述測試卡包括試條及卡盒，所述卡盒設(shè)置檢查窗口，其中：在所述的檢測窗口上方覆蓋有用于隔絕環(huán)境濕氣的防潮薄層；所述防潮薄層為不透光材料薄層或透光材料薄層。

本實用新型未從本領(lǐng)域技術(shù)人員易想到的從試條材料的選擇等角度出發(fā)來解決測試結(jié)果的準(zhǔn)確性易受測試過程中環(huán)境的影響的技術(shù)問題，而是另辟途徑，采用簡單的在檢測窗口上方覆蓋防潮薄層的技術(shù)手段，有效避免了測試卡測試結(jié)果的準(zhǔn)確性受測試過程中濕氣的影響。本實用新型所述的測試卡，試條位于卡盒內(nèi)部，與環(huán)境只通過進樣口連通，形成相對封閉的體系。本實用新型實驗結(jié)果表明所述測試卡可應(yīng)用于濕度高達90％的高濕環(huán)境中，與不在所述的檢測窗口上方覆蓋有用于隔絕環(huán)境濕氣的防水薄層的測試卡相比，定量測試偏差大大減小，可應(yīng)用特殊的高濕度環(huán)境，例如島礁、熱帶雨林、或其他高濕度封閉環(huán)境。當(dāng)所述防水薄層為不透光材料時，移去所述防水薄層進行檢測；當(dāng)所述防水薄層為透光材料時，帶有所述防水薄層直接進行檢測。

根據(jù)本實用新型的具體實施方式，所述不透光材料薄層包括防水織物薄層、防水膠帶薄層、塑料片薄層或金屬片薄層。

根據(jù)本實用新型的具體實施方式，所述透光材料薄層包括透明塑料片薄層或防水光學(xué)薄膜。

根據(jù)本實用新型的具體實施方式，優(yōu)選地，所述防潮薄膜為防水光學(xué)薄膜。所述防水光學(xué)薄膜非常薄，透光性好，使檢測時激發(fā)光和發(fā)射光因折射或吸收產(chǎn)生的損失較小；此外，光學(xué)膜有一定柔性，與卡盒貼合緊密，密封性好。

根據(jù)本實用新型的具體實施方式，所述不透光材料薄層或所述透光材料薄層一面為帶膠面，帶膠面直接粘黏在所述檢測窗口上方。采用帶膠材料的薄層可直接將其粘貼在卡盒上即可，操作簡單，而無膠材料需要采取其他方式與卡盒連接。

根據(jù)本實用新型的具體實施方式，所述不透光材料薄層或所述透光材料薄層的厚度為0.1mm～4mm。

根據(jù)本實用新型的具體實施方式，所述測試卡的寬度為3～5cm。

根據(jù)本實用新型的具體實施方式，所述不透光材料薄層或透光材料薄層的形狀為矩形(長方形)、圓形、橢圓形、菱形或三角形。優(yōu)選地，所述不透光材料薄層或透光材料薄層為矩形。更優(yōu)選地，所述矩形的長×寬為1mm×1mm～50mm×50mm。

本實用新型所述測試卡可采用現(xiàn)有技術(shù)中的試條，通常地，按照被檢樣品流動的方向自上游至下游依次包括樣品墊、單抗墊、硝酸纖維膜及吸水墊。

本實用新型中所使用的材料均為現(xiàn)有材料，其可通過商購或按已知方法獲得。

本實用新型可按如下方法制作及應(yīng)用前述測試卡：以顯色或發(fā)光物質(zhì)標(biāo)記單抗，再將所得標(biāo)記單抗噴涂于單抗墊上，然后與帶有檢測帶(T帶)和質(zhì)控帶(C帶)的硝酸纖維素膜(NC膜)、樣品墊、吸水墊一起組裝成試條并剪切；最后在卡盒的檢測窗口區(qū)域上覆蓋防水薄層，再將剪切好的試條裝入卡盒進行組裝，得到測試卡。測試卡使用時先帶薄層一起加樣、層析，檢測時可以揭掉薄層后進行檢測，或帶薄層一起測試。

本實用新型所述測試卡可適用于硝基酪氨酸指標(biāo)的檢測，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉該測試卡亦可適用于其他指標(biāo)的檢測。

綜上可知，本實用新型提供的測試卡可以用于基于免疫層析的定性和定量檢測，通過在測試卡卡盒的檢測窗口區(qū)域加防水的薄層結(jié)構(gòu)，可以避免測試卡受環(huán)境濕度影響，提高了測試卡檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和一致性，同時擴大了測試卡對于環(huán)境的適用范圍，特別適合高濕度環(huán)境下的測量。同時本實用新型所公開的方法制作簡便，易于操作，有利于推廣。

附圖說明

圖1為實施例1、2測試卡示意圖，其中上圖為俯視圖，下圖為側(cè)面圖；

圖2為實施例1、2試條結(jié)構(gòu)示意圖；

圖中標(biāo)號具有如下意義：

1：卡盒；2：檢測窗口；3：防潮薄層；4：進樣口；5：吸水墊；6：NC膜；7：C線；8：T線；9：熒光單抗墊；10：樣品墊。

具體實施方式

為了對本實用新型的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，現(xiàn)結(jié)合具體實施例及附圖對本實用新型的技術(shù)方案進行以下詳細(xì)說明，應(yīng)理解這些實例僅用于說明本實用新型而不用于限制本實用新型的范圍。實施例中，各原始試劑材料均可商購獲得，未注明具體條件的實驗方法為所屬領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法和常規(guī)條件，或按照儀器制造商所建議的條件。

實施例1

1)測試卡的制備

取1mg/ml硝基酪氨酸抗原的PBS溶液及1mg/ml羊抗小鼠IgG的PBS溶液，通過劃線儀在NC膜上制作T線和C線，劃線量均為50μl/300mm。劃線后NC膜置于37℃烘箱中干燥過夜。

取硝基酪氨酸單抗的PBS溶液30μl，及熒光微球溶液50μl，混合均勻后加入NHS/EDC混合液，NHS終濃度為5mM，EDC終濃度為20mM，熒光微球與單抗摩爾比為1:100，室溫反應(yīng)1小時后10000rpm離心15分鐘×3次，沉淀用PBS溶液復(fù)溶至單抗?jié)舛葹?.5mg/ml。將所得熒光標(biāo)記單抗通過噴金儀在單抗墊上噴涂，噴液量為100μl/300mm。噴液后將單抗墊置于干燥柜中干燥4小時。

取出上述NC膜、單抗墊加吸水墊和樣品墊組裝成試條，通過切條機制作成寬度為4mm的試條，加干燥劑分裝待用。

取塑料卡盒，先在卡盒的檢測窗口部分人工粘貼，再將上述剪切好的試條放入卡盒進行組裝，得到測試用的測試卡。

所得測試卡的示意圖如圖1所示，其中上圖為俯視圖，下圖為側(cè)面圖；從圖1中可以看出，所述測試卡包括試條及卡盒1，所述卡盒設(shè)置檢測窗口2，在所述的檢測窗口2上方覆蓋有用于隔絕環(huán)境濕氣的防潮薄層3；本實施例防潮薄層為透明膠帶薄層，厚度為0.1～0.3mm，形狀為長方形，該形狀的大小為13mm×40mm，卡盒上還設(shè)有進樣口4。所得試條的結(jié)構(gòu)示意圖如圖2所示，從圖2中可以看出，按樣品流動的方向，自上游至下游依次包括樣品墊10、熒光單抗墊9、NC膜6、吸水墊5，NC膜上設(shè)有C線7及T線8。

2)測試卡的檢測

取分別含有硝基酪氨酸500、1000、2000ng/ml的質(zhì)控液(人工尿液)，從卡盒的加樣口加入，每張測試卡滴加75μl，靜置9分鐘后揭掉檢測窗口上的透明膠帶，用檢測儀器分別檢測T線和C線熒光強度。每個濃度測試3張試條，統(tǒng)計(|T|+|C|)/|T|值的平均值，對質(zhì)控液濃度作圖并線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回推出每個質(zhì)控液的回推濃度，并計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)。分別在相對濕度50％、60％、70％、80％和90％的環(huán)境下重復(fù)上述過程，均以50％相對濕度下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回推其他濕度下的檢測結(jié)果，對比濕度對檢測結(jié)果的影響。

同時準(zhǔn)備無薄層結(jié)構(gòu)的卡盒對同一批剪切好的試條進行組裝和測試，測試過程同上所述，對比有無薄層的差異。

3)測試結(jié)果

檢測結(jié)果如表1所示：

表1不同濕度下有無防水薄層的測試卡(|T|+|C|)/|T|及與50％相對濕度下的偏差

由表1可見，以50％相對濕度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線回推，有透明膠帶的試條在不同濕度下的回推濃度偏差不超過13％；而無透明膠帶的試條在不同濕度下的回推濃度偏差接近40％，且濕度越大，回推濃度越低。上述結(jié)果說明在卡盒檢測窗口上覆蓋防水薄層后，可以有效隔絕試條與環(huán)境中的水汽，(刪除對原因的解釋)，使測試卡在高濕度環(huán)境下保持檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

實施例2

1)測試卡的制備

取0.1mg/ml硝基酪氨酸抗原的PBS溶液及0.1mg/ml羊抗小鼠IgG的PBS溶液，通過劃線儀在NC膜上制作T線和C線，劃線量均為50μl/300mm。劃線后NC膜置于37℃烘箱中干燥過夜。

取硝基酪氨酸單抗的PBS溶液30μl，及熒光微球溶液50μl，混合均勻后加入NHS/EDC混合液，NHS終濃度為5mM，EDC終濃度為20mM，熒光微球與單抗摩爾比為1:1，室溫反應(yīng)1小時后10000rpm離心15分鐘×3次，沉淀用PBS溶液復(fù)溶至單抗?jié)舛葹?mg/ml。將所得熒光標(biāo)記單抗通過噴金儀在單抗墊上噴涂，噴液量為100μl/300mm。噴液后將單抗墊置于干燥柜中干燥4小時。

取出上述NC膜、單抗墊加吸水墊和樣品墊組裝成試條，通過切條機制作成寬度為4mm的試條，加干燥劑分裝待用。

取塑料卡盒，先在卡盒的檢測窗口部分人工粘貼帶有壓敏膠的光學(xué)薄膜，再將上述剪切好的試條放入卡盒進行組裝，得到測試用的測試卡。所得測試卡的防潮薄層為帶有壓敏膠的光學(xué)薄膜，厚度為0.1～0.3mm，形狀為長方形，該形狀的大小為13mm×40mm，結(jié)構(gòu)示意圖如圖1及圖2所示。

2)測試卡的檢測

取分別含有硝基酪氨酸500、1000、2000ng/mL的質(zhì)控液(人工尿液)，從卡盒的加樣口加入，每張測試卡滴加75μL，靜置9分鐘后不揭掉檢測窗口上的光學(xué)膜，用檢測儀器分別檢測T線和C線熒光強度。每個濃度測試3張試條，統(tǒng)計(T+C)/T值的平均值，對質(zhì)控液濃度作圖并線性擬合，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線回推出每個質(zhì)控液的回推濃度，并計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)。分別在相對濕度20％、40％、60％和80％環(huán)境下重復(fù)上述過程，均以20％相對濕度下所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回推其他濕度下的檢測結(jié)果，對比濕度對檢測結(jié)果的影響。

3)測試結(jié)果

測試結(jié)果如表2所示，其為以20％相對濕度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線回推，帶有光學(xué)薄膜的試條在不同濕度下的回推濃度偏差<15％。

表2不同濕度下有光學(xué)膜的測試卡檢測結(jié)果

最后說明的是：以上實施例僅用于說明本實用新型的實施過程和特點，而非限制本實用新型的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本實用新型進行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對本實用新型進行修改或者等同替換，而不脫離本實用新型的精神和范圍的任何修改或局部替換，均應(yīng)涵蓋在本實用新型的保護范圍當(dāng)中。