本實(shí)用新型涉及生物化學(xué)及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種定量檢測試劑盒，適用于各種DNA的定量檢測。
背景技術(shù)：
：在分子生物學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行DNA分析時常常需要對DNA進(jìn)行準(zhǔn)確定量。在臨床診斷方面，病毒DNA的定量檢測是臨床診斷的重要依據(jù)。SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料。在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)。因此，SYBRGreenI的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根據(jù)熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBRGreenI的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。SYBRGreenI核酸凝膠染液是一種高敏感性的熒光染液，可用于檢測瓊脂糖凝膠及聚丙烯酰胺凝膠中的雙鏈DNA和寡核苷酸。當(dāng)染液與核酸結(jié)合后，SYBRGreenI核酸凝膠染液的熒光信號會明顯增強(qiáng)，因此經(jīng)SYBRGreenI核酸凝膠染液染色的凝膠顯示出非常好的性價比，沒有背景熒光。目前，常規(guī)利用SYBRGreenI熒光染料檢測DNA含量的方法存在以下方面的不足：1、PCR擴(kuò)增過程中SYBRGreenI熒光染料與DNA結(jié)合的方法存在非特異性擴(kuò)增導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確的風(fēng)險；2、SYBRGreenI熒光染料直接作用于樣本存在對樣本含量、檢測儀器靈敏度要求高的問題，檢測成本較高，而且樣本中其他雜質(zhì)也會對檢測結(jié)果造成一定影響，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對以上現(xiàn)有技術(shù)問題，本實(shí)用新型的目的在于提供一種定量檢測試劑盒，排出了樣本中其他雜質(zhì)和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對最終檢測結(jié)果的影響，更準(zhǔn)確、低成本的完成DNA含量的定量檢測，包括以下步驟：粗濾；瓊脂糖凝膠電泳；DNA回收；SYBRGreenI熒光染色；檢測及結(jié)果分析。該方法利用簡化的DNA回收方法得到高純度的DNA，再通過SYBRGreenI染色和紫外分光光度計(jì)檢測熒光，計(jì)算分析得到DNA濃度。具體技術(shù)方案如下：一種定量檢測試劑盒，包括盒體，支架，第一EP管以及第二EP管，其中，所述盒體內(nèi)設(shè)置支架；所述支架上設(shè)有4-6個管架；所述第一EP管設(shè)置于第一管架上，所述第一EP管底部設(shè)有鉆孔，管內(nèi)設(shè)有定性濾紙；所述第二EP管設(shè)置于第二管架上，所述第二EP管底部設(shè)有鉆孔，管內(nèi)設(shè)有定性濾紙；所述第一EP管為0.5ml或1.5ml容量的EP管，所述第二EP管為0.5ml或1.5ml容量的EP管。還包括盒蓋，所述盒蓋一側(cè)連接至盒體并用于扣合盒體。還包括第三EP管，第四EP管，第五EP管以及第六EP管，分別設(shè)置于支架的第三管架，第四管架，第五管架以及第六管架上。上述定量檢測DNA含量的SYBRGreenI定量檢測試劑盒的檢測方法，包括如下步驟：(1)粗濾；(2)瓊脂糖凝膠電泳；(3)DNA回收；(4)SYBRGreenI熒光染色；(5)檢測；(6)結(jié)果分析。進(jìn)一步地，步驟(1)中包括：(1-1)取待測樣品放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；(1-2)將套好的EP管離心，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體全部進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。進(jìn)一步地，步驟(2)中包括：(2-1)配膠；(2-2)電泳準(zhǔn)備；(2-3)上樣；(2-4)電泳。進(jìn)一步地，步驟(3)中包括：(3-1)將切下來的含目的DNA的膠塊切碎，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；(3-2)將套好的EP管離心，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體定容；(3-3)加入NaAc和無水乙醇，冷凍；沉淀干燥后溶于TE溶液。進(jìn)一步地，步驟(4)中包括：(4-1)加入與DNA復(fù)溶液等體積的稀釋好的SYBRGreenI工作液，混勻；(4-2)放置30分鐘左右。進(jìn)一步地，步驟(5)中包括：(5-1)將染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度計(jì)上，260nm波長處分別讀取熒光值A(chǔ)260；(5-2)根據(jù)WdsDNA＝A260×50μg/ml公式換算待測樣品中目的DNA含量。進(jìn)一步地，(2-1)配膠：根據(jù)基因組片段大小，配置相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠；取適量的瓊脂和TAE緩沖液至錐形瓶中，搖勻并用錫紙封口，放入微波爐煮，煮好的凝膠應(yīng)無氣泡、色澤均勻；將煮好的凝膠放入65℃的水浴鍋中，待凝膠冷卻至65℃時，加入適量的SYBRGreenI熒光染料，及時將凝膠倒入裝好的干凈電泳模具中；待凝膠完全凝固后，小心的將梳子拔出；(2-2)電泳準(zhǔn)備：把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央，膠孔的方向朝向負(fù)極，往電泳槽中倒入一定量的TAE緩沖液至剛好將凝膠淹沒；(2-3)上樣：將樣品、6×溴酚藍(lán)按5：1的比例混勻，輕甩后按照規(guī)定的順序上樣；(2-4)電泳：上樣后，蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽，設(shè)置電泳參數(shù)：120V30min。本實(shí)用新型方法操作簡便、成本低廉、準(zhǔn)確度高。附圖說明圖1為已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管示意圖圖2為套入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5mlEP的1.5ml的EP管示意圖圖3為定量檢測DNA含量的SYBRGreenI定量檢測試劑盒具體實(shí)施方式下面根據(jù)附圖對本實(shí)用新型進(jìn)行詳細(xì)描述，其為本實(shí)用新型多種實(shí)施方式中的一種優(yōu)選實(shí)施例。在一個優(yōu)選實(shí)施例中，一種定量檢測DNA含量的SYBRGreenI定量檢測試劑盒及其檢測方法，進(jìn)一步地包括以下步驟：(1)粗濾：①取待測樣品100μl，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；②將套好的EP管在4℃10000rpm下離心10min，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體全部進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；(2)瓊脂糖凝膠電泳：①配膠：根據(jù)基因組片段大小，配置相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠。取適量的瓊脂和TAE緩沖液至錐形瓶中，搖勻并用錫紙封口，放入微波爐煮，煮好的凝膠應(yīng)無氣泡、色澤均勻。將煮好的凝膠放入65℃的水浴鍋中，待凝膠冷卻至65℃時，加入適量的SYBRGreenI熒光染料，及時將凝膠倒入裝好的干凈電泳模具中。待凝膠完全凝固后，小心的將梳子拔出；②電泳準(zhǔn)備：把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央，膠孔的方向朝向負(fù)極，往電泳槽中倒入一定量的TAE緩沖液至剛好將凝膠淹沒；③上樣：將樣品、6×溴酚藍(lán)按5：1的比例混勻，輕甩后按照規(guī)定的順序上樣；④電泳：上樣后，蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽，設(shè)置電泳參數(shù)：120V30min；(3)DNA回收：①將切下來的含目的DNA的膠塊切碎，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；②將套好的EP管在4℃10000rpm下離心10min，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體用移液槍定容；③加入1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.5)和2倍體積的無水乙醇，在-20℃冷凍30min以上。沉淀干燥后溶于20μlTE溶液(pH7.8)。(4)SYBRGreenI熒光染色：①加入與DNA復(fù)溶液等體積的稀釋好的SYBRGreenI工作液(稀釋比例根據(jù)SYBRGreenI的說明書)，混勻；②放置30分鐘。(5)檢測及結(jié)果分析：①將染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度計(jì)上，260nm波長處分別讀取熒光值A(chǔ)260；②根據(jù)WdsDNA＝A260×50μg/ml公式換算待測樣品中目的DNA含量。粗濾步驟①取待測樣品100μl，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；DNA回收步驟①將切下來的含目的DNA的膠塊切碎，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；DNA回收步驟②將套好的EP管在4℃10000rpm下離心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體用移液槍定容；DNA回收步驟③加入1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.5)和2倍體積的無水乙醇，在-20℃冷凍30min以上。沉淀干燥后溶于20μlTE溶液(pH7.8)。在另一個優(yōu)選實(shí)施例中，一種SYBRGreenI熒光染料定量檢測DNA含量的方法，通過粗濾、瓊脂糖凝膠電泳、DNA回收、SYBRGreenI熒光染色、檢測及結(jié)果分析完成待測樣品DNA的定量檢測，具體包括以下步驟：1、粗濾：(1)取待測樣品100μl，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；(2)將套好的EP管在4℃10000rpm下離心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體全部進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；2、瓊脂糖凝膠電泳：(1)配膠：根據(jù)基因組片段大小，配置相應(yīng)濃度的瓊脂糖凝膠。取適量的瓊脂和TAE緩沖液至錐形瓶中，搖勻并用錫紙封口，放入微波爐煮，煮好的凝膠應(yīng)無氣泡、色澤均勻。將煮好的凝膠放入65℃的水浴鍋中，待凝膠冷卻至65℃時，加入適量的SYBRGreenI熒光染料，及時將凝膠倒入裝好的干凈電泳模具中。待凝膠完全凝固后，小心的將梳子拔出；(2)電泳準(zhǔn)備：把凝膠連同膠托一起放入電泳槽正中央，膠孔的方向朝向負(fù)極，往電泳槽中倒入一定量的TAE緩沖液至剛好將凝膠淹沒；(3)上樣：將樣品、6×溴酚藍(lán)按5：1的比例混勻，輕甩后按照規(guī)定的順序上樣；(4)電泳：上樣后，蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽，設(shè)置電泳參數(shù)：120V30min；3、DNA回收：(1)將切下來的含目的DNA的膠塊切碎，放入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管中，再將這個0.5ml的EP管套入一個1.5ml的EP管中；(2)將套好的EP管在4℃10000rpm下離心5～10min，去掉0.5ml的EP管，并將1.5ml的EP管得到液體用移液槍定容；(3)加入1/10體積的3mol/LNaAc(pH5.5)和2倍體積的無水乙醇，在-20℃冷凍30min以上。沉淀干燥后溶于20μlTE溶液(pH7.8)。4、SYBRGreenI熒光染色：(1)加入與DNA復(fù)溶液等體積的稀釋好的SYBRGreenI工作液(稀釋比例根據(jù)SYBRGreenI的說明書)，混勻；(2)放置30分鐘。5、檢測及結(jié)果分析：(1)將染色好的DNA溶液放置到紫外分光光度計(jì)上，260nm波長處分別讀取熒光值A(chǔ)260；(2)根據(jù)WdsDNA＝A260×50μg/ml公式換算待測樣品中目的DNA含量。應(yīng)用本實(shí)用新型檢測待測樣品A中基因片段長度約1kb的DNA含量，同時設(shè)定一組已知DNA濃度(30ng/μl)的標(biāo)準(zhǔn)對照，經(jīng)過粗濾和瓊脂糖凝膠電泳，再經(jīng)過DNA回收、SYBRGreenI熒光染色和檢測及結(jié)果分析，測得結(jié)果如表2：樣本名稱A260DNA含量待測樣品A0.0170.85ng/μl標(biāo)準(zhǔn)對照0.59829.9ng/μl表2如圖1所示，該EP管包含已在底部鉆好孔的0.5ml的EP21和定性濾紙22。如圖2所示，該EP管包含已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管31和1.5ml的EP管32。如圖3所示，該試劑盒包括圖1所示的已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5ml的EP管41和圖2所示的套入已在底部鉆好孔并放入小塊定性濾紙的0.5mlEP的1.5ml的EP管42。當(dāng)前第1頁1 2 3