本實(shí)用新型涉及微流控技術(shù)和免疫熒光微球免疫層析技術(shù)相結(jié)合的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種定量檢測(cè)卡。

背景技術(shù)：

17α-羥孕酮(17α-OH-Progesterone，17α-OHP)是腎上腺糖皮質(zhì)激素及性類(lèi)固醇合成過(guò)程中產(chǎn)生的一種內(nèi)源性孕激素，新生兒期主要來(lái)源于腎上腺皮質(zhì)。在膽固醇代謝途徑中，17α-OHP在21-羥化酶的催化下轉(zhuǎn)變?yōu)?1-脫氧皮質(zhì)醇，最終生成皮質(zhì)醇。21-羥化酶由CPY21A2編碼，是位于腎上腺皮質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種細(xì)胞色素酶。21-羥化酶缺陷使阻礙皮質(zhì)醇的合成，經(jīng)負(fù)反饋?zhàn)饔么偈勾倌I上腺皮質(zhì)激素增加，導(dǎo)致腎上腺皮質(zhì)增生，產(chǎn)生過(guò)量的皮質(zhì)醇前體，這些前體的堆積和異常代謝可產(chǎn)生一系列的臨床癥狀。CAH是一組腎上腺皮質(zhì)激素合成過(guò)程中某種酶先天性缺陷所引起的常染色體隱性遺傳疾病。臨床上可出現(xiàn)腎上腺皮質(zhì)功能減退癥狀，受累女性新生兒可有外生殖器男性化體征，男性則出現(xiàn)假性性早熟；并發(fā)的醛固酮缺失可引起發(fā)育停滯、血容量減少及新生兒腎上腺危象、休克為特征的失鹽癥狀，嚴(yán)重者甚至危及生命。若早期開(kāi)展CAH篩查，可降低新生兒死亡率；預(yù)防過(guò)多雄性激素造成的身材矮小和女性患兒外生殖器男性化造成的性別誤判所致的心理、生理發(fā)育障礙。

人促黃體生成素(human luteinizing hormone，hLH)是垂體前葉嗜堿性細(xì)胞所分泌的激素，為一種糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量約為30 000。hLH分子由兩條非共價(jià)連接的不同肽鏈(α和β)組成，α鏈與人促甲狀腺激素(TSH)、人促卵泡激素(FSH)及人絨毛膜促性腺激素(hCG)相似，但β鏈的氨基酸順序和組成不同，使其具有特異性，決定hLH的生物活性。在有卵泡刺激素存在下，與其協(xié)同作用，刺激卵巢雌激素分泌，使卵泡成熟與排卵，使破裂卵泡形成黃體并分泌雌激素和孕激素；對(duì)于男性主要是促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞增生，促進(jìn)睪酮的合成與分泌。在健康月經(jīng)周期女性中，hLH濃度變化受排卵周期的影響，因此測(cè)定血清中hLH濃度可以預(yù)測(cè)女性排卵狀況。此外，hLH的濃度變化和體內(nèi)很多疾病的發(fā)生也有直接的聯(lián)系，定量檢測(cè)出血清中hLH的濃度對(duì)臨床疾病的診斷有重要意義。

人促卵泡激素(human follicle-stimulating hormone,hFSH)由垂體前葉分泌,為單鏈多肽激素。hFSH的增高多見(jiàn)于原發(fā)性睪丸衰竭、睪丸精原細(xì)胞瘤、先天性睪丸發(fā)育不全、先天性卵巢發(fā)育不全、原發(fā)性閉經(jīng)、原發(fā)性性腺功能低下、更年期綜合征；其降低常見(jiàn)于女性不孕癥，長(zhǎng)期服用避孕藥，大量應(yīng)用性激素等。因此定量檢測(cè)血清中hFSH的濃度對(duì)臨床疾病的診斷有重要意義。

微流控技術(shù)(Microfludics)是指在至少有一維為微米甚至納米尺度的低維通道結(jié)構(gòu)中控制體積為皮升至納升的流體進(jìn)行流動(dòng)并傳質(zhì)、傳熱的技術(shù)。實(shí)現(xiàn)微流控操控的主要方法就是將流體限制在一個(gè)微米甚至納米尺度的通道中，流體在微流控的微通道中具有獨(dú)特的流體性質(zhì)，如層流、液滴等等。當(dāng)微通道在微米甚至納米尺度時(shí)，微通道表面積與其內(nèi)部體積比很大，通道的結(jié)構(gòu)、形狀和壁面性質(zhì)都對(duì)流體的流動(dòng)狀態(tài)產(chǎn)生極大影響。因此，微流控可以實(shí)現(xiàn)一系列常規(guī)方法難以完成的微加工和微操作。時(shí)間閥的作用就是在固定的時(shí)間內(nèi)控制通過(guò)微通道的流體的流速和流量，可以嚴(yán)格控制整個(gè)反應(yīng)的時(shí)間并且控制進(jìn)入檢測(cè)區(qū)的流體的量。

熒光微球是指將熒光團(tuán)通過(guò)包埋、共價(jià)鍵連接等方式引入有機(jī)或無(wú)機(jī)納米粒子中，并讓納米粒子承擔(dān)有機(jī)小分子熒光染料的檢測(cè)、標(biāo)記等功能，具有相對(duì)穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及發(fā)光行為。熒光微球免疫層析技術(shù)是繼膠體金免疫層析技術(shù)后，在熒光染料標(biāo)記技術(shù)上發(fā)展起來(lái)的，作為一種免疫學(xué)檢測(cè)方法，它是免疫親和技術(shù)、免疫標(biāo)記技術(shù)、免疫層析技術(shù)的結(jié)合，與膠體金免疫層析技術(shù)一樣具有快速、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)

目前檢測(cè)17α-羥孕酮、hLH和hFSH的進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)試劑，其采用的檢測(cè)方法多為時(shí)間分辨免疫熒光法、ELISA法和化學(xué)發(fā)光法，時(shí)間分辨免疫熒光法是一種基于以鑭系稀土離子作為標(biāo)記物來(lái)標(biāo)記抗原或抗體的高靈敏度定量免疫檢測(cè)技術(shù)，鑭系稀土離子價(jià)格昂貴，制作成本高，產(chǎn)生的污染大。ELISA法采用蛋白包被反應(yīng)板，加待測(cè)標(biāo)本及酶標(biāo)二抗底物顯色，陽(yáng)性顯色，此方法操作復(fù)雜，且影響因素較多，檢測(cè)結(jié)果易受外界因素的干擾。電化學(xué)發(fā)光法直接用發(fā)光物質(zhì)稀土元素釕標(biāo)記抗原和抗體，用鏈霉親和素包被的磁顆粒作結(jié)合/游離(B/F)分離，利用電極板上的氧化還原反應(yīng)在電極上施加電壓產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光光譜來(lái)進(jìn)行分析測(cè)定。但是，目前國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到用電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定過(guò)人性激素的正常參考值的報(bào)道，國(guó)外參考值范圍太大，對(duì)臨床應(yīng)用缺乏指導(dǎo)意義。這幾種方法均是定性或者半定量的檢測(cè)方法，無(wú)法檢測(cè)到血液或者尿液中17α-羥孕酮、hLH和hFSH的含量水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)問(wèn)題，本實(shí)用新型的目的在于提供一種定量檢測(cè)卡，靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、攜帶方便且制備成本低，可定量檢測(cè)17α-羥孕酮抗體、促黃體生成激素和促卵泡生成激素檢測(cè)卡及其制備方法。本實(shí)用新型使用的熒光微球基本不受外界環(huán)境介質(zhì)變化的影響，穩(wěn)定性好，染料熒光猝滅大大減少。同時(shí)檢測(cè)抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素的定量檢測(cè)卡由底卡和面卡組成。底卡上依次覆蓋濾紙的加樣區(qū)、噴涂熒光微球標(biāo)記的抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體的結(jié)合區(qū)、微通道、時(shí)間閥、包被抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素并且具有微通道的檢測(cè)區(qū)、廢液區(qū)。面卡預(yù)留加樣孔和檢測(cè)孔，加樣孔的位置底卡加樣區(qū)對(duì)應(yīng)，觀察孔的位置與底卡檢測(cè)區(qū)對(duì)應(yīng)。具體技術(shù)方案如下：

一種定量檢測(cè)卡，包括底卡和面卡，其中，所述底卡上設(shè)有加樣區(qū)，結(jié)合區(qū)，微通道，時(shí)間閥，檢測(cè)區(qū)以及廢液區(qū)，所述加樣區(qū)連接結(jié)合區(qū)且加樣區(qū)與結(jié)合區(qū)位于微通道的一端，所述檢測(cè)區(qū)通過(guò)時(shí)間閥連接微通道的另一端；所述面卡上設(shè)有加樣孔和觀察孔，加樣孔的位置與底卡加樣區(qū)對(duì)應(yīng)，觀察孔的位置與底卡檢測(cè)區(qū)對(duì)應(yīng)，所述底卡和面卡的背面扣合連接。

進(jìn)一步地，所述加樣區(qū)覆蓋濾紙。

進(jìn)一步地，所述濾紙為圓形。

進(jìn)一步地，所述結(jié)合區(qū)和時(shí)間閥分別設(shè)置于微通道的兩端并直接連接至并聯(lián)微通道。

進(jìn)一步地，所述廢液區(qū)連接至結(jié)合區(qū)和/或微通道。

進(jìn)一步地，所述微通道包括第一微通道和第二微通道，所述第一微通道連接時(shí)間閥，所述第二微通道連接廢液區(qū)。

進(jìn)一步地，所述圓形濾紙直徑1.5-2.0cm、孔徑為1-3μm。

進(jìn)一步地，所述第一微通道孔徑為5μm，所述第二微通道孔徑10μm。

進(jìn)一步地，所述時(shí)間閥的孔徑為3μm。

進(jìn)一步地，所述檢測(cè)區(qū)包括依次排列的第一檢測(cè)區(qū)，第二檢測(cè)區(qū)以及第三檢測(cè)區(qū)。

上述定量檢測(cè)卡的制備方法，包括如下步驟：

(1)底卡的制備：

(1-1)制圖；

(1-2)掩模；

(1-3)光刻；

(1-4)再鑄模；

(1-5)軟光刻；

(2)抗17α-羥孕酮抗體、抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體的制備；

(3)熒光微球的制備與標(biāo)記抗體；

(4)噴涂熒光微球標(biāo)記的抗17α-羥孕酮抗體、抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體；

(5)抗17α-羥孕酮抗體、抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體的包被；

(6)濾紙覆蓋加樣區(qū)：

(7)抗17α-羥孕酮抗體、抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體定量檢測(cè)卡的制備。

進(jìn)一步地，步驟(1)中包括：(1-1)制圖：微通道圖形按照設(shè)計(jì)通過(guò)繪圖軟件繪制掩膜版圖；(1-2)掩模：制成掩膜版圖后，打印在透明膠片上制得光刻掩膜板,利用此掩膜板通過(guò)光刻工藝制作硅片模具；(1-3)光刻：在基片表面鍍上一層阻擋層,再用甩膠機(jī)在阻擋層上均勻地甩上一層光敏材料-光刻膠；在光掩模上制備所需的通道圖案；將光掩模復(fù)蓋在基片上，用紫外光照射涂有光刻膠的基片,光刻膠發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)；用光刻膠配套顯影液通過(guò)顯影的化學(xué)方法除去經(jīng)曝光的光刻膠；烘干后,利用未曝光的光刻膠的保護(hù)作用,采用化學(xué)腐蝕的方法在阻擋層上精確腐蝕出底片上平面二維圖形，制成所需硅片模具；(1-4)再鑄模：通過(guò)將彈性材料涂于光刻形成的硅片模具表面,干燥后取下則硅片模具表面上圖形轉(zhuǎn)移到彈性材料上形成印模；(1-5)軟光刻：將PDMS前聚體與固化劑按10:1比例混合，攪拌混勻后，置于真空箱內(nèi)脫除氣泡，然后在印模上澆注，PDMS前聚體在印模上完全攤平后，將其連同印模一起放入烘箱內(nèi)進(jìn)行固化，置于80℃烘箱固化約48小時(shí)，之后將PDMS基片從印模上剝離下來(lái)；和/或，

步驟(2)中，用17α-羥孕酮作為免疫原注入小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150μg/只，使其產(chǎn)生抗血清；取產(chǎn)生特異性抗體的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔；利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆，得到并建立產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存；復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)；采用體內(nèi)誘生法，將小鼠腹腔注入滅菌石蠟油，7-14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7-10天后采集腹水；經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，純度經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，小瓶分裝，-20℃保存；和/或，

步驟(3)中，無(wú)皂液法制備熒光微球：稱(chēng)取0.009g過(guò)硫酸鉀，0.004gNaHCO₃溶于7ml去離子水，將1mg熒光染料溶于2ml無(wú)水乙醇及1ml苯乙烯，加入到水溶液中，搖勻，通氮?dú)?min，放入70℃恒溫水浴震蕩24h，取出，離心分離出的聚合物分別再用乙醇、去離子水離心洗滌3次，即得到熒光染料標(biāo)記的聚苯乙烯熒光微球；得到的熒光微球直徑為50-100nm；

將1mg包裹熒光染料的熒光微球在1000rpm×15min，收集沉淀，用0.01M pH4.8的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為OD₄₅₀＝0.2；然后加入90μL50mg/mL對(duì)乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)，150μL5mg/mL氮經(jīng)基唬拍酞亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育10-30min后，離心，沉淀再用0.01M pH4.8的硼酸鹽緩沖液溶解，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD₄₅₀＝0.2；將0.1mL熒光微球中加入1-10μL17α-羥孕酮單抗，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M pH7.2的PBS溶液復(fù)溶沉淀至起始體積后，即為制備好的熒光標(biāo)記的抗17α-羥孕酮抗體；和/或，

步驟(4)中，用噴金機(jī)將熒光微球標(biāo)記的抗17α-羥孕酮抗體、抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體按照5-10μl的體積均勻噴涂在結(jié)合區(qū)上三個(gè)固定的位置，30℃真空干燥12h，放于室溫環(huán)境中備用；和/或，

步驟(5)中，用0.01M PBS緩沖液調(diào)節(jié)抗體濃度為0.5mg/ml，將包被后的溶液按照1-3μl的體積均勻噴涂在檢測(cè)區(qū)上三個(gè)固定的位置，A為抗17α-羥孕酮抗體、B為抗黃體生成激素抗體、C為抗促卵泡生成激素抗體，30℃真空干燥12h，放于室溫環(huán)境中備用；和/或，

步驟(6)中，將直徑1.5-2.0cm、孔徑為1-3μm的圓形濾紙覆蓋在加樣區(qū)；和/或，

步驟(7)中，將面卡和制備號(hào)的底卡合在一起，壓緊。

上述定量檢測(cè)卡的檢測(cè)方法，包括如下步驟：

a.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將血清標(biāo)準(zhǔn)品配制成5個(gè)以上的一系列濃度，用同一批次的數(shù)張檢測(cè)卡檢測(cè)各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以檢測(cè)線的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，血清標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并將標(biāo)準(zhǔn)曲線保存在多色熒光分析儀中；

b.樣品檢測(cè)：平放檢測(cè)卡，待測(cè)血清平衡至室溫后，用已滅菌的膠頭滴管吸取一定量血清加入加樣孔中，立即將檢測(cè)卡放入多色熒光檢測(cè)儀中，記錄熒光微球在最佳激發(fā)光源的激發(fā)下所發(fā)出的熒光值；

c.將所得數(shù)值代入已保存在多色熒光分析儀中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式計(jì)算得到樣本中待測(cè)物的濃度。

與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型通過(guò)微流控技術(shù)控制待測(cè)樣品的流速和流量，從而減少誤差，增加反應(yīng)靈敏度；本實(shí)用新型利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間抗體變化，再根據(jù)變化曲線換算待測(cè)樣品中抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素的濃度，達(dá)到定量檢測(cè)的水平；本實(shí)用新型操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單，易推廣使用。具體來(lái)說(shuō)：

(1)通過(guò)微流控技術(shù)和時(shí)間閥控制待測(cè)樣品的流速和流量，從而減少誤差，增加反應(yīng)靈敏度；

(2)利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間抗體變化，再根據(jù)變化曲線換算待測(cè)樣品中抗17α-羥孕酮抗體的濃度、抗促黃體生成激素抗體的濃度和抗促卵泡生成激素抗體的濃度，達(dá)到定量檢測(cè)的水平；

(3)熒光微球表面包裹了聚苯乙烯，實(shí)現(xiàn)了對(duì)熒光物質(zhì)的保護(hù)，減少了外界環(huán)境的干擾，熒光微球的穩(wěn)定性增強(qiáng)；

(4)本實(shí)用新型操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間精確、儲(chǔ)存簡(jiǎn)單。非專(zhuān)業(yè)人士均可操作，因而適用范圍廣，易推廣使用。

附圖說(shuō)明

圖1是一種同時(shí)檢測(cè)抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素的定量檢測(cè)卡的底卡結(jié)構(gòu)示意圖

圖2是一種同時(shí)檢測(cè)抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素的定量檢測(cè)卡的面卡結(jié)構(gòu)示意圖

具體實(shí)施方式

下面根據(jù)附圖對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行詳細(xì)描述，其為本實(shí)用新型多種實(shí)施方式中的一種優(yōu)選實(shí)施例。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，定量檢測(cè)卡包括底卡和面卡，其中，底卡上設(shè)有加樣區(qū)1，結(jié)合區(qū)2，微通道3，時(shí)間閥4，檢測(cè)區(qū)以及廢液區(qū)8，加樣區(qū)1連接結(jié)合區(qū)2且加樣區(qū)1與結(jié)合區(qū)2位于微通道3的一端，檢測(cè)區(qū)通過(guò)時(shí)間閥4連接微通道3的另一端；面卡上設(shè)有加樣孔9和觀察孔10，加樣孔9的位置與底卡加樣區(qū)1對(duì)應(yīng)，觀察孔10的位置與底卡檢測(cè)區(qū)對(duì)應(yīng)，底卡和面卡的背面扣合連接。

加樣區(qū)1覆蓋濾紙，濾紙為圓形，結(jié)合區(qū)2和時(shí)間閥4分別設(shè)置于微通道3的兩端并直接連接至并聯(lián)微通道3，廢液區(qū)8連接至結(jié)合區(qū)2和/或微通道3，微通道3包括第一微通道和第二微通道，第一微通道連接時(shí)間閥4，第二微通道連接廢液區(qū)8，圓形濾紙直徑1.5-2.0cm、孔徑為1-3μm，第一微通道3孔徑為5μm，第二微通道3孔徑10μm，時(shí)間閥4的孔徑為3μm，檢測(cè)區(qū)包括依次排列的第一檢測(cè)區(qū)5，第二檢測(cè)區(qū)6以及第三檢測(cè)區(qū)7。

所述熒光微球采用無(wú)皂液法制作，具體處理方式如下：

(1)取0.1ml熒光微球A(10mg/ml、粒徑0.51μm、激發(fā)波長(zhǎng)660nm、發(fā)射波長(zhǎng)690nm)加入6μl 17α-羥孕酮抗體，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復(fù)溶沉淀0.1ml，待用；

(2)取0.1ml熒光微球B(10mg/ml、粒徑0.52μm、激發(fā)波長(zhǎng)480nm、發(fā)射波長(zhǎng)520nm)加入6μl抗促黃體生成激素抗體，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復(fù)溶沉淀0.1ml，待用；

(3)取0.1ml熒光微球C(10mg/ml、粒徑0.51μm、激發(fā)波長(zhǎng)360nm、發(fā)射波長(zhǎng)420nm)加入6μl抗促卵泡生成激素，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復(fù)溶沉淀0.1ml，待用；

所述的底卡和面卡材質(zhì)為PDMS(Polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)塑料，底卡加樣區(qū)覆蓋圓形濾紙，直徑1.5-2.0cm、孔徑為1-3μm，底卡中包含通過(guò)軟光刻技術(shù)和微流控技術(shù)制備的微通道，一種微通道孔徑為5μm，保證待測(cè)三種激素能夠進(jìn)入時(shí)間閥，另一種微通道孔徑10μm，紅細(xì)胞等從此通過(guò)進(jìn)入廢液區(qū)，所述的底卡在5μm孔徑的微通道與檢測(cè)區(qū)相連接處設(shè)置時(shí)間閥，該時(shí)間閥的孔徑為3μm，底卡檢測(cè)區(qū)包含通過(guò)軟光刻技術(shù)和微流控技術(shù)制備的微通道結(jié)構(gòu)，微通道孔徑為5μm。

檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：將血清標(biāo)準(zhǔn)品配制成一系列濃度(5個(gè)以上)，用同一批次的數(shù)張檢測(cè)卡檢測(cè)各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以檢測(cè)線的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，血清標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)曲線保存在多色熒光分析儀中。

(2)樣品檢測(cè)：平放檢測(cè)卡，待測(cè)血清平衡至室溫后，用已滅菌的膠頭滴管吸取一定量血清加入加樣孔中，立即將檢測(cè)卡放入多色熒光檢測(cè)儀中。記錄熒光微球在最佳激發(fā)光源的激發(fā)下所發(fā)出的熒光值。

(3)將所得數(shù)值代入已保存在多色熒光分析儀中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式計(jì)算即得到樣本中待測(cè)物的濃度。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，可以采用如下方案：一種同時(shí)檢測(cè)抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素的定量檢測(cè)卡及其制備方法，由底卡和面卡組成。底卡上依次覆蓋濾紙的加樣區(qū)、噴涂熒光微球標(biāo)記的抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體的結(jié)合區(qū)、微通道、時(shí)間閥、包被抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素并且具有微通道的檢測(cè)區(qū)、廢液區(qū)。面卡預(yù)留加樣孔和檢測(cè)孔，加樣孔的位置底卡加樣區(qū)對(duì)應(yīng)，觀察孔的位置與底卡檢測(cè)區(qū)對(duì)應(yīng)。

所述熒光微球采用無(wú)皂液法制作，具體處理方式如下：

(1)取0.1ml熒光微球A(10mg/ml、粒徑0.51μm、激發(fā)波長(zhǎng)660nm、發(fā)射波長(zhǎng)690nm)加入6μl 17α-羥孕酮抗體，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復(fù)溶沉淀0.1ml，待用；

(2)取0.1ml熒光微球B(10mg/ml、粒徑0.52μm、激發(fā)波長(zhǎng)480nm、發(fā)射波長(zhǎng)520nm)加入6μl抗促黃體生成激素抗體，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復(fù)溶沉淀0.1ml，待用；

(3)取0.1ml熒光微球C(10mg/ml、粒徑0.51μm、激發(fā)波長(zhǎng)360nm、發(fā)射波長(zhǎng)420nm)加入6μl抗促卵泡生成激素，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3小時(shí)，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M的PBS溶液(磷酸鹽緩沖液，pH7.4，其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復(fù)溶沉淀0.1ml，待用；

所述的底卡和面卡材質(zhì)為PDMS。所述的底卡加樣區(qū)覆蓋圓形濾紙，直徑1.5-2.0cm、孔徑為1-3μm。所述的底卡中包含通過(guò)軟光刻技術(shù)和微流控技術(shù)制備的微通道，一種微通道孔徑為5μm，保證待測(cè)三種激素能夠進(jìn)入時(shí)間閥，另一種微通道孔徑10μm，紅細(xì)胞等從此通過(guò)進(jìn)入廢液區(qū)。所述的底卡在5μm孔徑的微通道與檢測(cè)區(qū)相連接處設(shè)置時(shí)間閥，該時(shí)間閥的孔徑為3μm。所述的底卡檢測(cè)區(qū)包含通過(guò)軟光刻技術(shù)和微流控技術(shù)制備的微通道結(jié)構(gòu)，微通道孔徑為5μm。

詳細(xì)制備方法包括如下步驟：

一、底卡的制備：

本實(shí)用新型底卡采用PDMS材質(zhì)，利用光刻機(jī)制備，經(jīng)制圖、掩模、光刻、再鑄模、軟光刻等工藝完成底卡的制備。

1.制圖：微通道圖形自行設(shè)計(jì)，然后通過(guò)使用繪圖軟件繪制掩膜版圖。

2.掩模：制成掩膜版圖后，使用高分辨率激光打印機(jī)(分辨率12000dpi)打印在透明膠片上制得光刻掩膜板,然后利用此掩膜板通過(guò)光刻工藝制作硅片模具。

3.光刻：在干凈的基片表面鍍上一層阻擋層,例如鉻、二氧化硅、氮化硅等；再用甩膠機(jī)在阻擋層上均勻地甩上一層光敏材料-光刻膠；然后在光掩模上制備所需的通道圖案。將光掩模復(fù)蓋在基片上,用紫外光照射涂有光刻膠的基片,光刻膠發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)；用光刻膠配套顯影液通過(guò)顯影的化學(xué)方法除去經(jīng)曝光的光刻膠；烘干后,利用未曝光的光刻膠的保護(hù)作用,采用化學(xué)腐蝕的方法在阻擋層上精確腐蝕出底片上平面二維圖形，制成所需硅片模具。

4.再鑄模：通過(guò)將彈性材料涂于光刻形成的硅片模具表面,干燥后取下則硅片模具表面上圖形轉(zhuǎn)移到彈性材料上形成印模。

5.軟光刻：將PDMS前聚體與固化劑按10:1比例(增加固化劑會(huì)使交聯(lián)的結(jié)構(gòu)增多，導(dǎo)致形成的彈性體硬度增大，減少固化劑則作用相反)混合，攪拌混勻后，置于真空箱內(nèi)脫除氣泡，然后在印模上澆注，厚度控制約6mm。為了有利于PDMS薄片制好后與印模分離，應(yīng)先將印模在二氯二甲基硅烷氣體中處理約5min，然后將徹底脫除氣泡的PDMS前聚體澆鑄在印模圖形之上，這個(gè)過(guò)程中需要保持印模底片水平，并注意不要讓PDMS前聚體溢出。PDMS前聚體在印模上完全攤平后，將其連同印模一起放入烘箱內(nèi)進(jìn)行固化。加溫是為了加快固化的過(guò)程，置于80℃烘箱固化約48小時(shí)，之后小心地將PDMS基片從印模上剝離下來(lái)。

二、抗17α-羥孕酮抗體、抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體的制備

本實(shí)用新型用17α-羥孕酮作為免疫原注入小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150μg/只，使其產(chǎn)生抗血清。取產(chǎn)生特異性抗體的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法測(cè)定細(xì)胞上清液，篩選陽(yáng)性孔。利用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性孔進(jìn)行克隆，得到并建立產(chǎn)單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞用凍存液制成細(xì)胞懸液，分裝于凍存管，在液氮中長(zhǎng)期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)。采用體內(nèi)誘生法，將小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油，7-14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7-10天后采集腹水。經(jīng)辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，純度經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，小瓶分裝，-20℃保存。

抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體的制備同上。

三、熒光微球的制備與標(biāo)記抗體

無(wú)皂液法制備熒光微球：稱(chēng)取0.009g過(guò)硫酸鉀，0.004gNaHCO₃溶于7ml去離子水，將1mg熒光染料溶于2ml無(wú)水乙醇及1ml苯乙烯，加入到水溶液中，搖勻，通氮?dú)?min，放入70℃恒溫水浴震蕩24h，取出，離心(10000rpm×10min)分離出的聚合物分別再用乙醇、去離子水離心洗滌3次，即得到熒光染料標(biāo)記的聚苯乙烯熒光微球。得到的熒光微球直徑為50-100nm。

將1mg包裹熒光染料的熒光微球在1000rpm×15min，收集沉淀，用0.01M pH4.8的硼酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)微球濃度為OD₄₅₀＝0.2。然后加入90μL50mg/mL對(duì)乙基-N，N-二甲基丙基碳二亞胺(EDC)，150μL5mg/mL氮經(jīng)基唬拍酞亞胺(NHS)，振蕩混勻，室溫孵育10-30min后，離心(1000rpm×15min)，沉淀再用0.01M pH4.8的硼酸鹽緩沖液溶解，并調(diào)節(jié)微球濃度為OD₄₅₀＝0.2。將0.1mL熒光微球中加入1-10μL17α-羥孕酮單抗，充分混勻后，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)3h，分別用超純水洗滌離心3次后，沉淀用0.01M pH7.2的PBS溶液(其中包含5％蔗糖和0.05％Tween-20)復(fù)溶沉淀至起始體積后，即為制備好的熒光標(biāo)記的抗17α-羥孕酮抗體。

抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體的制備同上。標(biāo)記的熒光染料選三種不同顏色，抗原抗體發(fā)生免疫反應(yīng)后顯示不用的顏色，容易區(qū)分。

四、噴涂熒光微球標(biāo)記的抗17α-羥孕酮抗體、抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體

用噴金機(jī)將熒光微球標(biāo)記的抗17α-羥孕酮抗體、抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體按照5-10μl的體積均勻噴涂在結(jié)合區(qū)上三個(gè)固定的位置，30℃真空干燥12h，放于室溫環(huán)境中備用。

五、抗17α-羥孕酮抗體、抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體的包被

用0.01M PBS緩沖液(磷酸鹽緩沖液，pH 7.4，含有5％蔗糖溶液金和0.05％Tween-20)調(diào)節(jié)抗體濃度為0.5mg/ml，將包被后的溶液按照1-3μl的體積均勻噴涂在檢測(cè)區(qū)上三個(gè)固定的位置，A為抗17α-羥孕酮抗體、B為抗黃體生成激素抗體、C為抗促卵泡生成激素抗體，30℃真空干燥12h，放于室溫環(huán)境中備用。

六、濾紙覆蓋加樣區(qū)：

將直徑1.5-2.0cm、孔徑為1-3μm的圓形濾紙覆蓋在加樣區(qū)。

七、抗17α-羥孕酮抗體、抗黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體定量檢測(cè)卡的制備：

將面卡和制備號(hào)的底卡合在一起，壓緊，再將組裝后的檢測(cè)卡裝入鋁箔袋中，加入干燥劑封口保存，在室溫下可保存一年。

如圖1所示，該一種同時(shí)檢測(cè)抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素的定量檢測(cè)卡的底卡包括1.覆蓋濾紙的加樣區(qū)、2.噴涂熒光微球標(biāo)記的抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素的結(jié)合區(qū)、3.微通道、4.時(shí)間閥、5-7.包被抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素并且具有微通道結(jié)構(gòu)的檢測(cè)區(qū)、8.廢液區(qū)。

如圖2所示，一種同時(shí)檢測(cè)抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素的定量檢測(cè)卡的面卡，包括加樣孔和檢測(cè)孔。

優(yōu)選實(shí)施例中：1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：將血清標(biāo)準(zhǔn)品配制成一系列濃度(5個(gè)以上)，用同一批次的數(shù)張一種同時(shí)檢測(cè)抗17α-羥孕酮抗體、抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素抗體的定量檢測(cè)卡檢測(cè)各濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。以檢測(cè)線的熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，血清標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)曲線保存在多色熒光分析儀中。

2、樣品檢測(cè)：平放檢測(cè)卡，待測(cè)血清平衡至室溫后，用已滅菌的膠頭滴管吸取一定量血清加入加樣孔中，立即將檢測(cè)卡放入多色熒光檢測(cè)儀中。記錄熒光微球在最佳激發(fā)光源的激發(fā)下所發(fā)出的熒光值。

3、結(jié)果分析：將所得數(shù)值代入已保存在多色熒光分析儀中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)以下公式計(jì)算待測(cè)血清中抗17α-羥孕酮抗體的濃度：

A₁＝(B′-A′)/V*(t_B-t_A)

即得到樣本中待測(cè)物的濃度。

A₁表示待測(cè)血清中的抗17α-羥孕酮抗體的濃度，A′、B′表示A、B熒光值所對(duì)應(yīng)的抗17α-羥孕酮抗體的濃度值，V表示在微通道中血清流體的流速，t_A、t_B表示熒光微球達(dá)到A、B熒光值時(shí)對(duì)應(yīng)的流體通過(guò)微通道的時(shí)間。

抗促黃體生成激素抗體和抗促卵泡生成激素檢測(cè)同上。