本實(shí)用新型涉及光學(xué)顯微成像領(lǐng)域，特別是涉及一種光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)。

背景技術(shù)：

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，生命科學(xué)技術(shù)也得到了相應(yīng)的發(fā)展，生物細(xì)胞成像的精度及準(zhǔn)確度要求越來越高，微納材料的研究也如火如荼。而傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像的空間分辨率受限于物鏡的數(shù)值孔徑與光波長(zhǎng)，分辨率只能達(dá)到300nm左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了現(xiàn)代顯微成像對(duì)分辨率的要求。

熒光是自然界常見的一種發(fā)光現(xiàn)象。熒光是光子與分子的相互作用產(chǎn)生的，即熒光分子在吸收能量(光能、電能、化學(xué)能等等)后，從處于最低能量的基態(tài)躍遷到能量較高的激發(fā)態(tài)(第一或第二激發(fā)態(tài))，激發(fā)態(tài)的電子處于高能量狀態(tài)，不穩(wěn)定，會(huì)在納秒級(jí)的時(shí)間范圍內(nèi)自發(fā)的躍遷回到基態(tài)，并以光子輻射的形式釋放出能量，具有這種性質(zhì)的出射光稱為熒光。熒光成像的理論基礎(chǔ)是熒光物質(zhì)被激發(fā)后所發(fā)射的熒光信號(hào)的強(qiáng)度在一定的范圍內(nèi)與熒光素的量成線性關(guān)系。傳統(tǒng)的光學(xué)顯微成像即通過檢測(cè)這一自發(fā)輻射的熒光信號(hào)來成像的。

當(dāng)處于激發(fā)態(tài)的熒光分子在外界輻射的影響下，產(chǎn)生與外界輻射同頻率、同相位和同偏振的輻射，即受激熒光輻射過程，如果這一過程競(jìng)爭(zhēng)超過了自發(fā)熒光輻射，便不會(huì)測(cè)量到自發(fā)輻射的熒光，這種現(xiàn)象稱為STED(stimulated emission depletion，受激輻射耗盡)?；谠摤F(xiàn)象的光學(xué)顯微術(shù)屬于超分辨顯微成像技術(shù)，該方法從分子級(jí)別上改變成像原理，突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像因受衍射極限的限制而導(dǎo)致分辨率無法提高的瓶頸，得到了很大的發(fā)展。

STED超分辨成像原理及光路如圖1-1至1-2所示，待成像目標(biāo)受到第一束激光激發(fā)產(chǎn)生熒光，形成具有衍射極限的圓斑(瑞利斑)，這個(gè)位置同時(shí)被第二束光束形狀為圓環(huán)的激光激發(fā)，第二束激光正好可以激發(fā)同一照射位置所形成光斑的非中心區(qū)域，兩束光疊加后使得只有中心區(qū)域的熒光分子能夠?qū)崿F(xiàn)激發(fā)態(tài)自發(fā)輻射熒光，周圍的分子(即被第二束光照射的區(qū)域)處于耗損態(tài)不發(fā)光，這就使得有效的熒光激發(fā)半徑大大的降低，即光斑中心的熒光區(qū)域由于非中心的耗盡態(tài)區(qū)域的侵占，直徑可以變得無限小，這樣就突破了瑞利衍射極限，提高成像的分辨率。

現(xiàn)有技術(shù)中，STED超分辨成像方法雖然可以滿足分辨率的要求，但是讓分子從基態(tài)轉(zhuǎn)化為激發(fā)態(tài)的需要的能量比較大，強(qiáng)的泵浦激光會(huì)影響待成像目標(biāo)的性質(zhì)甚至是造成損壞；而且，該方法通常需要使用脈沖激光，且對(duì)激光脈沖需做精準(zhǔn)的時(shí)序同步，需要較復(fù)雜的光學(xué)與電子系統(tǒng)，增加了操作成本，無疑也增大了費(fèi)用成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本實(shí)用新型實(shí)施例的目的是提供一種光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)，使用低功率連續(xù)光泵浦，實(shí)現(xiàn)對(duì)待成像目標(biāo)的超分辨顯微成像，不影響待成像目標(biāo)的性質(zhì)，而且光學(xué)系統(tǒng)與電子系統(tǒng)也相較STED簡(jiǎn)單，節(jié)省了操作成本和費(fèi)用成本。

為解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型實(shí)施例提供以下技術(shù)方案：

本實(shí)用新型實(shí)施例提供了一種光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)，包括：

光學(xué)模塊以及成像模塊；

其中，所述光學(xué)模塊包括第一泵浦光單元、第二泵浦光單元以及第三泵浦光單元；

所述第一泵浦光單元用于利用第一波長(zhǎng)光束照射待成像目標(biāo)，以使所述待成像目標(biāo)的分子初始化為第一電荷態(tài)；

所述第二泵浦光單元用于產(chǎn)生第二波長(zhǎng)空心光束，并利用所述第二波長(zhǎng)空心光束照射所述待成像目標(biāo)，以使所述待成像目標(biāo)第一預(yù)設(shè)位置范圍內(nèi)的分子轉(zhuǎn)化為第二電荷態(tài)；

所述第三泵浦光單元用于利用第三波長(zhǎng)光束照射所述待成像目標(biāo)第二預(yù)設(shè)位置范圍內(nèi)的分子，以輻射熒光信號(hào)；

所述成像模塊用于根據(jù)所述待成像目標(biāo)輻射的熒光信號(hào)的光強(qiáng)信息對(duì)所述待成像目標(biāo)進(jìn)行成像。

優(yōu)選的，所述第一泵浦光單元包括：

光源，用于發(fā)射所述第一波長(zhǎng)光束；

透鏡組，用于將所述第一波長(zhǎng)光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準(zhǔn)直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標(biāo)上；

所述調(diào)制器，用于將所述第一波長(zhǎng)光束在預(yù)設(shè)時(shí)間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第一高階衍射光束。

優(yōu)選的，所述第二泵浦光單元包括：

光源，用于發(fā)射第二波長(zhǎng)光束；

透鏡組，用于將所述第二波長(zhǎng)光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準(zhǔn)直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標(biāo)上；

所述調(diào)制器，用于將所述第一波長(zhǎng)光束在預(yù)設(shè)時(shí)間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第二高階衍射光束；

螺旋相位片，用于將所述第二波長(zhǎng)光束轉(zhuǎn)化為所述第二波長(zhǎng)空心光束。

優(yōu)選的，所述第三泵浦光單元包括：

光源，用于發(fā)射所述第三波長(zhǎng)光束；

透鏡組，用于將所述第三波長(zhǎng)光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準(zhǔn)直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標(biāo)上；

所述調(diào)制器，用于將所述第三波長(zhǎng)光束在預(yù)設(shè)時(shí)間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第三高階衍射光束。

優(yōu)選的，所述光學(xué)模塊還包括：

合束單元，用于將三束泵浦光通過雙色片組和反射鏡合為一束，并通過物鏡聚焦到所述待成像目標(biāo)上。

優(yōu)選的，所述成像模塊包括：

雙色片，用于將所述待成像目標(biāo)輻射的熒光信號(hào)與泵浦光信號(hào)進(jìn)行分離；

濾波片，用于將分離的熒光信號(hào)中摻入的泵浦光信號(hào)濾出；

探測(cè)器，用于收集過濾的熒光信號(hào)，并將所述熒光信號(hào)發(fā)送到控制單元；

透鏡，用于將所述過濾的熒光信號(hào)聚焦到所述探測(cè)器上；

位置掃描單元，用于將所述待成像目標(biāo)的待測(cè)像素點(diǎn)移動(dòng)到預(yù)設(shè)位置，以對(duì)所述待測(cè)像素點(diǎn)進(jìn)行成像；

所述控制單元用于計(jì)算所述熒光信號(hào)的光強(qiáng)，并根據(jù)所述待成像目標(biāo)輻射的熒光信號(hào)的光強(qiáng)與對(duì)應(yīng)的位置對(duì)所述待成像目標(biāo)進(jìn)行成像。

優(yōu)選的，所述調(diào)制器為聲光調(diào)制器。

優(yōu)選的，所述控制單元包括數(shù)據(jù)采集卡和脈沖信號(hào)卡。

優(yōu)選的，所述探測(cè)器為單光子探測(cè)器。

本實(shí)用新型實(shí)施例提供了一種光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)，包括光學(xué)模塊以及成像模塊；光學(xué)模塊用于通過第一波長(zhǎng)光束以及第二波長(zhǎng)光束照射待成像目標(biāo)，以使待成像目標(biāo)的分子初始化為第一電荷態(tài)以及在第一預(yù)設(shè)位置范圍內(nèi)分子轉(zhuǎn)化為第二電荷態(tài)；利用第三波長(zhǎng)光束照射待成像目標(biāo)第二預(yù)設(shè)位置范圍內(nèi)的分子，以輻射熒光信號(hào)；根據(jù)所述待成像目標(biāo)輻射的熒光信號(hào)的光強(qiáng)信息對(duì)所述待成像目標(biāo)進(jìn)行成像。

本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)在于使用低功率連續(xù)光泵浦，實(shí)現(xiàn)了對(duì)待成像目標(biāo)的超分辨顯微成像。與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于電荷態(tài)較激發(fā)態(tài)(幾個(gè)納秒)的壽命較長(zhǎng)，可達(dá)到秒量級(jí)，故功率較低的泵浦光便可控制待成像目標(biāo)的電荷態(tài)，采用較低功率的泵浦光不影響待測(cè)樣品的性質(zhì)；此外，本申請(qǐng)技術(shù)方案不需要對(duì)激光脈沖做精準(zhǔn)的時(shí)序同步，故光學(xué)系統(tǒng)與電子系統(tǒng)結(jié)構(gòu)也相較簡(jiǎn)單，使用和組裝更加方便，節(jié)省了操作成本和費(fèi)用成本，提高了用戶的使用體驗(yàn)。

附圖說明

為了更清楚的說明本實(shí)用新型實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單的介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本實(shí)用新型的一些實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1-1為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的STED超分辨成像原理圖；

圖1-2為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的STED超分辨成像與普通成像的光路圖；

圖2為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)的一種具體實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)圖；

圖3為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)的另一種具體實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)圖；

圖4為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的控制信號(hào)與讀取信號(hào)序列圖；

圖5為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的一個(gè)示例性應(yīng)用場(chǎng)景的示意圖；

圖6為本實(shí)用新型實(shí)施例提供圖5中示例性例子的光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖7為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的圖5中示例性例子的成像示意圖；

圖8為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的圖5中示例性例子的成像示意圖；

圖9為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)的工作流程示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本技術(shù)領(lǐng)域的人員更好地理解本實(shí)用新型方案，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本實(shí)用新型一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒緦?shí)用新型中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本實(shí)用新型保護(hù)的范圍。

本申請(qǐng)的說明書和權(quán)利要求書及上述附圖中的術(shù)語“第一”、“第二”、“第三”“第四”等是用于區(qū)別不同的對(duì)象，而不是用于描述特定的順序。此外術(shù)語“包括”和“具有”以及他們?nèi)魏巫冃?，意圖在于覆蓋不排他的包含。例如包含了一系列步驟或單元的過程、方法、系統(tǒng)、產(chǎn)品或設(shè)備沒有限定于已列出的步驟或單元，而是可包括沒有列出的步驟或單元。

首先參見圖2，圖2為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)在一種具體實(shí)施方式中的結(jié)構(gòu)圖，本實(shí)用新型實(shí)施例可包括以下內(nèi)容：

一種光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)可包括光學(xué)模塊21以及成像模塊 22。

其中，所述光學(xué)模塊21包括第一泵浦光單元211、第二泵浦光單元212以及第三泵浦光單元213。

所述第一泵浦光單元211用于利用第一波長(zhǎng)光束照射待成像目標(biāo)，以使所述待成像目標(biāo)的分子初始化為第一電荷態(tài)。

所述第二泵浦光單元212用于產(chǎn)生第二波長(zhǎng)空心光束，并利用第二波長(zhǎng)空心光束照射所述待成像目標(biāo)，以使所述待成像目標(biāo)第一預(yù)設(shè)位置范圍內(nèi)分子轉(zhuǎn)化為第二電荷態(tài)。

所述第三泵浦光單元213用于利用第三波長(zhǎng)光束照射所述待成像目標(biāo)第二預(yù)設(shè)位置范圍內(nèi)的分子，以輻射熒光信號(hào)。

待成像目標(biāo)一般為熒光材料，或者是使用熒光材料進(jìn)行修飾的材料，例如熒光蛋白標(biāo)記的細(xì)胞。熒光材料通常存在著帶有不同電荷量的狀態(tài)，不同的電荷態(tài)的熒光光譜和強(qiáng)度不同，而且，電荷態(tài)的壽命較長(zhǎng)，通?？蛇_(dá)到秒量級(jí)，而分子的激發(fā)態(tài)壽命僅僅為幾個(gè)納秒。

熒光材料的大多數(shù)分子在常態(tài)下，是處于具有最低能量的基態(tài)能級(jí)，當(dāng)受到能量(光能、電能、化學(xué)能等等)激發(fā)后，該熒光材料會(huì)吸收能量進(jìn)行躍遷。分子不同狀態(tài)的吸收的能量是不同的，可根據(jù)熒光材料分子的性質(zhì)確定使其躍遷到需求的分子狀態(tài)需要吸收的能量。也就是說不同的波長(zhǎng)的光可將同一熒光材料的分子泵浦到不同的電荷態(tài)，舉例來說，對(duì)于金剛石中的氮-空位(nitrogen vacancy，NV)色心熒光材料來說，NV的電荷態(tài)主要為帶負(fù)電的NV^-以及電中性的 NV⁰，使NV分子的電荷態(tài)變?yōu)镹V^-需要使用637nm激光進(jìn)行泵浦，而使NV分子的電荷態(tài)變?yōu)镹V⁰則使用532nm激光進(jìn)行泵浦。

第一波長(zhǎng)光束、第二波長(zhǎng)空心光束以及第三波長(zhǎng)光束可以是激光光束，當(dāng)然也可以為其他任何一種光，例如紅外光，紫外光，極光， X射線等等；當(dāng)然也可為其他能量如電能、化學(xué)能，本實(shí)用新型實(shí)施例并不對(duì)此做任何的限定。

需要說明的是，由上可知第一波長(zhǎng)光束(初始光)與待成像目標(biāo)的分子處于第一電荷態(tài)相對(duì)應(yīng)；第二波長(zhǎng)光束(轉(zhuǎn)換光)與待成像目標(biāo)的分子處于第二電荷態(tài)相對(duì)應(yīng)。

第二波長(zhǎng)空心光束需要在第二波長(zhǎng)光束的基礎(chǔ)上進(jìn)行轉(zhuǎn)換，例如激光光束為高斯形狀的光束，為了獲得空心形狀的光束，高斯光束可通過一片螺旋相位片進(jìn)行轉(zhuǎn)化。相位片對(duì)光束相位按照入射面上的角分布進(jìn)行不同的調(diào)制，從而獲得空心光束。

待成像目標(biāo)的第一預(yù)設(shè)位置范圍為光束照射在待成像目標(biāo)不包括空心光束空心對(duì)應(yīng)照射位置的其他位置，也就是說當(dāng)?shù)谝徊ㄩL(zhǎng)光束與第二波長(zhǎng)光束為同樣形狀的光時(shí)，第一預(yù)設(shè)位置范圍為第一波長(zhǎng)光束照射在待成像目標(biāo)的表面區(qū)域減去第二波長(zhǎng)空心光束空心位置映射在待成像目標(biāo)的區(qū)域。舉例來說，假設(shè)第一波長(zhǎng)光束與第二波長(zhǎng)光束皆為高斯光束，當(dāng)其照射在待成像目標(biāo)時(shí)，光束的直徑為1cm，第二波長(zhǎng)空心光束的空心位置映射在待成像目標(biāo)的直徑為0.1cm，則第一預(yù)設(shè)位置范圍為外直徑為1cm，內(nèi)直徑為0.1cm的圓環(huán)的區(qū)域。

第三波長(zhǎng)光束作為探測(cè)光，照射第二預(yù)設(shè)位置范圍內(nèi)的熒光材料分子，使其吸收光能從當(dāng)前的電荷態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再?gòu)募ぐl(fā)態(tài)回到基態(tài)，以光子輻射的形式釋放出能量，即發(fā)射熒光。

第二預(yù)設(shè)位置范圍可為第一預(yù)設(shè)位置范圍；也可為第一波長(zhǎng)光束照射待成像目標(biāo)的表面區(qū)域不包含第一預(yù)設(shè)位置范圍的其他任何區(qū)域，也可以是第二波長(zhǎng)空心光束空心位置映射在待成像目標(biāo)的區(qū)域；當(dāng)然也可為任意指定的光束照射在待成像目標(biāo)的表面區(qū)域上的任何一塊區(qū)域?？筛鶕?jù)實(shí)驗(yàn)者或用戶的需求來確定第二預(yù)設(shè)位置范圍的區(qū)域。

所述成像模塊22用于根據(jù)所述待成像目標(biāo)輻射的熒光信號(hào)的光強(qiáng)信息對(duì)所述待成像目標(biāo)進(jìn)行成像。

成像模塊22通過獲取熒光并收集熒光，將收集到的熒光發(fā)送到控制單元，控制單元通過對(duì)收集到的熒光的光強(qiáng)進(jìn)行計(jì)算，然后根據(jù)熒光光強(qiáng)信息通過軟件(例如MATLAB、LabVIEW)進(jìn)行對(duì)待成像目標(biāo)進(jìn)行成像。

可選的，在本實(shí)施例的一些實(shí)施方式中，所述第一泵浦光單元211 可包括：

光源2111，用于發(fā)射所述第一波長(zhǎng)光束；

透鏡組2112，用于將所述第一波長(zhǎng)光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準(zhǔn)直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標(biāo)上；

所述調(diào)制器2113，用于將所述第一波長(zhǎng)光束在預(yù)設(shè)時(shí)間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第一高階衍射光束。

所述第二泵浦光單元212包括：

光源2121，用于發(fā)射第二波長(zhǎng)光束；

透鏡組2122，用于將所述第二波長(zhǎng)光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準(zhǔn)直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標(biāo)上；

所述調(diào)制器2123，用于將所述第一波長(zhǎng)光束在預(yù)設(shè)時(shí)間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第二高階衍射光束；

螺旋相位片2124，用于將所述第二波長(zhǎng)光束轉(zhuǎn)化為所述第二波長(zhǎng)空心光束。

所述第三泵浦光單元213包括：

光源2131，用于發(fā)射所述第三波長(zhǎng)光束；

透鏡組2132，用于將所述第三波長(zhǎng)光束聚焦到調(diào)制器，并將經(jīng)所述調(diào)制器出來的光準(zhǔn)直為平行光束，再將其入射到所述待成像目標(biāo)上；

所述調(diào)制器2133，用于將所述第三波長(zhǎng)光束在預(yù)設(shè)時(shí)間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為第三高階衍射光束。

光源2111、光源2121、光源2131可為激光光源，也可為其他光源。激光光源可為半導(dǎo)體激光器，當(dāng)然也可采用其他類型的激光器。因?yàn)榧す夤庠吹臏?zhǔn)直性高、亮度高、單色性好、能量密度大等優(yōu)勢(shì)，優(yōu)選的，可采用激光光源。

需要說明的是，光源2111、光源2121、光源2131可為同一臺(tái)機(jī)器發(fā)射的不同波長(zhǎng)的光，也可為三臺(tái)不同的機(jī)器發(fā)射三束泵浦光。

調(diào)制器用于將當(dāng)前的光束在預(yù)設(shè)時(shí)間范圍內(nèi)轉(zhuǎn)化為高階衍射光束，即用來控制各光源的開關(guān)和持續(xù)時(shí)間。調(diào)制器的個(gè)數(shù)與光源的個(gè)數(shù)相對(duì)應(yīng)，舉例來說，如果三束泵浦光由一臺(tái)半導(dǎo)體激光器產(chǎn)出。則只需要一臺(tái)調(diào)制器。

調(diào)制器可置于光束焦點(diǎn)處，調(diào)整調(diào)制器的三維位置與角度，使光束通過調(diào)制器后發(fā)生衍射，產(chǎn)生高階衍射光束。調(diào)制器可通過控制單元發(fā)射預(yù)設(shè)信號(hào)來控制，當(dāng)對(duì)調(diào)制器加信號(hào)后，可以得到高階衍射光。舉例來說，當(dāng)調(diào)制器接收控制單元發(fā)射的高電壓TTL信號(hào)時(shí)，調(diào)制器將泵浦光轉(zhuǎn)化為高階衍射光束輸出；當(dāng)接收低電壓TTL信號(hào)時(shí)，則調(diào)制器不輸出光束。

優(yōu)選的，調(diào)制器可采用聲光調(diào)制器，高階衍射光可為聲光調(diào)制器的1階衍射光，其衍射效率可達(dá)百分之八十左右，消光比約為2000： 1。TTL控制信號(hào)可由插置于控制單元的PCI卡產(chǎn)生，并通過LabView 程序進(jìn)行控制。通過采用調(diào)制器對(duì)光源照射時(shí)間的控制和光源的開啟和關(guān)閉，避免用戶自己操作，節(jié)約操作成本，提升用戶的使用體驗(yàn)；此外，經(jīng)過調(diào)整后的光束可以獲得更好的成像效果。

透鏡組主要用于對(duì)光源出射的光進(jìn)行整形，使其達(dá)到最好的成像效果。例如可采用焦距為15cm的凸透鏡將三束不同波長(zhǎng)的光束由平行光聚焦到凸透鏡焦點(diǎn)，使其全部或大多數(shù)的光可通過下一個(gè)器件。經(jīng)過調(diào)制器后，光束可通過另外一個(gè)15cm焦距的凸透鏡將光束重新準(zhǔn)直為平行光束。

優(yōu)選的，可采用美國(guó)RPC Photonics公司的VPP-1a螺旋相位片，獲得的空心光束中心光功率密度與最高光密度之比約為2：100。

需要說明的是，三束泵浦光可以同時(shí)照射帶成像目標(biāo)，也可依次進(jìn)行照射，當(dāng)然也可根據(jù)預(yù)設(shè)的時(shí)間進(jìn)行照射，預(yù)設(shè)的時(shí)間一般為多次實(shí)驗(yàn)總結(jié)出效果最好的的照射時(shí)間。舉例來說，初始光照射時(shí)間為 10微秒，轉(zhuǎn)換光照射時(shí)間為10微秒，探測(cè)光照射時(shí)間為1毫秒。

作為一種具體實(shí)施方式，請(qǐng)參閱圖3，上述實(shí)施例中的光學(xué)模塊還可還包括：

合束單元，用于將三束泵浦光通過雙色片組和反射鏡合為一束，并通過物鏡聚焦到所述待成像目標(biāo)上。

第一波長(zhǎng)光束(初始化光)通過凸透鏡準(zhǔn)直的平行光經(jīng)過反射鏡投射到第一雙色片，第二波長(zhǎng)空心光束(轉(zhuǎn)換光)通過凸透鏡準(zhǔn)直的平行光入射到第一雙色片，第三波長(zhǎng)光束(探測(cè)光)通過凸透鏡準(zhǔn)直的平行光入射到第二雙色片，初始化光與轉(zhuǎn)換光通過第一雙色片入射到第二雙色片后再入射到第三雙色片，從第三雙色片出射的三束光通過第三雙色片入射到物鏡上，通過物鏡將三束光聚焦到待成像目標(biāo)。優(yōu)選的，物鏡的數(shù)值孔徑可為NA＝0.9。調(diào)節(jié)雙色片的位置與角度，使三束激光光束通過物鏡后的聚焦點(diǎn)能夠完美重合。

需要說明的是，當(dāng)三束光分別在各自的預(yù)設(shè)時(shí)間內(nèi)依次照射待成像目標(biāo)時(shí)，則不需要合束單元。

通過將三束泵浦光進(jìn)行合束，使其全部或絕大多數(shù)的光照射到待成像目標(biāo)上，從而獲取更多的熒光信號(hào)，有利于對(duì)待成像目標(biāo)進(jìn)行成像。

在本實(shí)施例的另一些實(shí)施方式中，請(qǐng)參閱圖3，成像模塊22可包括：

熒光收集單元221，用于對(duì)待成像目標(biāo)輻射的熒光光子進(jìn)行收集，具體包括：

雙色片2211，用于所述待成像目標(biāo)輻射的熒光信號(hào)與泵浦光信號(hào)進(jìn)行分離。

濾波片2212，用于將分離的熒光信號(hào)中摻入的泵浦光信號(hào)濾出。

探測(cè)器2213，用于收集過濾的熒光信號(hào)，并將所述熒光信號(hào)發(fā)送到控制單元。

透鏡2214，用于將所述過濾的熒光信號(hào)聚焦到所述探測(cè)器上。

位置掃描單元222，用于將所述待成像目標(biāo)的待測(cè)像素點(diǎn)移動(dòng)到預(yù)設(shè)位置，以對(duì)所述待測(cè)像素點(diǎn)進(jìn)行成像。

所述控制單元223用于計(jì)算所述熒光信號(hào)的光強(qiáng)，并根據(jù)所述待成像目標(biāo)輻射的熒光信號(hào)的光強(qiáng)與對(duì)應(yīng)的位置對(duì)所述待成像目標(biāo)進(jìn)行成像。

因?yàn)楸闷止庹丈涞酱上衲繕?biāo)上，然后待成像目標(biāo)會(huì)自發(fā)輻射熒光光子，這樣不可避免的泵浦光與熒光會(huì)有重合，而熒光的光強(qiáng)較弱，與泵浦光混合后難以識(shí)別，故需要雙色片進(jìn)行分離；此外，由于兩者光強(qiáng)懸殊太大，導(dǎo)致熒光中只要混較少的泵浦光，對(duì)收集等后續(xù)操作都是不利的，故還需要經(jīng)過濾波片進(jìn)行進(jìn)一步的過濾，將熒光信號(hào)中摻入的泵浦光濾出，以得到純度較高的熒光光子，獲得更佳的成像效果。

需要說明的是，雙色片2211與實(shí)施例中的第三雙色片可以為同一片雙色片，即雙色片2211即為第三雙色片，這樣即可以節(jié)省材料和成本，又可簡(jiǎn)化系統(tǒng)結(jié)構(gòu)。

優(yōu)選的，可采用單光子探測(cè)器進(jìn)行收集熒光光子，熒光光束可由一個(gè)7.5cm焦距的凸透鏡聚焦到單光子探測(cè)器。每當(dāng)一個(gè)熒光光子被測(cè)量到，單光子探測(cè)器將發(fā)出一個(gè)TTL脈沖信號(hào)。TTL信號(hào)被控制單元的數(shù)據(jù)采集卡記錄，從而得到熒光強(qiáng)度數(shù)值。

對(duì)待成像目標(biāo)進(jìn)行成像時(shí)，可以直接對(duì)整個(gè)目標(biāo)進(jìn)行成像，也可按照每一個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行成像，優(yōu)選的，可采用第二種方式。通過位置掃描單元將待成像目標(biāo)的待測(cè)像素點(diǎn)移動(dòng)到探測(cè)位置，對(duì)每一個(gè)像素點(diǎn)輻射的熒光進(jìn)行收集，然后根據(jù)該像素點(diǎn)的位置與光強(qiáng)的關(guān)系利用控制單元進(jìn)行成像。位置掃描系統(tǒng)可為壓電陶瓷位移臺(tái)，壓電陶瓷位移臺(tái)可采購(gòu)德國(guó)PI公司P733.3系列，位置掃描系統(tǒng)可通過控制單元進(jìn)行控制，即通過控制單元控制壓電平移臺(tái)將樣品移動(dòng)到下一個(gè)位置，依次完成對(duì)每一個(gè)像素點(diǎn)的熒光強(qiáng)度的測(cè)量。

舉例來說，以二維成像為例，在對(duì)面積為2微米*2微米的待成像目標(biāo)進(jìn)行成像時(shí)，可將成像區(qū)域分為40*40個(gè)像素點(diǎn)，每個(gè)像素點(diǎn)大小則為50納米＊50納米。利用壓電平移臺(tái)將樣品依次移動(dòng)到40*40 個(gè)坐標(biāo)，分別測(cè)量每個(gè)坐標(biāo)點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，對(duì)該待成像目標(biāo)進(jìn)行光學(xué)超分辨成像。

控制單元，可由電腦以及整合到電腦主板的數(shù)據(jù)采集卡和脈沖信號(hào)發(fā)生卡構(gòu)成，數(shù)據(jù)采集卡可采購(gòu)美國(guó)NI公司的USB6343系列，脈沖信號(hào)發(fā)生卡可采購(gòu)美國(guó)Spincore公司生產(chǎn)的PCI脈沖卡。控制系統(tǒng)可基于LabVIEW軟件編寫，可用于對(duì)光源開關(guān)和位置移動(dòng)的控制，獲取的熒光強(qiáng)度和位置信息也可通過LabVIEW程序?qū)崿F(xiàn)最終的成像。

需要說明的是，對(duì)待成像目標(biāo)或每一個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行成像時(shí)，通常需要對(duì)每一塊區(qū)域或每一個(gè)像素點(diǎn)循環(huán)多次以獲得足夠的熒光光子計(jì)數(shù)。也就是說初始光、轉(zhuǎn)化光、探測(cè)光需要循環(huán)多次。這樣，通過獲得足夠多的熒光光子，得到較高的光強(qiáng)值，有利于對(duì)待成像目標(biāo)進(jìn)行超分辨成像。

在一種具體的實(shí)施方式，舉例來說，可參見圖5，圖5為控制信號(hào)與讀取信號(hào)序列圖。對(duì)一個(gè)像素點(diǎn)進(jìn)行收集熒光光子時(shí)，可采用初始光照射10微秒，轉(zhuǎn)換光照射20微秒，探測(cè)光照射10微秒，然后初始光、轉(zhuǎn)化光、探測(cè)光在50毫秒內(nèi)循環(huán)多次進(jìn)行。

為了更好的理解本實(shí)用新型實(shí)施例的原理和思想，請(qǐng)參閱圖5至圖8，以下以一種具體的應(yīng)用場(chǎng)景介紹利用本實(shí)用新型實(shí)施例所述的光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)對(duì)金剛石中的NV(nitrogen vacancy，氮-空位)色心熒光材料進(jìn)行光學(xué)超分辨顯微成像。

NV有兩種電荷態(tài)，帶負(fù)電的NV^-，以及電中性的NV⁰。如圖5 所示，637納米激光可將NV以95％的概率泵浦到NV⁰電荷態(tài)；而532 納米激光可將NV以75％的概率泵浦到NV^-電荷態(tài)。589納米激光可用于對(duì)電荷態(tài)進(jìn)行探測(cè)。由于NV^-輻射的熒光波長(zhǎng)比NV⁰輻射的熒光波長(zhǎng)更長(zhǎng)，可采用在光路中加入650納米長(zhǎng)通濾波片濾出NV⁰輻射的光子，從而只探測(cè)NV^-輻射的光子。

如圖6所示，為對(duì)NV進(jìn)行光學(xué)超分辨成像的光路及系統(tǒng)圖。圖中1為第一波長(zhǎng)光束(初始光)，2為第三波長(zhǎng)光束(探測(cè)光)，3為第二波長(zhǎng)光束(轉(zhuǎn)換光)，三束光通過半導(dǎo)體激光器同時(shí)發(fā)射；4為凸透鏡，用于對(duì)光束進(jìn)行準(zhǔn)直；5為聲光調(diào)制器，用于對(duì)光束的開閉進(jìn)行控制以及將光束調(diào)制為一階衍射光，聲光調(diào)制器通過控制單元的脈沖信號(hào)發(fā)生卡141進(jìn)行控制；6為螺旋相位片用于將第二波長(zhǎng)光束調(diào)制為空心光束；反射鏡10、雙色片7-1、7-2、7-3用于對(duì)三束泵浦光進(jìn)行合束將其照射到待成像目標(biāo)9上；8物鏡用于進(jìn)一步將合束后的光聚焦到待成像目標(biāo)9上；7-3雙色片與11濾波片為了對(duì)熒光中的泵浦光進(jìn)行分離得到純度較高的熒光；熒光經(jīng)過凸透鏡12與4聚焦到單光子探測(cè)器13上進(jìn)行熒光的收集；單光子探測(cè)器收集到一個(gè)熒光光子，便將發(fā)出一個(gè)TTL脈沖信號(hào)，TTL信號(hào)被控制單元14的數(shù)據(jù)采集卡 142記錄，從而得到熒光強(qiáng)度數(shù)值。

電荷態(tài)的壽命較長(zhǎng)，通?？蛇_(dá)到秒量級(jí)，因此可以使用功率較低的光束控制電荷態(tài)。而受激輻射耗盡技術(shù)中，需要控制的是熒光材料的激發(fā)態(tài)，其壽命僅為幾個(gè)納秒，自發(fā)輻射速率較大。為了實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光強(qiáng)度的控制，其激光泵浦的受激輻射耗盡速率需要大于其自發(fā)輻射速率。受激輻射耗盡的激光功率較高，通常達(dá)到上百毫瓦；相反本實(shí)用新型的激光功率僅需幾毫瓦便可獲得較高的分辨率。因637和532 納米激光均能用作成像的初始化光或轉(zhuǎn)化光，有兩種實(shí)現(xiàn)超分辨成像的方案。

請(qǐng)參閱圖7，以637納米激光為初始化光，532納米光為轉(zhuǎn)化光實(shí)現(xiàn)超分辨成像：

對(duì)于每一個(gè)像素點(diǎn)的熒光測(cè)量，首先用一束功率為2毫瓦的637 納米高斯光束將NV初始化到NV⁰，光束的持續(xù)時(shí)間可為10微秒；然后用30毫瓦的532納米空心光束將除光束中心以外的NV的電荷態(tài)轉(zhuǎn)化為NV^-，光束的持續(xù)時(shí)間也可為10微秒；最后用40微瓦的589納米高斯光束泵浦，并用單光子計(jì)數(shù)器測(cè)量NV^-電荷態(tài)對(duì)應(yīng)的光子數(shù)?！俺跏蓟?轉(zhuǎn)化-探測(cè)”序列循環(huán)50毫秒，然后通過壓電平移臺(tái)控制NV 待成像目標(biāo)進(jìn)行移動(dòng)，測(cè)量下一個(gè)像素點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。由于光束中心的NV始終處于NV⁰態(tài)，而探測(cè)的是NV^-態(tài)的熒光，最后得到的圖像中每個(gè)暗點(diǎn)代表一個(gè)NV。在這樣的泵浦條件下，得到的單個(gè)NV的分辨率達(dá)約為25納米，遠(yuǎn)低于350納米左右的衍射極限。

請(qǐng)參閱圖8，以532納米激光為初始化光，637納米激光為轉(zhuǎn)化光實(shí)現(xiàn)超分辨成像：

首先用一束功率為2毫瓦的532納米高斯光束將NV初始化NV^-，光束的持續(xù)時(shí)間可為10微秒；然后用30毫瓦的637納米空心光束將除光束中心以外的NV的電荷態(tài)轉(zhuǎn)化為NV⁰，光束的持續(xù)時(shí)間為10 微秒；最后用40微瓦的589納米高斯光束泵浦，并測(cè)量NV^-電荷態(tài)輻射的光子數(shù)。每一個(gè)像素點(diǎn)的熒光測(cè)量時(shí)間同樣為50毫秒。由于光束中心的NV處于NV^-電荷態(tài)，最后得到的圖像中每個(gè)亮點(diǎn)代表一個(gè)NV。在這樣的泵浦條件下，得到的單個(gè)NV的分辨率達(dá)約為45納米，同樣遠(yuǎn)低于衍射極限。

由上可知，本實(shí)用新型實(shí)施例使用低功率連續(xù)光泵浦，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)待成像目標(biāo)的超分辨顯微成像，而且不影響待成像目標(biāo)的性質(zhì)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，不需要對(duì)激光脈沖做精準(zhǔn)的時(shí)序同步，故光學(xué)與電子系統(tǒng)結(jié)構(gòu)也相較簡(jiǎn)單，使用和組裝更加方便，節(jié)省了操作成本和費(fèi)用成本，提高了用戶的使用體驗(yàn)。

請(qǐng)參閱圖9，圖9為本實(shí)用新型實(shí)施例提供的光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)的工作流程示意圖，本實(shí)用新型實(shí)施例可包括以下內(nèi)容：

S901：利用第一波長(zhǎng)光束照射待成像目標(biāo)，以使所述待成像目標(biāo)的分子初始化為第一電荷態(tài)；

S902：利用第二波長(zhǎng)空心光束照射所述待成像目標(biāo)，以使所述待成像目標(biāo)第一預(yù)設(shè)位置范圍內(nèi)分子轉(zhuǎn)化為第二電荷態(tài)；

S903：利用第三波長(zhǎng)光束照射所述待成像目標(biāo)第二預(yù)設(shè)位置范圍內(nèi)的分子，以輻射熒光信號(hào)；

S904：根據(jù)所述待成像目標(biāo)輻射的熒光信號(hào)的光強(qiáng)信息對(duì)所述待成像目標(biāo)進(jìn)行成像。

由上可知，本實(shí)用新型實(shí)施例使用低功率連續(xù)光泵浦，不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)待成像目標(biāo)的超分辨顯微成像，而且不影響待成像目標(biāo)的性質(zhì)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，不需要對(duì)激光脈沖做精準(zhǔn)的時(shí)序同步，故光學(xué)與電子系統(tǒng)結(jié)構(gòu)也相較簡(jiǎn)單，使用和組裝更加方便，節(jié)省了操作成本和費(fèi)用成本，提高了用戶的使用體驗(yàn)。

專業(yè)人員還可以進(jìn)一步意識(shí)到，結(jié)合本文中所公開的實(shí)施例描述的各示例的單元及算法步驟，能夠以電子硬件、計(jì)算機(jī)軟件或者二者的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)，為了清楚地說明硬件和軟件的可互換性，在上述說明中已經(jīng)按照功能一般性地描述了各示例的組成及步驟。這些功能究竟以硬件還是軟件方式來執(zhí)行，取決于技術(shù)方案的特定應(yīng)用和設(shè)計(jì)約束條件。專業(yè)技術(shù)人員可以對(duì)每個(gè)特定的應(yīng)用來使用不同方法來實(shí)現(xiàn)所描述的功能，但是這種實(shí)現(xiàn)不應(yīng)認(rèn)為超出本實(shí)用新型的范圍。

結(jié)合本文中所公開的實(shí)施例描述的方法或算法的步驟可以直接用硬件、處理器執(zhí)行的軟件模塊，或者二者的結(jié)合來實(shí)施。軟件模塊可以置于隨機(jī)存儲(chǔ)器(RAM)、內(nèi)存、只讀存儲(chǔ)器(ROM)、電可編程 ROM、電可擦除可編程ROM、寄存器、硬盤、可移動(dòng)磁盤、CD-ROM、或技術(shù)領(lǐng)域內(nèi)所公知的任意其它形式的存儲(chǔ)介質(zhì)中。

以上對(duì)本實(shí)用新型所提供的光學(xué)超分辨顯微成像系統(tǒng)進(jìn)行了詳細(xì)介紹。本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本實(shí)用新型的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說明只是用于幫助理解本實(shí)用新型的方法及其核心思想。應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本實(shí)用新型原理的前提下，還可以對(duì)本實(shí)用新型進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也落入本實(shí)用新型權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。