本發(fā)明涉及信號(hào)增強(qiáng)劑，更詳細(xì)而言，涉及基于α1-6巖藻糖糖鏈與α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)的信號(hào)的增強(qiáng)劑。

背景技術(shù)：

已知α1-6巖藻糖轉(zhuǎn)移酶(α1-6fuct)的基因伴隨肝細(xì)胞的癌變而表達(dá)，所述α1-6巖藻糖轉(zhuǎn)移酶使α1-6巖藻糖(也稱為核心巖藻糖(corefucose))轉(zhuǎn)移至n連接型糖鏈的還原末端n-乙酰葡糖胺上。變?yōu)楦渭?xì)胞癌之后，巖藻糖將介由α1-6鍵轉(zhuǎn)移至被稱為α甲胎蛋白(afp)的糖蛋白(分子量約為70,000)的糖鏈的n-乙酰葡糖胺上。該介由α1-6鍵而轉(zhuǎn)移有巖藻糖的afp現(xiàn)已被用作肝細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物。對(duì)受檢者的血清實(shí)施使用了與巖藻糖具有親和性的小扁豆凝集素(lca)的凝集素親和電泳時(shí)，將自陽極側(cè)依次出現(xiàn)被稱為afp-l1、afp-l2、afp-l3的3條條帶。在肝硬化等良性肝病中，凝集素非結(jié)合型的afp-l1條帶為主體，若變?yōu)楦渭?xì)胞癌，則凝集素結(jié)合型的afp-l3條帶將增加。如果求出afp-l3相對(duì)于總afp的比例(afp-l3％)且其值大于10％，則懷疑是肝細(xì)胞癌。若能夠準(zhǔn)確地識(shí)別介由α1-6鍵而轉(zhuǎn)移有巖藻糖的afp的比例，則肝細(xì)胞癌診斷的準(zhǔn)確度也會(huì)進(jìn)一步提高。

已知α1-6巖藻糖除了與肝癌有關(guān)以外，還與胰腺癌、大腸癌等疾病有關(guān)。

以往，作為與α1-6巖藻糖具有親和性的凝集素，小扁豆凝集素(lca)、豌豆凝集素(psa)、橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(aleuriaaurantialectin，aal)、黃水仙凝集素(npa)、蠶豆凝集素(vfa)、米曲霉凝集素(aol)等是已知的。但是，aal、aol與α1-2巖藻糖、α1-3巖藻糖等也具有親和性，lca、psa及vfa與不具有巖藻糖α1-6的n連接型單叉及/或雙叉糖鏈也具有親和性，這樣，這些凝集素對(duì)于除了α1-6巖藻糖糖鏈以外的、具有α1-6鍵以外的巖藻糖的糖脂系糖鏈或不具有巖藻糖的高甘露糖型糖鏈也顯示出親和性。

作為較之以往已知的上述凝集素而言以更高的特異性檢測(cè)α1-6巖藻糖糖鏈的凝集素，本申請(qǐng)的發(fā)明人已從天然的菇類中新發(fā)現(xiàn)了翅鱗傘(pholiotasquarrosa)凝集素(phosl)(非專利文獻(xiàn)1)、大球蓋菇(strophariarugosoannulata)凝集素(srl)(專利文獻(xiàn)1)等凝集素。并且，還進(jìn)行了這些凝集素的化學(xué)合成、重組體制備(專利文獻(xiàn)4及5)。此外，使用這些凝集素，在對(duì)afp-l3的檢測(cè)(專利文獻(xiàn)1)、對(duì)大腸癌的惡化程度的辨別(專利文獻(xiàn)2)、及對(duì)胰腺癌的檢測(cè)(專利文獻(xiàn)3)方面也取得了成功。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：日本專利4514163(巖藻糖α1→6特異性凝集素)

專利文獻(xiàn)2：日本專利5263979(大腸癌的辨別方法)

專利文獻(xiàn)3：日本專利4900983(胰腺癌的檢測(cè)方法)

專利文獻(xiàn)4：日本特開2011-148736(肽)

專利文獻(xiàn)5：日本特開2011-148735(基因)

非專利文獻(xiàn)

非專利文獻(xiàn)1：yukakobayashi等，“anovelcorefucose-specificlectinfromthemushroompholiotasquarrosa”，j.biol.chem,2012,287,p33973-33982

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明要解決的課題

通過本申請(qǐng)的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的α1-6巖藻糖特異性凝集素，得以實(shí)現(xiàn)了對(duì)α1-6巖藻糖糖鏈的特異性檢測(cè)。而如果能夠增強(qiáng)基于α1-6巖藻糖糖鏈與α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)的信號(hào)，則可以實(shí)現(xiàn)對(duì)α1-6巖藻糖糖鏈的準(zhǔn)確檢測(cè)。因此，本發(fā)明的目的在于提供對(duì)基于α1-6巖藻糖糖鏈與能和其結(jié)合的α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)的信號(hào)加以強(qiáng)化的信號(hào)增強(qiáng)劑。

用于解決課題的手段

本申請(qǐng)的發(fā)明人對(duì)上述課題進(jìn)行了銳意研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過以下的發(fā)明即能夠解決上述課題，從而完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供一種信號(hào)增強(qiáng)劑，其增強(qiáng)基于α1-6巖藻糖糖鏈與能和其結(jié)合的α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)的信號(hào)，所述增強(qiáng)劑的特征在于，以選自由脲及硫脲組成的組中的至少一種作為有效成分。上述所謂“α1-6巖藻糖糖鏈”的術(shù)語，在本說明書中是指“巖藻糖介由α1-6鍵鍵合于n型糖鏈的還原末端n-乙酰葡糖胺而形成的結(jié)構(gòu)”。另外，上述所謂“α1-6巖藻糖特異性凝集素”的術(shù)語，在本說明書中是指“具有下述特征的凝集素：(1)對(duì)于α1-6巖藻糖糖鏈具有結(jié)合常數(shù)為1.0×10⁴m^-1以上(25℃時(shí))的親和性、且(2)與不含α1-6巖藻糖的高甘露糖型糖鏈及/或不含α1-6巖藻糖的糖脂糖鏈實(shí)質(zhì)上不結(jié)合”。

日本特開2010-145202中公開了增強(qiáng)抗原抗體反應(yīng)的方法，所述方法中，使抗原與抗體在聚乙二醇及脲的共存下進(jìn)行反應(yīng)。而本發(fā)明的信號(hào)增強(qiáng)劑所應(yīng)用的反應(yīng)并非抗原抗體反應(yīng)，而是α1-6巖藻糖糖鏈與能和其結(jié)合的α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)，另外，在不需要聚乙二醇這一點(diǎn)上與日本特開2010-145202的發(fā)明明顯不同。

本發(fā)明還提供增強(qiáng)基于α1-6巖藻糖糖鏈與能和其結(jié)合的α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)的信號(hào)的方法，所述方法包括以下步驟：在以選自由脲及硫脲組成的組中的至少一種作為有效成分的信號(hào)增強(qiáng)劑的存在下，使所述糖鏈與所述凝集素反應(yīng)。

本發(fā)明還提供增強(qiáng)基于α1-6巖藻糖糖鏈與能和其結(jié)合的α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)的信號(hào)的方法，所述方法包括以下步驟：利用包含信號(hào)增強(qiáng)劑的洗滌液對(duì)上述糖鏈進(jìn)行洗滌的步驟，所述信號(hào)增強(qiáng)劑以選自由脲及硫脲組成的組中的至少一種作為有效成分；以及，使上述糖鏈與上述凝集素反應(yīng)的步驟。

本發(fā)明還提供α1-6巖藻糖糖鏈的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含信號(hào)增強(qiáng)劑，以下述物質(zhì)為有效成分：選自由脲及硫脲組成的組中的至少一種，以及，α1-6巖藻糖特異性凝集素。

發(fā)明效果

本發(fā)明的信號(hào)增強(qiáng)劑必須含有選自由脲及硫脲組成的組中的至少一種(以下稱為脲等)，如后述的實(shí)施例中所示，所述信號(hào)增強(qiáng)劑可使α1-6巖藻糖糖鏈與能和其結(jié)合的α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)敏化，從而能夠強(qiáng)化基于該反應(yīng)的信號(hào)。如后述的比較例1所示，上述脲等不會(huì)使不具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖鏈(例如轉(zhuǎn)鐵蛋白)與α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)敏化。另外，如比較例2所示，上述脲等不會(huì)使具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖鏈與對(duì)α1-6巖藻糖具有親和性但并非特異性的凝集素(例如aal)的反應(yīng)敏化。上述脲等也不會(huì)使具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖鏈與對(duì)α1-6巖藻糖不具有親和性的凝集素(例如，荊豆凝集素1(uea-1)、百脈根(lotuscorniculatus)凝集素(lotus)、刀豆凝集素(cona)等)的反應(yīng)敏化(數(shù)據(jù)未示出)。因此，含有上述脲等的本發(fā)明的信號(hào)增強(qiáng)劑適合于α1-6巖藻糖糖鏈與α1-6巖藻糖特異性凝集素的特異性反應(yīng)。

利用本發(fā)明的信號(hào)增強(qiáng)劑，能夠準(zhǔn)確地對(duì)α1-6巖藻糖糖鏈進(jìn)行測(cè)定。這極大地有助于對(duì)與α1-6巖藻糖糖鏈相關(guān)的疾病的檢測(cè)和判定、α1-6巖藻糖糖鏈的學(xué)術(shù)研究。

附圖說明

圖1為示出在脲的存在下及不存在脲的條件下對(duì)α1-6巖藻糖特異性凝集素與各種糖蛋白之間的反應(yīng)值(s-n)進(jìn)行調(diào)查而得到的結(jié)果的柱形圖。柱形圖左側(cè)示出不存在脲的條件下的結(jié)果，并且右側(cè)示出存在5m脲的條件下的結(jié)果。在脲的存在下，phosl對(duì)于具有α1-6巖藻糖糖鏈的fhp、afp-l3及igg中任一者的反應(yīng)性均增加。另一方面，對(duì)于不屬于α1-6巖藻糖糖鏈的tf的反應(yīng)性即使在脲的存在下也沒有變化。

圖2為示出在脲的存在下及不存在脲的條件下對(duì)α1-6巖藻糖特異性凝集素(phosl、phosl肽及srl)、或具有α1-6巖藻糖親和性但并非α1-6巖藻糖特異性的凝集素(aal)與fhp之間的反應(yīng)值(s-n)進(jìn)行調(diào)查而得到的結(jié)果的柱形圖。柱形圖左側(cè)示出不存在脲的條件下的結(jié)果，并且右側(cè)示出存在5m脲的條件下的結(jié)果。所有α1-6巖藻糖特異性凝集素與fhp的反應(yīng)值(s-n)在脲的存在下均增大。另一方面，雖然具有α1-6巖藻糖親和性但并非特異性的aal與fhp的反應(yīng)值(s-n)即使在脲的存在下也沒有增大。

圖3是在脲及巖藻糖的存在下(實(shí)施例7)、或脲及甲狀腺球蛋白的存在下(實(shí)施例8)對(duì)phosl與fhp的反應(yīng)進(jìn)行調(diào)查而得到的柱形圖。巖藻糖或甲狀腺球蛋白濃度依賴性地阻礙了脲存在下的phosl與fhp的反應(yīng)。這表明phosl與fhp的α1-6巖藻糖特異性結(jié)合同脲有關(guān)。

圖4是在變更共存的脲濃度的情況下對(duì)fhp與phosl的反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定而得到的反應(yīng)值(s-n)的圖。根據(jù)圖4可知，在脲濃度為1～9m時(shí)，信號(hào)被增強(qiáng)至1.2～2.8倍。

圖5是在變更共存的硫脲濃度的情況下對(duì)fhp與phosl的反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定而得到的反應(yīng)值(s-n)的圖。根據(jù)圖5可知，在硫脲濃度為0.1～1.5m時(shí)，信號(hào)被增強(qiáng)至1.2～4.1倍。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的信號(hào)增強(qiáng)劑的特征在于，其增強(qiáng)基于α1-6巖藻糖糖鏈與能和其結(jié)合的α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)的信號(hào)，所述信號(hào)增強(qiáng)劑含有選自由脲及硫脲組成的組中的至少一種。

信號(hào)增強(qiáng)劑中的脲濃度通常可為1～9m，優(yōu)選為2.5～9m，進(jìn)一步優(yōu)選為3～8m，特別優(yōu)選為3.5～7m。另外，信號(hào)增強(qiáng)劑中的硫脲濃度通?？蔀?.1～1.5m，優(yōu)選為0.6～1.5m，進(jìn)一步優(yōu)選為0.8～1.5m，特別優(yōu)選為1～1.4m。

信號(hào)增強(qiáng)劑中的上述脲等優(yōu)選溶解在溶劑中進(jìn)行使用。溶劑的例子可舉出：水；磷酸緩沖化生理鹽水、tris緩沖化生理鹽水等生理鹽水；磷酸緩沖液、tris緩沖液等緩沖液；溶解有牛血清白蛋白等蛋白質(zhì)的緩沖液、其水溶液；以及包含tween-20(吐溫-20)等表面活性劑的緩沖液、其水溶液。

信號(hào)增強(qiáng)劑的ph通常為4～10，優(yōu)選為5～9。

上述所謂α1-6巖藻糖糖鏈，是指巖藻糖介由α1-6鍵鍵合于n型糖鏈的還原末端n-乙酰葡糖胺而形成的結(jié)構(gòu)，只要為n連接型糖鏈，則包含所有游離的寡糖鏈、糖肽、糖蛋白、細(xì)胞等。另外，也包含如進(jìn)行標(biāo)記那樣對(duì)寡糖鏈等進(jìn)行化學(xué)修飾而得到的產(chǎn)物。上述n連接型的糖鏈可為高甘露糖型、復(fù)合型、雜合型等。此外，上述糖鏈還可以是：上述糖鏈被酸、肼等以化學(xué)方式部分性地分解而得到的糖鏈；同時(shí)或分步使用唾液酸酶、半乳糖苷酶、n-乙酰氨基己糖苷酶、切割α1-2巖藻糖·α1-3巖藻糖·α1-4巖藻糖的巖藻糖苷酶、甘露糖苷酶中的任一種酶，將上述糖鏈部分地分解而得到的糖鏈。另外，也可以是在上述糖鏈上加成葡萄糖這樣的糖、乙酰基、硫酸基、磷酸基這樣的官能團(tuán)等而得到的糖鏈。

巖藻糖α1-6糖鏈的代表例如下所示。

[化學(xué)式1]

〔式中，man表示甘露糖，glcnac表示n-乙酰葡糖胺，fuc表示巖藻糖〕

α1-6巖藻糖糖鏈的特別優(yōu)選的具體例為afp-l3、巖藻糖基化結(jié)合珠蛋白等腫瘤標(biāo)志物。

α1-6巖藻糖特異性凝集素的特征在于，與現(xiàn)有的對(duì)α1-6巖藻糖糖鏈具有親和性的凝集素(例如aal)相比，其以更高的特異性與α1-6巖藻糖糖鏈結(jié)合。該特征可通過(1)對(duì)于α1-6巖藻糖糖鏈的結(jié)合常數(shù)的下限、和(2)對(duì)于不含α1-6巖藻糖的高甘露糖型糖鏈及/或不含α1-6巖藻糖的糖脂糖鏈的結(jié)合常數(shù)的上限來定義。即，α1-6巖藻糖特異性凝集素的特征在于：

(1)對(duì)于α1-6巖藻糖糖鏈具有結(jié)合常數(shù)為1.0×10⁴m^-1以上(25℃時(shí))的親和性；

(2)與不含α1-6巖藻糖糖鏈的高甘露糖型糖鏈及/或不含α1-6巖藻糖的糖脂糖鏈實(shí)質(zhì)上不結(jié)合。

在本說明書中，上述結(jié)合常數(shù)是指使用例如前沿親和色譜(fac法)于分析溫度25℃進(jìn)行測(cè)定而得到的數(shù)值。fac法的詳細(xì)信息記載于例如由本申請(qǐng)人提出申請(qǐng)的專利文獻(xiàn)1中?；趨⒖嫉哪康?，將專利文獻(xiàn)1并入本說明書中。

α1-6巖藻糖特異性凝集素的(1)對(duì)于α1-6巖藻糖糖鏈的結(jié)合常數(shù)(25℃時(shí))優(yōu)選為5.0×10⁴m^-1以上，更優(yōu)選為1.0×10⁵m^-1以上，進(jìn)一步優(yōu)選為1.0×10⁶m^-1以上。

在本說明書中，α1-6巖藻糖特異性凝集素的所謂“(2)與不含α1-6巖藻糖糖鏈的高甘露糖型糖鏈及/或不含α1-6巖藻糖糖鏈的糖脂糖鏈實(shí)質(zhì)上不結(jié)合”，是指對(duì)于不含α1-6巖藻糖糖鏈的高甘露糖型糖鏈及/或不含α1-6巖藻糖的糖脂糖鏈的結(jié)合常數(shù)(25℃時(shí))通常為1.0×10³m^-1以下，優(yōu)選為1.0×10²m^-1以下，特別優(yōu)選為0。

α1-6巖藻糖特異性凝集素的利用sds電泳法測(cè)得的分子量通常為4,000～40,000，優(yōu)選為4,000～20,000。此處，利用sds電泳法測(cè)得的分子量是按照例如laemmi的方法(nature，227卷，680頁，1976年)進(jìn)行測(cè)定而得到的。α1-6巖藻糖特異性凝集素可以是由通常為2～10個(gè)、優(yōu)選為2～6個(gè)、進(jìn)一步優(yōu)選為2～3個(gè)的亞單位(subunit)結(jié)合而形成的。

α1-6巖藻糖特異性凝集素對(duì)于在非還原末端具有唾液酸的α1-6巖藻糖糖鏈也具有高的親和性。另一方面，lca、npa及psa對(duì)于在非還原末端具有唾液酸的α1-6巖藻糖糖鏈的親和性較低。

對(duì)于α1-6巖藻糖特異性凝集素而言，其還對(duì)于結(jié)合有α1-6巖藻糖的n連接型的單叉、雙叉、三叉及/或四叉糖鏈具有結(jié)合常數(shù)(25℃時(shí))優(yōu)選為1.0×10⁴m^-1以上、更優(yōu)選為5.0×10⁴m^-1以上、進(jìn)一步優(yōu)選為1.0×10⁵m^-1以上的親和性。

α1-6巖藻糖特異性凝集素可從天然物質(zhì)中提取及/或純化。來自天然物質(zhì)的α1-6巖藻糖特異性凝集素的獲得方法詳細(xì)記載于由本申請(qǐng)人提出申請(qǐng)的專利文獻(xiàn)1、及由本申請(qǐng)人投稿的非專利文獻(xiàn)1中。需要說明的是，專利文獻(xiàn)1中記載的土生鱗傘(pholiotaterrestris)凝集素(ptl)替換記載為翅鱗傘凝集素(phosl)。以下，對(duì)從天然物質(zhì)中獲得的α1-6巖藻糖特異性凝集素進(jìn)行簡(jiǎn)要說明。

上述天然物質(zhì)為例如擔(dān)子菌、子囊菌等菇類。球蓋菇科、口蘑科、多孔菌科及捕蠅蕈科屬于擔(dān)子菌。作為球蓋菇科，可舉出翅鱗傘、土生鱗傘、大球蓋菇、亞磚紅沿絲傘(naematolomasublateritium)、金毛鱗傘(pholiotaaurivella)、多脂鱗傘(pholiotaadiposa)等。作為口蘑科，可舉出花臉香蘑(lepistasordida)等。作為多孔菌科，可舉出勺形囊孔菌(trichaptumelongatum)、褐扇小孔菌(microporusvernicipes)等。作為捕蠅蕈科，可舉出毒蠅傘(amanitamuscaria)等。

這些擔(dān)子菌或子囊菌中，從凝集素的α1-6巖藻糖糖鏈識(shí)別特異性和凝集素的回收效率的觀點(diǎn)考慮，特別優(yōu)選球蓋菇科、口蘑科或捕蠅蕈科，進(jìn)一步優(yōu)選翅鱗傘、土生鱗傘、金毛鱗傘、大球蓋菇、亞磚紅沿絲傘、花臉香蘑或毒蠅傘。

α1-6巖藻糖特異性凝集素優(yōu)選為來源于擔(dān)子菌的凝集素，更優(yōu)選為翅鱗傘凝集素(phosl)、土生鱗傘凝集素(ptl)、大球蓋菇凝集素(srl)、亞磚紅沿絲傘凝集素(nsl)、花臉香蘑凝集素(lsl)、及毒蠅傘凝集素(aml)，進(jìn)一步優(yōu)選為phosl、ptl、srl、nsl及aml。

對(duì)于上述α1-6巖藻糖特異性凝集素，可通過將已知的提取方法、分離方法、純化方法等適宜組合來從例如擔(dān)子菌、子囊菌中分離。例如，包括使用水性介質(zhì)作為提取溶劑從而得到擔(dān)子菌及/或子囊菌的水性介質(zhì)提取物的工序。上述擔(dān)子菌及/或子囊菌的使用部位優(yōu)選為子實(shí)體。由上述提取物得到下述凝集素：所述凝集素的利用sds電泳法而得到的分子量通常為4,000～40,000，優(yōu)選為4,000～20,000，以及，對(duì)于α1-6巖藻糖糖鏈具有結(jié)合常數(shù)(25℃時(shí))通常為1.0×10⁴m^-1以上、優(yōu)選為5.0×10⁴m^-1以上、更優(yōu)選為1.0×10⁵m^-1以上、進(jìn)一步優(yōu)選為1.0×10⁶m^-1以上的親和性。

此外，對(duì)于α1-6巖藻糖特異性凝集素而言，除了從上述天然物質(zhì)中提取以外，也可以是基于天然來源的凝集素的氨基酸序列進(jìn)行化學(xué)合成而得到的肽、蛋白質(zhì)。進(jìn)而，化學(xué)合成的肽、蛋白質(zhì)還可以是將天然來源的凝集素(例如包含本說明書所附序列號(hào)1的氨基酸序列的phosl)的氨基酸序列中的1個(gè)或多個(gè)氨基酸以賴氨酸及/或精氨酸取代、且具有糖結(jié)合活性的肽(例如包含本說明書所附序列號(hào)2的氨基酸序列的phosl肽)。其合成方法詳細(xì)記載于由本申請(qǐng)人提出申請(qǐng)的專利文獻(xiàn)4中?；趨⒖嫉哪康模瑢＠墨I(xiàn)4的說明書并入本說明書。

此外，對(duì)于α1-6巖藻糖特異性凝集素而言，除了從上述天然物質(zhì)中提取以外，也可以是使用編碼天然來源的凝集素的氨基酸序列的核酸、在與天然來源不同的已知宿主內(nèi)進(jìn)行人工表達(dá)而得到的重組體(例如實(shí)施例18中所示的phosl重組凝集素)。重組體的表達(dá)方法詳細(xì)記載于專利文獻(xiàn)5中。基于參考的目的，將由本申請(qǐng)人提出申請(qǐng)的專利文獻(xiàn)5的說明書并入本說明書。

對(duì)于α1-6巖藻糖特異性凝集素而言，優(yōu)選組入有能夠進(jìn)行檢測(cè)的標(biāo)記手段。作為上述標(biāo)記手段，沒有特別限制，可應(yīng)用已知的標(biāo)記方法，例如，可舉出利用放射性同位素的標(biāo)記、標(biāo)記化合物的結(jié)合等。作為上述放射性同位素，可舉出例如¹⁴c、³h及³²p。

作為上述標(biāo)記化合物，例如可舉出酶標(biāo)記(辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)、生物素標(biāo)記、地高辛標(biāo)記、熒光標(biāo)記(異硫氰酸熒光素、cydye(注冊(cè)商標(biāo))、4-氨基苯甲酸乙酯(abee)、氨基吡啶、別藻藍(lán)蛋白、藻紅蛋白等)等。這些標(biāo)記化合物可利用常規(guī)方法與凝集素結(jié)合。從靈敏度高的觀點(diǎn)考慮，特別優(yōu)選生物素標(biāo)記。

本發(fā)明還提供增強(qiáng)基于α1-6巖藻糖糖鏈與能和其結(jié)合的α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)的信號(hào)的方法，所述方法包括以下步驟：在以選自由脲及硫脲組成的組中的至少一種作為有效成分的信號(hào)增強(qiáng)劑的存在下，使上述糖鏈與上述凝集素反應(yīng)。

上述反應(yīng)步驟中的脲濃度通常可為1～9m，優(yōu)選為2.5～9m，進(jìn)一步優(yōu)選為3～8m，特別優(yōu)選為3.5～7m。另外，上述反應(yīng)步驟中的硫脲濃度通?？蔀?.1～1.5m，優(yōu)選為0.6～1.5m，進(jìn)一步優(yōu)選為0.8～1.5m，特別優(yōu)選為1～1.4m。

本發(fā)明還提供增強(qiáng)基于α1-6巖藻糖糖鏈與能和其結(jié)合的α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)的信號(hào)的方法，所述方法包括以下步驟：利用包含信號(hào)增強(qiáng)劑的洗滌液對(duì)上述糖鏈進(jìn)行洗滌的步驟，所述信號(hào)增強(qiáng)劑以選自由脲及硫脲組成的組中的至少一種作為有效成分；以及，使上述糖鏈與上述凝集素反應(yīng)的步驟。

上述洗滌液中的脲濃度通常可為1～9m，優(yōu)選為2.5～9m，進(jìn)一步優(yōu)選為3～8m，特別優(yōu)選為3.5～7m。另外，上述洗滌液中的硫脲濃度通常可為0.1～1.5m，優(yōu)選為0.6～1.5m，進(jìn)一步優(yōu)選為0.8～1.5m，特別優(yōu)選為1～1.4m。另外，使上述糖鏈與上述凝集素反應(yīng)的步驟可在以選自由脲及硫脲組成的組中的至少一種作為有效成分的信號(hào)增強(qiáng)劑的存在下進(jìn)行。

上述方法中，對(duì)與α1-6巖藻糖特異性凝集素反應(yīng)后的α1-6巖藻糖糖鏈進(jìn)行檢測(cè)的手段沒有特別限制。作為檢測(cè)手段，例如，可使用elisa(直接吸附法、夾心法、及競(jìng)爭(zhēng)法)、凝集素親和色譜法、凝集素染色、凝集素芯片、流式細(xì)胞術(shù)(facs)、凝集法、表面等離子共振法(例如，biacore(注冊(cè)商標(biāo))系統(tǒng))、電泳、微珠(bead)等。以下，對(duì)幾種代表性的檢測(cè)方法進(jìn)行簡(jiǎn)要說明。

直接吸附elisa法中，將血液等待測(cè)試樣添加至平板(plate)中進(jìn)行固定。接著，將經(jīng)過生物素標(biāo)記的凝集素與信號(hào)增強(qiáng)劑一同添加，使糖鏈與凝集素在信號(hào)增強(qiáng)劑的存在下反應(yīng)?；蛘撸部上忍砑影盘?hào)增強(qiáng)劑的洗滌液，在棄置后添加不包含信號(hào)增強(qiáng)劑的凝集素溶液。添加hrp(辣根過氧化物酶)標(biāo)記鏈親和素的溶液作為2次標(biāo)記化合物，使生物素與鏈親和素反應(yīng)。接著，添加hrp用顯色底物使其顯色，用吸光光度計(jì)測(cè)定顯色強(qiáng)度。若預(yù)先利用含有已知濃度的糖鏈的標(biāo)準(zhǔn)試樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，則還可確定糖鏈的量。

夾心elisa法中，將能與具有α1-6巖藻糖糖鏈的抗原結(jié)合的抗體添加至平板中進(jìn)行固定，然后添加血清等待測(cè)試樣。接著，將經(jīng)過生物素標(biāo)記的凝集素與信號(hào)增強(qiáng)劑一同添加，使糖鏈與凝集素在信號(hào)增強(qiáng)劑的存在下反應(yīng)?；蛘?，也可先添加包含信號(hào)增強(qiáng)劑的洗滌液，在棄置后添加不包含信號(hào)增強(qiáng)劑的凝集素溶液。添加hrp(辣根過氧化物酶)標(biāo)記鏈親和素的溶液作為2次標(biāo)記化合物，使生物素與鏈親和素反應(yīng)。接著，添加hrp用顯色底物使其顯色，用吸光光度計(jì)測(cè)定顯色強(qiáng)度。若預(yù)先利用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)試樣繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，則還可對(duì)α1-6巖藻糖糖鏈進(jìn)行定量。

凝集素親和色譜法是利用固定于載體的凝集素與糖鏈特異性結(jié)合的性質(zhì)的親和色譜法。通過與hplc組合，可期待實(shí)現(xiàn)高通量。

作為固定凝集素的載體，通常為瓊脂糖、葡聚糖、纖維素、淀粉、聚丙烯酰胺等凝膠材料。對(duì)于這些載體，可不受特別限制地使用市售的材料，例如可舉出sepharose4b、sepharose6b(均為gehealthcarebioscienceco.,ltd.制)。作為用于凝集素色譜的柱，也包含將凝集素固定于微孔板、納米孔(nanowell)而得到的柱。

固定的凝集素的濃度通常為0.001～100mg/ml，優(yōu)選為0.01～20mg/ml。載體為瓊脂糖凝膠的情況下，將其用cnbr等進(jìn)行活化后，與凝集素偶聯(lián)(coupling)。也將凝集素固定于導(dǎo)入有活化間隔基團(tuán)(activationspacer)的凝膠。此外，也可在將凝集素固定于導(dǎo)入有甲酰基的凝膠后用nacnbh3還原。另外，還可使用nhs-sepharose(gehealthcarebioscienceco.,ltd.制)這樣的市售活化凝膠。

將待測(cè)試樣與信號(hào)增強(qiáng)劑一同供于柱后，基于洗滌的目的使緩沖液流過?；蛘撸诰彌_液中已添加信號(hào)增強(qiáng)劑的狀態(tài)下將待測(cè)試樣供于柱。作為緩沖液的一例，有以下緩沖液：摩爾濃度通常為5～500mm，優(yōu)選為10～500mm，ph通常為4.0～10.0，優(yōu)選為6.0～9.0，nacl的含量通常為0～0.5m，優(yōu)選為0.1～0.2m，cacl2、mgcl2、或mncl2的含量通常為0～10mm，優(yōu)選為0～5mm的緩沖液。

對(duì)親和層析柱進(jìn)行洗滌后，在能夠有效地洗脫糖鏈的中性的非改性緩沖液中，使用氯化鈉、半抗原糖等脫附劑(desorbent)進(jìn)行糖鏈的洗脫。該緩沖液可以與上述相同。脫附劑的濃度優(yōu)選為1～500mm，特別優(yōu)選為10～200mm的濃度。洗脫緩沖液中優(yōu)選不包含信號(hào)增強(qiáng)劑。

凝集素染色中，從腫瘤組織中切出待測(cè)試樣薄片，將該薄片貼合于玻璃板上。將板浸入封閉緩沖液中，于室溫緩緩進(jìn)行攪拌。適當(dāng)進(jìn)行內(nèi)源性過氧化物酶的滅活。將板浸入含有信號(hào)增強(qiáng)劑的生物素標(biāo)記凝集素溶液(用封閉緩沖液將該生物素標(biāo)記凝集素溶液稀釋為2～5μg/ml)中，于室溫緩緩攪拌1小時(shí)?；蛘?，也可先添加包含信號(hào)增強(qiáng)劑的洗滌液，在棄置洗滌液后添加不包含信號(hào)增強(qiáng)劑的凝集素溶液。將板浸入hrp標(biāo)記抗生物素蛋白(avidin)溶液中，于室溫緩緩攪拌。將板浸入顯色液中，于室溫使其顯色數(shù)分鐘。在能充分地確認(rèn)到顯色后用水洗滌，終止反應(yīng)。用光學(xué)顯微鏡觀察顯色的組織。凝集素染色可使用市售的凝集素染色試劑盒來進(jìn)行。

facs法中，將細(xì)胞(待測(cè)試樣)懸浮于磷酸緩沖化生理鹽水(pbs)中。使用安裝有21g的針、容量為2.5ml的注射器，用力抽吸10次左右，使細(xì)胞分散，然后使用50μm的篩對(duì)細(xì)胞進(jìn)行過濾。將經(jīng)過熒光標(biāo)記的凝集素的溶液和信號(hào)增強(qiáng)劑一同加入到這樣制備的細(xì)胞中，使細(xì)胞與凝集素在信號(hào)增強(qiáng)劑的存在下結(jié)合。或者，也可先添加包含信號(hào)增強(qiáng)劑的洗滌液，在棄置洗滌液后添加不包含信號(hào)增強(qiáng)劑的凝集素溶液。然后，使用流式細(xì)胞儀(例如，beckmancoulter,inc.制cytomicsfc500)，對(duì)結(jié)合有凝集素的細(xì)胞的量、比例進(jìn)行分析。

對(duì)于用于上述檢測(cè)手段的待測(cè)試樣沒有特別限制。例如，可舉出血液、血漿、血清、淚液、唾液、體液、乳汁、尿液、細(xì)胞的培養(yǎng)上清液、來自轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的分泌物等。

本發(fā)明還提供α1-6巖藻糖糖鏈的檢測(cè)試劑盒，其包含以選自由脲及硫脲組成的組中的至少一種作為有效成分的信號(hào)增強(qiáng)劑、及α1-6巖藻糖特異性凝集素。

檢測(cè)試劑盒可適當(dāng)包含各種標(biāo)記化合物、緩沖液、平板、微珠、反應(yīng)終止液等在檢測(cè)試劑盒中通用的組成。檢測(cè)試劑盒優(yōu)選還包含用于從得自生物體血液的待測(cè)試樣中提取具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖蛋白的試劑(例如，抗結(jié)合珠蛋白抗體、抗α甲胎蛋白抗體等抗體、蛋白a、蛋白g、蛋白l等免疫球蛋白結(jié)合蛋白質(zhì))。

本發(fā)明的α1-6巖藻糖糖鏈檢測(cè)試劑盒的用途只要是基于檢測(cè)α1-6巖藻糖糖鏈的目的則沒有特別限定。以下，對(duì)其具體例子進(jìn)行說明。

對(duì)afp-l3條帶(經(jīng)核心巖藻糖轉(zhuǎn)移的α甲胎蛋白的條帶)的高準(zhǔn)確度檢測(cè)作為肝硬化并發(fā)肝細(xì)胞癌的早期臨床診斷、肝細(xì)胞癌的周密病程觀察、治療效果的準(zhǔn)確判定、胚胎瘤的早期發(fā)現(xiàn)、急性重型肝炎的肝臟再生的指標(biāo)等是有用的。另外，作為肝癌診斷的指標(biāo)，經(jīng)核心巖藻糖轉(zhuǎn)移的α5β1整合素也被期待。

在惡性程度低的大腸癌、其原發(fā)癌中，包括核心巖藻糖在內(nèi)的所有巖藻糖均增加。另一方面，在惡性程度高的大腸癌、其轉(zhuǎn)移癌中，存在α1-6鍵合巖藻糖減少的趨勢(shì)。因此，通過使α1-6巖藻糖特異性凝集素作用于在初步篩選中被診斷為大腸癌的患者的大腸癌腫瘤組織，并對(duì)α1-6鍵合巖藻糖的量進(jìn)行調(diào)查，由此能夠辨別惡性程度高的大腸癌、轉(zhuǎn)移癌。

成為胰腺癌后，會(huì)生成在作為糖蛋白的結(jié)合珠蛋白上加成核心巖藻糖而形成的巖藻糖基化結(jié)合珠蛋白。該巖藻糖基化結(jié)合珠蛋白伴隨胰腺癌的病程進(jìn)展而增加，并在摘除胰腺癌的腫瘤部位后消失。通過使得在α1-6巖藻糖特異性凝集素與巖藻糖基化結(jié)合珠蛋白的反應(yīng)中共存有本發(fā)明的信號(hào)增強(qiáng)劑，能夠提高利用α1-6巖藻糖特異性凝集素的檢測(cè)靈敏度。另外，也可以利用包含信號(hào)增強(qiáng)劑的洗滌液對(duì)巖藻糖基化結(jié)合珠蛋白進(jìn)行洗滌，然后在棄置洗滌液之后添加不包含信號(hào)增強(qiáng)劑的凝集素溶液。此外，根據(jù)使用了α1-6巖藻糖特異性凝集素和抗結(jié)合珠蛋白抗體的分析，能夠迅速且簡(jiǎn)便地檢測(cè)胰腺癌。此外，通過將胰腺癌標(biāo)志物ca19-9的抗體和α1-6巖藻糖特異性凝集素組合，能夠辨別胰腺癌和胰腺炎。此時(shí)，在共存有本發(fā)明的信號(hào)增強(qiáng)劑的情況下，辨別將會(huì)更加容易。

對(duì)于本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒而言，除了用于上述疾病的診斷、研究以外，還期待將其用于以下疾病的診斷、研究：前列腺癌、乳腺癌、胃癌、小腸癌、結(jié)腸直腸癌、腎細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞癌、子宮癌、卵巢癌、甲狀腺癌、軟組織肉瘤、骨肉瘤、黑素瘤、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、星形細(xì)胞瘤、髓母細(xì)胞瘤、急性淋巴瘤、惡性淋巴瘤、霍奇金病(hodgkin’sdisease)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病(acutemyelogenousleukemia)、慢性淋巴性白血病等腫瘤；變應(yīng)性疾病；自身免疫性疾病；以及肺氣腫等循環(huán)器官疾病。

實(shí)施例

以下給出本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明更詳細(xì)地進(jìn)行說明。但是，本發(fā)明不限于以下的實(shí)施例。

本發(fā)明中使用的試劑按照以下的步驟制備。

(1)磷酸緩沖化生理鹽水(pbs)

稱量5.75g磷酸氫二鈉(和光純藥公司制)、1.0g磷酸二氫鉀(和光純藥公司制)、1.0g氯化鉀(和光純藥公司制)、40.0g氯化鈉(和光純藥公司制)，加入400ml水溶解后，移至量筒中，用水定容至500ml，制成10倍濃度的磷酸緩沖化生理鹽水(10×pbs)。將10×pbs用水稀釋為10倍，制備pbs。

(2)1％牛血清白蛋白(bsa)/pbs

稱量1g的bsa(和光純藥公司制)，溶解于100ml的pbs中從而進(jìn)行制備。

(3)0.05％tween/pbs

相對(duì)于5l的pbs而言，添加2.5ml聚氧乙烯山梨糖醇酐單月桂酸酯(tween20，nacalaitesque,inc.制)。

(4)生物素標(biāo)記phosl

作為α1-6巖藻糖特異性凝集素，按照非專利文獻(xiàn)1中記載的方法，從翅鱗傘中提純翅鱗傘凝集素(phosl，序列號(hào)1)。量取該翅鱗傘凝集素，添加0.1m碳酸氫鈉溶液使其溶解(濃度：5mg/ml)。將生物素化試劑(sigma公司制；型號(hào)：b2643)溶解于二甲基亞砜中，添加至凝集素溶液并使其反應(yīng)。通過超濾(3k的膜，millipore公司制)，用水對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行溶劑置換，進(jìn)行冷凍干燥，得到生物素標(biāo)記phosl。

(5)生物素標(biāo)記phosl肽

基于專利文獻(xiàn)4的實(shí)施例6的記載(其中，將專利文獻(xiàn)4的ptl替換記載為phosl)，合成phosl肽(序列號(hào)2)。經(jīng)由與生物素標(biāo)記phosl相同的步驟，對(duì)該凝集素進(jìn)行生物素標(biāo)記。

(6)生物素標(biāo)記srl

按照專利文獻(xiàn)2中記載的方法，提取srl(序列號(hào)3)。經(jīng)由與生物素標(biāo)記phosl相同的步驟，對(duì)該凝集素進(jìn)行生物素標(biāo)記。

(7)生物素標(biāo)記橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(生物素標(biāo)記aal)

準(zhǔn)備生物素標(biāo)記橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素(j-oilmills,inc.制)。

將(4)～(6)的α1-6巖藻糖特異性凝集素(標(biāo)記前)的序列表示于表1。

[表1]

序列號(hào)1的第10及17位的x可以是任意的氨基酸殘基，優(yōu)選為cys，第20、23、27、33、35及39位的x分別為tyr/ser、phe/tyr、arg/lys/asn、asp/gly/ser、asn/ala、及thr/gln。

對(duì)于序列號(hào)2而言，在序列號(hào)1的具體例(apvpvtklvcdgdtykctayldfgdgrwvaqwdtnvfhtg)中，第1位的ala、第20位的tyr、及第39位的thr被lys取代，另外，第40位的gly缺失。

序列號(hào)3的第10及17位的x可以是任意的氨基酸殘基，優(yōu)選為cys，第4、7、9、13、20、27、29、33、34及39位的x分別為pro/gly、glu/lys、val/asp、asn/asp/glu、his/ser、lys/his、val/ile、gly/asn/ser、ala/thr、及arg/thr。

〔實(shí)施例1～3〕信號(hào)增強(qiáng)試驗(yàn)(1)

通過直接吸附elisa法，使具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖蛋白與α1-6巖藻糖特異性凝集素在脲的存在下或不存在脲的條件下反應(yīng)，對(duì)基于糖鏈與凝集素的結(jié)合反應(yīng)的信號(hào)是否增強(qiáng)進(jìn)行了調(diào)查。具體的步驟如下。

作為具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖蛋白，準(zhǔn)備了巖藻糖基化結(jié)合珠蛋白(以下稱為“fhp”)、α-甲胎蛋白l3(以下稱為“afp-l3”)、小鼠免疫球蛋白g(sigma公司制，以下稱為“igg”)。基于比較目的，還準(zhǔn)備了轉(zhuǎn)鐵蛋白(sigma公司制，以下稱為“tf”)作為并非α1-6巖藻糖糖鏈的糖蛋白。fhp及afp-l3的制備方法如下。

(1)fhp溶液的制備

按照常規(guī)方法培養(yǎng)胰腺癌細(xì)胞株(psn-1，從dspharmabiomedicalco.,ltd.獲得)，得到培養(yǎng)上清液。用超濾過濾器(制品名：vivaspin20‐10k，sartoriusag制)將1000ml培養(yǎng)上清液濃縮為1ml。向上述濃縮液中添加0.5ml下述凝膠，所述凝膠是將抗結(jié)合珠蛋白抗體(thebindingsiteltd.制)固定于nhs活化瓊脂糖凝膠4ff(nhs-activatedsepharose4fastflow)(gehealthcarebioscienceco.,ltd.制)而得到的。于室溫每隔10分鐘進(jìn)行混和，1小時(shí)后，將包含上述凝膠的溶液添加至0.45μm過濾器微量管(millipore公司制)中，以400×g、溫度4℃的條件離心5分鐘，棄置濾液。接著，添加200μl的pbs，以400×g、溫度4℃的條件離心5分鐘，棄置濾液。重復(fù)進(jìn)行2次上述操作。接著，添加200μl洗脫緩沖液(elutionbuffer)(100mm甘氨酸，0.5mnacl，ph3.0)，以400×g、溫度4℃的條件離心5分鐘，回收濾液。重復(fù)進(jìn)行2次上述操作。用3n的naoh對(duì)將這些濾液合并而得到的溶液進(jìn)行中和，然后添加600μl的pbs，得到fhp溶液。進(jìn)一步用pbs稀釋該fhp溶液，制備1000ng/ml的fhp溶液。

(2)afp-l3溶液的制備

按照常規(guī)方法培養(yǎng)肝癌細(xì)胞株(hepg2，從理化學(xué)研究所獲得)，得到培養(yǎng)上清液。用超濾過濾器(制品名：vivaspin20‐10k，sartoriusag制)將1000ml培養(yǎng)上清液濃縮為1ml。向上述濃縮液中添加0.5ml下述凝膠，所述凝膠是將抗afp抗體(dako公司制)固定于nhs活化瓊脂糖凝膠4ff(gehealthcarebioscienceco.,ltd.制)而得到的。于室溫每隔10分鐘進(jìn)行混和，1小時(shí)后，將包含上述凝膠的溶液添加至0.45μm過濾器微量管(millipore公司制)中，以400×g、溫度4℃的條件離心5分鐘，棄置濾液。接著，添加200μl的pbs，以400×g、溫度4℃的條件離心5分鐘，棄置濾液。重復(fù)進(jìn)行2次上述操作。接著，添加200μl洗脫緩沖液(100mm甘氨酸，0.5mnacl，ph3.0)，以400×g、溫度4℃的條件離心5分鐘，回收濾液。重復(fù)進(jìn)行2次上述操作。用3n的naoh對(duì)將這些濾液合并而得到的溶液進(jìn)行中和，然后添加600μl的pbs，得到afp-l3溶液。進(jìn)一步用pbs稀釋該afp-l3溶液，制備1000ng/ml的afp-l3溶液。

(3)igg及tf溶液的制備

將igg及tf分別用pbs溶解，制備5000ng/ml的igg溶液、及5000ng/ml的tf溶液。

直接吸附elisa法的步驟如下所示。

(1)抗原固定化

向微量滴定板(greinerbio-onegmbh制)的孔中添加50μl的fhp、afp-l3、igg或tf的上述溶液，于4℃放置16小時(shí)后，棄置添加的液體。

(2)洗滌

向各孔中添加250μl的0.05％tween/pbs，棄置添加的液體。

(3)封閉

向各孔中添加200μl的1％bsa/pbs，于37℃放置1小時(shí)后，棄置添加的液體。

(4)洗滌

向各孔中添加250μl的0.05％tween/pbs，棄置添加的液體。共重復(fù)3次該操作。

(5)凝集素反應(yīng)

用1％bsa/pbs稀釋生物素標(biāo)記phosl，然后添加脲(和光純藥公司制)，制備凝集素溶液(生物素標(biāo)記phosl的最終濃度為1μg/ml，脲的最終濃度為5m)。向孔中添加50μl該凝集素溶液，于4℃放置30分鐘后，棄置添加的液體。作為對(duì)照，對(duì)未添加脲的凝集素溶液(生物素標(biāo)記phosl的最終濃度為1μg/ml，脲為0m)也進(jìn)行同樣的反應(yīng)。

(6)洗滌

向各孔中添加250μl的0.05％tween/pbs，棄置添加的液體。共重復(fù)3次該操作。

(7)hrp標(biāo)記鏈親和素反應(yīng)

向孔中添加50μl的hrp標(biāo)記鏈親和素溶液(vector公司制，制備成1μg/mlpbs)，于室溫放置30分鐘后，棄置添加的液體。

(8)洗滌

向各孔中添加250μl的0.05％tween/pbs，棄置添加的液體。共重復(fù)3次該操作。

(9)顯色反應(yīng)

向孔中添加50μl的hrp用顯色底物(制品名：tmb過氧化物酶底物系統(tǒng)，kpl公司制)，于室溫放置5分鐘。

(10)反應(yīng)終止

添加50μl的1m磷酸，終止反應(yīng)。

使用平板讀取器(platereader)(制品名：powerscan(注冊(cè)商標(biāo))ht，dspharma公司制)，測(cè)定波長(zhǎng)450nm及630nm處的吸光度。將從450nm處的吸光度值中減去630nm處的吸光度值而得到的值作為檢測(cè)值(信號(hào)：s)。同樣地，測(cè)定未添加糖蛋白的孔的檢測(cè)值(背景噪音(noise)：n)，將從檢測(cè)值(s)中減去孔自身的檢測(cè)值(n)而得到的值作為反應(yīng)值(s-n)脲5m。另外，也求出在不存在脲的條件下使凝集素與糖蛋白反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)脲0m。

信號(hào)的增大量及增大率分別利用以下的數(shù)學(xué)式求出。

[數(shù)學(xué)式1]

信號(hào)增大量＝(s-n)脲5m-(s-n)脲om

[數(shù)學(xué)式2]

將phosl對(duì)于各種糖蛋白的反應(yīng)值(s-n)示于表2及圖1。

[表2]

(s-n)脲0m：在不存在脲的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

(s-n)脲5m：在5m脲的存在下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

根據(jù)表2及圖1可知，就基于在脲存在下的fhp、afp-l3或igg與phosl的反應(yīng)的信號(hào)而言，與不存在脲的情況相比，信號(hào)增大量及信號(hào)增大率均顯著增大。另一方面，就基于并非α1-6巖藻糖糖鏈的tf與phosl的反應(yīng)的信號(hào)而言，雖然信號(hào)增大率高，但信號(hào)增大量并沒有顯著增大。

〔實(shí)施例4～6〕信號(hào)增強(qiáng)試驗(yàn)(2)

通過夾心elisa法，在脲的存在下或不存在脲的條件下，使作為具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖蛋白的fhp與各種α1-6巖藻糖特異性凝集素進(jìn)行反應(yīng)，對(duì)基于糖蛋白與凝集素的結(jié)合反應(yīng)的信號(hào)是否增強(qiáng)進(jìn)行了調(diào)查。具體的步驟如下。

作為α1-6巖藻糖特異性凝集素，使用了生物素標(biāo)記phosl、生物素標(biāo)記phosl肽、及生物素標(biāo)記srl。基于比較目的，使用了也能與具有α1-6以外的巖藻糖的糖鏈結(jié)合的生物素標(biāo)記aal。

夾心elisa法的步驟如下所示。

(1)抗體固定化

將除去糖鏈后的抗結(jié)合珠蛋白抗體(nipponbio-testlaboratoriesinc.制)用pbs稀釋為5μg/ml，向微量滴定板(greinerbio-onegmbh制)的各孔中分別添加50μl，于4℃放置16小時(shí)后，棄置添加的液體。

(2)洗滌

向各孔中添加250μl的0.05％tween/pbs，棄置添加的液體。

(3)封閉

向各孔中添加200μl的1％bsa/pbs，于37℃放置1小時(shí)后，棄置添加的液體。

(4)洗滌

向各孔中添加250μl的0.05％tween/pbs，棄置添加的液體。共重復(fù)3次該操作。

(5)抗原抗體反應(yīng)

向各孔中添加50μl用1％bsa/pbs稀釋而得到的200ng/ml的fhp，于室溫放置1小時(shí)后，棄置添加的液體。

(6)洗滌

向各孔中添加250μl的0.05％tween/pbs，棄置添加的液體。共重復(fù)3次該操作。

(7)凝集素反應(yīng)

用1％bsa/pbs溶液稀釋生物素標(biāo)記phosl、生物素標(biāo)記phosl肽、生物素標(biāo)記srl或生物素標(biāo)記aal，然后添加脲(和光純藥公司制)，制備各凝集素溶液(生物素標(biāo)記凝集素的最終濃度為1μg/ml，脲的最終濃度為5m)。向孔中添加50μl該凝集素溶液，于4℃放置30分鐘后，棄置添加的液體。作為對(duì)照，對(duì)未添加脲的凝集素溶液(生物素標(biāo)記凝集素的最終濃度為1μg/ml，脲為0m)也進(jìn)行同樣的反應(yīng)。

(8)洗滌

向各孔中添加250μl的0.05％tween/pbs，棄置添加的液體。共重復(fù)3次該操作。

(9)hrp標(biāo)記鏈親和素反應(yīng)

向孔中添加50μl的hrp標(biāo)記鏈親和素溶液(1μg/ml)，于室溫放置30分鐘后，棄置添加的液體。

(10)洗滌

向各孔中添加250μl的0.05％tween/pbs，棄置添加的液體。共重復(fù)3次該操作。

(11)顯色反應(yīng)

向孔中添加50μl的hrp用顯色底物(制品名：tmb過氧化物酶底物系統(tǒng)，kpl公司制)，于室溫放置5分鐘。

(12)反應(yīng)終止

添加50μl的1m磷酸，終止反應(yīng)。

使用上述平板讀取器，與實(shí)施例1同樣地測(cè)定波長(zhǎng)450nm及630nm處的吸光度，進(jìn)而求出反應(yīng)值(s-n)脲5m。并且，求出在不存在脲的條件下使凝集素與糖蛋白反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)脲0m。將在脲存在下和不存在脲的條件下的反應(yīng)值(s-n)、其增大量及增大率示于表3及圖2。

[表3]

(s-n)脲0m：在不存在脲的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

(s-n)脲5m：在5m脲的存在下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

根據(jù)圖2及表3可知，較之不存在脲的情況而言，在5m(最終濃度)脲的存在下，phosl、phosl肽或srl與fhp的反應(yīng)的信號(hào)增大量及信號(hào)增大率均顯著改善。另一方面，對(duì)于也能與α1-6巖藻糖以外的巖藻糖結(jié)合的aal而言，即使在反應(yīng)體系中添加脲，信號(hào)也沒有增強(qiáng)。

如實(shí)施例1～6所示，本發(fā)明的信號(hào)增強(qiáng)劑能夠?qū)讦?-6巖藻糖糖鏈與能和其結(jié)合的α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)的信號(hào)加以強(qiáng)化。脲不會(huì)使不具有α1-6巖藻糖糖鏈的轉(zhuǎn)鐵蛋白與α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)敏化(比較例1)。脲也不會(huì)使具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖鏈與具有α1-6巖藻糖親和性但并非特異性的aal的反應(yīng)敏化(比較例2)。脲不會(huì)使α1-6巖藻糖糖鏈與不具有α1-6巖藻糖親和性的uea-1、lotus、cona等的反應(yīng)敏化(數(shù)據(jù)未示出)。根據(jù)以上結(jié)果，可得出結(jié)論，由本發(fā)明的信號(hào)增強(qiáng)劑實(shí)現(xiàn)的信號(hào)增強(qiáng)是僅在α1-6巖藻糖糖鏈與α1-6巖藻糖特異性凝集素的反應(yīng)中發(fā)生的現(xiàn)象。

〔實(shí)施例7～8〕信號(hào)增強(qiáng)作用的阻礙試驗(yàn)

為了調(diào)查本發(fā)明的信號(hào)增強(qiáng)劑的信號(hào)增大效果是否來自于α1-6巖藻糖糖鏈與α1-6巖藻糖特異性凝集素的特異性結(jié)合，使用夾心elisa法進(jìn)行了阻礙試驗(yàn)(inhibitiontest)。

實(shí)施例7中，使在5m脲的存在下的fhp與phosl的反應(yīng)中共存有最終濃度為20mm或100mm的巖藻糖(nacalaitesque,inc.制)。實(shí)施例8中，代替實(shí)施例7的巖藻糖，使反應(yīng)中共存有最終濃度為0.01mg/ml或0.1mg/ml的甲狀腺球蛋白(sigma公司制，以下稱為“tg”)。已知使作為單糖的巖藻糖以20～100mm左右的濃度共存時(shí)，fhp與phosl的糖鏈特異性結(jié)合會(huì)受到阻礙。另外，已知具有α1-6巖藻糖糖鏈的tg也同樣地能夠阻礙fhp與phosl的糖鏈特異性結(jié)合。

與實(shí)施例1同樣地，使用上述平板讀取器測(cè)定波長(zhǎng)450nm及630nm處的吸光度，進(jìn)而求出反應(yīng)值(s-n)。將添加巖藻糖或tg時(shí)的檢測(cè)結(jié)果示于圖3。

根據(jù)圖3可知，反應(yīng)值(s-n)伴隨巖藻糖或tg的添加濃度的增大而降低。由此確認(rèn)到，基于凝集素與糖蛋白的結(jié)合的信號(hào)在脲的存在下增大的效果是由于α1-6巖藻糖特異性凝集素與α1-6巖藻糖糖鏈的特異性結(jié)合而產(chǎn)生的。

〔實(shí)施例9〕脲濃度的變更試驗(yàn)

通過夾心elisa法，調(diào)查作為信號(hào)增強(qiáng)劑的脲的優(yōu)選范圍。在實(shí)施例4中使用fhp(50ng/ml)，以及使脲在凝集素溶液中的最終濃度為0～9m，除此以外，按照與實(shí)施例4相同的步驟實(shí)施試驗(yàn)。

與實(shí)施例1同樣地操作，使用上述平板讀取器測(cè)定波長(zhǎng)450nm及630nm處的吸光度，進(jìn)而求出反應(yīng)值(s-n)。將脲的各最終濃度下的、相對(duì)于未添加脲時(shí)的信號(hào)增大率示于圖4。

根據(jù)圖4可知，在最終濃度為1～9m的脲的存在下，信號(hào)被增強(qiáng)至1.2～2.8倍。脲的最終濃度優(yōu)選為3～9m，進(jìn)一步優(yōu)選為3～8m，特別優(yōu)選為3～7m。

〔實(shí)施例10～11〕使用硫脲的試驗(yàn)

通過直接吸附elisa法，使具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖蛋白(fhp或afp-l3)與α1-6巖藻糖特異性凝集素(phosl)在硫脲的存在下或不存在硫脲的條件下反應(yīng)，對(duì)基于糖鏈與凝集素的結(jié)合反應(yīng)的信號(hào)是否增強(qiáng)進(jìn)行了調(diào)查。除了以1.2m硫脲(和光純藥公司制)代替實(shí)施例1中的5m脲以外，按照與實(shí)施例1相同的步驟實(shí)施試驗(yàn)。

根據(jù)得到的吸光度，與實(shí)施例1同樣地求出反應(yīng)值(s-n)。另外，也求出在不存在硫脲的條件下使凝集素與糖蛋白反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)。

信號(hào)的增大量及增大率分別利用以下的數(shù)學(xué)式求出。

[數(shù)學(xué)式3]

信號(hào)增大量＝(s-n)硫脲1.2m-(s-n)硫脲0m

[數(shù)學(xué)式4]

將phosl對(duì)于各種糖蛋白的反應(yīng)值(s-n)示于表4。

[表4]

(s-n)硫脲0m：在不存在硫脲的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

(s-n)硫脲1.2m：在1.2m硫脲的存在下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

就基于fhp及afp-l3與phosl在硫脲存在下的反應(yīng)的信號(hào)而言，與不存在硫脲的情況相比，信號(hào)增大量及信號(hào)增大率均顯著增大。

〔實(shí)施例12〕硫脲濃度的變更試驗(yàn)

通過夾心elisa法，調(diào)查作為信號(hào)增強(qiáng)劑的硫脲的優(yōu)選范圍。使用硫脲代替實(shí)施例4中的脲，并使硫脲在凝集素溶液中的最終濃度為0～1.5m，除此以外，按照與實(shí)施例4相同的步驟實(shí)施試驗(yàn)。

與實(shí)施例1同樣地操作，使用上述平板讀取器測(cè)定波長(zhǎng)450nm及630nm處的吸光度，進(jìn)而求出反應(yīng)值(s-n)。與實(shí)施例10同樣地，求出硫脲的各最終濃度下的、相對(duì)于不存在硫脲時(shí)的信號(hào)增大率，將其結(jié)果示于圖5。

根據(jù)圖5可知，在最終濃度為0.1～1.5m的硫脲的存在下，信號(hào)被增強(qiáng)至1.2～4.1倍。硫脲的最終濃度通常可為0.1～1.5m，優(yōu)選為0.6～1.5m，進(jìn)一步優(yōu)選為0.8～1.5m，特別優(yōu)選為1～1.4m。

〔實(shí)施例13～14〕向洗滌液中添加信號(hào)增強(qiáng)劑的試驗(yàn)

通過夾心elisa法，添加具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖蛋白(fhp)后，用含有脲或硫脲的溶液進(jìn)行洗滌，棄置溶液后，使其與凝集素溶液反應(yīng)，對(duì)基于糖鏈與凝集素的結(jié)合反應(yīng)的信號(hào)是否增強(qiáng)進(jìn)行了調(diào)查。

具體而言，相對(duì)于實(shí)施例4中“(6)洗滌”的洗滌液(0.05％tween/pbs)，添加最終濃度為5m的脲或最終濃度為1.2m的硫脲，并且，不向“(7)凝集素反應(yīng)”的凝集素溶液中添加脲，除此以外，按照與實(shí)施例4相同的步驟實(shí)施試驗(yàn)。

使用上述平板讀取器，與實(shí)施例1同樣地測(cè)定波長(zhǎng)450nm及630nm處的吸光度，進(jìn)而求出反應(yīng)值(s-n)。此外，與上述同樣地算出向洗滌液中添加脲或硫脲的情況下的、相對(duì)于未添加脲及硫脲時(shí)的信號(hào)增大量及增大率，將其示于表5。

[表5]

(s-n)0m：在不存在脲及硫脲的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

(s-n)脲5m:在5m脲的存在下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

(s-n)硫脲1.2m：在1.2m硫脲的存在下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

由表5可以判明，在利用含有脲或硫脲的洗滌液對(duì)具有α1-6巖藻糖糖鏈的糖蛋白進(jìn)行洗滌后，使其與α1-6巖藻糖特異性凝集素反應(yīng)時(shí)，也能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)基于糖鏈與凝集素的結(jié)合反應(yīng)的信號(hào)的增強(qiáng)。

〔實(shí)施例15～17〕

與翅鱗傘凝集素同樣地，從土生鱗傘、亞磚紅沿絲傘及毒蠅傘中提純土生鱗傘凝集素(ptl)、亞磚紅沿絲傘凝集素(nsl)、及毒蠅傘凝集素(aml)。經(jīng)由與生物素標(biāo)記phosl相同的步驟對(duì)得到的凝集素進(jìn)行生物素標(biāo)記，得到生物素標(biāo)記ptl、生物素標(biāo)記nsl及生物素標(biāo)記aml。

除了將生物素標(biāo)記phosl置換為生物素標(biāo)記ptl、生物素標(biāo)記nsl或生物素標(biāo)記aml以外，通過與實(shí)施例4相同的方法實(shí)施夾心elisa。將結(jié)果示于表6。

[表6]

(s-n)脲0m：在不存在脲的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

(s-n)脲5m：在5m脲的存在下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

如表6所示，可知在脲的存在下，任一種α1-6巖藻糖特異性凝集素的信號(hào)均被增強(qiáng)。

〔實(shí)施例18〕使用了微珠的檢測(cè)方法

按照磁性微珠(invitrogencorporation制，14204)的說明書，將除去糖鏈后的抗結(jié)合珠蛋白抗體固定，由此制備抗體固定化磁性微珠。

按照常規(guī)方法實(shí)施使用了微珠的檢測(cè)。具體而言，將巖藻糖基化結(jié)合珠蛋白(fhp)(最終濃度：0μg/ml或0.45μg/ml)、脲(最終濃度為0m或5m)、序列號(hào)4所示的phosl重組凝集素(向?qū)＠墨I(xiàn)5：日本特開2011-148735的序列號(hào)1中添加dykdddk標(biāo)簽而得到的凝集素，最終濃度為5μg/ml)混合，形成復(fù)合體。將包含復(fù)合體的上述溶液稀釋成10倍，添加抗體固定化磁性微珠，使用磁石洗滌后，添加hrp標(biāo)記抗flag抗體(sigma公司制)，與檢測(cè)抗體形成復(fù)合體。使用上述hrp用顯色底物，使其顯色，使用1m磷酸終止顯色反應(yīng)。與上述同樣地用平板讀取器測(cè)定得到的溶液的吸光度。

將從fhp存在下的450nm處的吸光度值中減去630nm處的吸光度值而得到的值作為檢測(cè)值(信號(hào)：s)，同樣地求出在不存在fhp的條件下的檢測(cè)值(背景噪音：n)。將從5m脲存在下的檢測(cè)值(s)中減去孔自身的檢測(cè)值(n)而得到的值作為反應(yīng)值(s-n)脲5m。另外，同樣地求出不存在脲時(shí)的反應(yīng)值(s-n)脲0m。另外，將用5m脲存在下的檢測(cè)值s除以檢測(cè)值n而得到的值作為反應(yīng)值(s/n)脲5m。同樣地求出不存在脲時(shí)的反應(yīng)值(s/n)脲0m。與實(shí)施例1同樣地，算出信號(hào)的增大量及增大率。將其結(jié)果示于表7。

[表7]

(s-n)脲0m：在不存在脲的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

(s-n)脲5m：在5m脲的存在下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s-n)

(s/n)脲0m：在不存在脲的條件下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s/n)

(s/n)脲5m：在5m脲的存在下進(jìn)行反應(yīng)時(shí)的反應(yīng)值(s/n)

根據(jù)表7可知，就基于在脲存在下的fhp與重組凝集素的反應(yīng)的信號(hào)而言，與不存在脲的情況相比，信號(hào)增大量及信號(hào)增大率均顯著增大。同樣地，反應(yīng)值(s/n)較之不存在脲的情況而言也顯著增大。確認(rèn)到在使用了微珠的檢測(cè)方法中也能夠得到本發(fā)明的效果。

序列表

<110>j-制油株式會(huì)社

<120>信號(hào)增強(qiáng)劑

<130>np2293pct

<150>jp2015-37717

<151>2015-02-27

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>40

<212>prt

<213>翅鱗傘

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>x表示任意的氨基酸，優(yōu)選cys。

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>x表示任意的氨基酸，優(yōu)選cys。

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>x表示tyr/ser。

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(23)

<223>x表示phe/tyr。

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>x表示arg/lys/asn。

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>x表示asp/gly/ser。

<220>

<221>misc_feature

<222>(35)..(35)

<223>x表示asn/ala。

<220>

<221>misc_feature

<222>(39)..(39)

<223>x表示thr/gln。

<400>1

alaprovalprovalthrlysleuvalxaaaspglyaspthrtyrlys

151015

xaathralaxaaleuaspxaaglyaspglyxaatrpvalalaglnthr

202530

xaathrxaavalphehisxaagly

3540

<210>2

<211>39

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>修飾序列1

<400>2

lysprovalprovalthrlysleuvalcysaspglyaspthrtyrlys

151015

cysthralalysleuasppheglyaspglyargtrpvalalaglntrp

202530

aspthrasnvalphehislys

35

<210>3

<211>39

<212>prt

<213>大球蓋菇

<220>

<221>misc_feature

<222>(4)..(4)

<223>x表示pro/gly。

<220>

<221>misc_feature

<222>(7)..(7)

<223>x表示glu/lys。

<220>

<221>misc_feature

<222>(9)..(9)

<223>x表示val/asp。

<220>

<221>misc_feature

<222>(10)..(10)

<223>x表示任意的氨基酸，優(yōu)選cys。

<220>

<221>misc_feature

<222>(13)..(13)

<223>x表示asn/asp/glu。

<220>

<221>misc_feature

<222>(17)..(17)

<223>x表示任意的氨基酸，優(yōu)選cys。

<220>

<221>misc_feature

<222>(20)..(20)

<223>x表示his/ser。

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>x表示lys/his。

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(29)

<223>x表示val/ile。

<220>

<221>misc_feature

<222>(33)..(33)

<223>x表示gly/asn/ser。

<220>

<221>misc_feature

<222>(34)..(34)

<223>x表示ala/thr。

<220>

<221>misc_feature

<222>(39)..(39)

<223>x表示arg/thr。

<400>3

alaprovalxaavaltyrxaaleuxaaxaaaspglyxaaserthrlys

151015

xaathralaxaaleuasptyrglyaspglyxaatrpxaaalaglntrp

202530

xaaxaaasnvalphehisxaa

35

<210>4

<211>252

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>重組phosl

<400>4

atggccccggtcccggttaccaagctcgtctgcgacggtgacacctacaagtgcaccgcc60

tacttggactacggcgatggaaagtgggtcgctcagtgggacactgccgtcttccacacc120

accgattataaagatcatgatggtgattataaagatcatgatattgattataaagatgat180

gatgataaaggagctccgggcttctcctcaatttccgctcatcaccaccatcatcaccat240

caccaccactaa252

5