本發(fā)明涉及生物檢測技術領域，具體而言，涉及一種金納米粒子探針及其制備方法和應用、檢測PSA的方法。

背景技術：

蛋白質(zhì)是一類最重要的生物大分子，在生物體內(nèi)占有特殊地位。蛋白質(zhì)是細胞中的主要功能分子，在細胞中發(fā)揮多種多樣的功能，涵蓋了細胞生命活動的各個方面。一些與癌癥相關的疾病標志物主要成分是蛋白質(zhì)，可以標記系統(tǒng)、器官、組織、細胞及亞細胞結構或功能的改變或可能發(fā)生的改變的生化指標。例如腫瘤標志物前列腺特異抗原是由前列腺腺泡和導管的上皮細胞分泌的一種單鏈糖蛋白。

前列腺特異性抗原(prostate specific antigen，PSA)是一種由前列腺上皮細胞內(nèi)漿小泡產(chǎn)生、含有237個氨基酸殘基的單鏈糖蛋白。前列腺癌患者血清游離PSA及總PSA值均明顯升高，PSA對于前列腺癌的早期診斷、臨床分期、術后療效觀察及隨訪具有重要的臨床意義。

現(xiàn)有技術中，通常采用質(zhì)譜法、核磁共振波譜法、蛋白質(zhì)芯片檢測分析PSA。但是這些方法有其自身的缺點，如儀器昂貴，前處理過程復雜，對蛋白質(zhì)樣品上樣量要求高等，限制了其在多重和超靈敏檢測方面的應用。蛋白質(zhì)組學的迅速發(fā)展亟需新的更有效的檢測方法，尋找高分辨率、高靈敏度的檢測技術是蛋白質(zhì)組學迅速發(fā)展的保證。臨床上，快速檢測微量蛋白質(zhì)如血清中腫瘤標志物的含量對于疾病的準確診斷具有重要的輔助作用。因此，開發(fā)新的、簡便的微量蛋白質(zhì)的檢測方法具有重要的實際意義。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的之一在于提供一種制備金納米粒子探針的方法，根據(jù)此方法制備的金納米粒子探針，可以檢測微量PSA蛋白。

本發(fā)明的目的之二在于提供一種由上述方法制備的金納米粒子探針，該金納米粒子探針具有良好的光散射性質(zhì)，利用此性質(zhì)可以檢測微量PSA蛋白。

本發(fā)明的目的之三在于提供一種上述金納米粒子探針在檢測PSA蛋白中的應用，應用該金納米粒子探針檢測微量PSA蛋白具有選擇性高、靈敏度高的特點。

本發(fā)明的目的之四在于提供一種檢測PSA蛋白的方法，應用該方法檢測微量PSA蛋白具有選擇性高、靈敏度高、簡便易行的特點。

本發(fā)明解決其技術問題是采用以下技術方案來實現(xiàn)的。

一種制備金納米粒子探針的方法，其包括：向金納米粒子溶液中加入PSA核酸適配體，PSA核酸適配體修飾有用于連接金納米粒子的連接體，PSA核酸適配體的堿基續(xù)列如SEQ ID NO.1所示，經(jīng)攪拌、靜置、離心后，取沉淀，用緩沖溶液分散沉淀，得到金納米粒子探針溶液。

一種金納米粒子探針，其由上述的制備金納米粒子探針的方法制備而成。

上述金納米粒子探針在檢測PSA中的應用。

一種檢測PSA的方法，其包括：

取含有金納米粒子探針的第一溶液，檢測第一溶液的散射光強度，記為I₀；

向第一溶液中加入待測樣本，形成檢測體系，檢測上述檢測體系的散射光強度，記為I₁；

根據(jù)I₁與I₀之間的差值，計算出待測樣本的中的PSA濃度。

本發(fā)明實施例的一種金納米粒子探針及其制備方法和應用、檢測PSA的方法的有益效果是：本發(fā)明提供的制備金納米粒子的制備方法制備的金納米粒子探針具有良好的光散射性質(zhì)。該金納米粒子探針修飾有PSA核酸適配體，該適配體能特異性結合PSA，引起金納米粒子探針發(fā)生聚集，光散射強度增加，從而檢測PSA含量。利用本發(fā)明提供的金納米粒子探針及方法檢測PSA具有選擇性高、靈敏度高、簡便易行的特點。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應被看作是對范圍的限定，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關的附圖。

圖1為本發(fā)明實施例1制得的金納米粒子的TEM圖；

圖2-A本發(fā)明實施例6中加入PSA前后金納米粒子探針溶液變化圖；

圖2-B為本發(fā)明實施例6中加入PSA前后金納米粒子探針的紫外-可見吸收光譜變化曲線圖；

圖3為本發(fā)明實施例6中加入PSA后金納米粒子探針的TEM圖；

圖4為本發(fā)明實施例7中檢測體系中氯化鈉濃度的優(yōu)化圖；

圖5為本發(fā)明實施例8中檢測體系pH的優(yōu)化圖；

圖6為本發(fā)明實施例9中加入不同濃度的PSA后金納米粒子探針的散射光譜變化曲線圖；

圖7為本發(fā)明實施例9中金納米粒子探針檢測PSA的標準曲線。

具體實施方式

為使本發(fā)明實施例的目的、技術方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

下面對本發(fā)明實施例的一種金納米粒子探針及其制備方法與在檢測PSA中的應用及檢測PSA的方法進行具體說明。

一種制備金納米粒子探針分方法，其包括：

向金納米粒子溶液中加入PSA核酸適配體，PSA核酸適配體修飾有用于連接金納米粒子的連接體，PSA核酸適配體的堿基續(xù)列如SEQ ID NO.1所示，經(jīng)攪拌、靜置、離心后，取沉淀，用緩沖溶液分散沉淀，得到金納米粒子探針。

金納米粒子即為直徑為納米級別的金顆粒，被廣泛用于免疫學檢測的標記物或是生物探針。金納米粒子具有良好的光散射性質(zhì)，其散射光強度隨金納米粒子的粒徑增大而增大。

核酸適配體(Aptamer)是一段DNA(脫氧核糖核酸)，RNA(核糖核酸)序列，XNA(核酸類似物)或肽。核酸適配體能與多種目標物質(zhì)高特異性、高選擇性地結合，因此被廣泛應用于生物傳感器領域。與傳統(tǒng)的抗原-抗體反應相比，適配體由DNA或RNA構成(主要是DNA)，比蛋白質(zhì)體積更小，擁有與抗原-抗體反應相匹敵的靈敏度，同時合成更容易，穩(wěn)定性更好。

PSA核酸適配體是一段單鏈DNA，其堿基序列為：

5’-AATTAAAGCTCGCCATCAAATAGC-3’(SEQ ID NO.1)。

PSA核酸適配體能特異性識別PSA，高選擇性地與PSA結合。本發(fā)明將金納米粒子與PSA核酸適配體聯(lián)合用于檢測PSA，其檢測原理是：將金納米粒子表面修飾上PSA核酸適配體，形成金納米粒子探針。PSA核酸適配體特異性地結合PSA，使得金納米粒子探針聚集，粒徑增大，從而使金納米粒子探針的散射光強度增大，PSA在一定濃度范圍內(nèi)，金納米粒子探針的散射光強度增大值與PSA濃度呈線性關系。但是PSA核酸適配體與金納米粒子之間沒有親和性，不能直接連接，所以，需要一個連接體將二者連接。

本發(fā)明中使用的PSA核酸適配體直接修飾有連接體。需要說明的是，連接體可以未修飾于PSA核酸適配體，在制備之前，先將連接體修飾于PSA核酸適配體再行制備過程。

優(yōu)選地，該連接體為聚腺嘌呤。

本發(fā)明中，聚腺嘌呤修飾的PSA核酸適配體由人工合成(上海生工生物工程技術服務有限公司)。聚腺嘌呤為腺嘌呤的聚合物，腺嘌呤為構成DNA的原料。聚腺嘌呤通過堿基間的親和力與PSA核酸適配體連接。聚腺嘌呤與金納米粒子間具有高度親和力，因此，聚腺嘌呤可以將PSA核酸適配體與金納米粒子連接。

優(yōu)選地，聚腺嘌呤的聚合度為10-15。

聚腺嘌呤的聚合度為10-15，即聚腺嘌呤由10-15個腺嘌呤聚合而成。本發(fā)明中的聚腺嘌呤為線性聚合。修飾有聚腺嘌呤(聚合度為15)的PSA核酸適配體的結構為：

AAAAAAAAAAAAAAA-5’-AATTAAAGCTCGCCATCAAATA GC-3’。

優(yōu)選地，上述攪拌為：室溫下，避光磁力攪拌24-48h。

磁力攪拌是為了讓金納米粒子與連接有聚腺嘌呤的PSA核酸適配體有均等的結合機會。

優(yōu)選地，上述靜置時間為24-48h。

靜置的目的是讓金納米粒子與連接有聚腺嘌呤的PSA核酸適配體之間形成穩(wěn)定連接。

優(yōu)選地，上述離心為在10000-15000r/min下，離心20-40min。

優(yōu)選地，所用緩沖液為10mM磷酸緩沖溶液，pH 7.0-7.4。

一種由上述方法制備的金納米粒子探針。

本發(fā)明提供的金納米粒子探針，表面修飾有PSA核酸適配體，并且PSA核酸適配體與金納米粒子之間通過聚腺嘌呤連接。本發(fā)明提供的金納米粒子探針同時具備金納米粒子的光散射性質(zhì)以及PSA核酸適配體高度親和及識別PSA的性質(zhì)，可用于檢測微量PSA。

一種檢測PSA的方法，其包括：

取含有金納米粒子探針的第一溶液，檢測第一溶液的散射光強度，記為I₀。

向第一溶液中加入待測樣本，形成檢測體系，檢測上述檢測體系的散射光強度，記為I₁。

同時，向一系列含有金納米粒子探針的第一溶液中加入不同濃度的PSA標準液制作標準曲線。

根據(jù)I₁與I₀之間的差值，計算出待測樣本的中的PSA濃度。

具體地，根據(jù)加入不同濃度的PSA前后散射光強度的變化值(I₁-I₀)，計算金納米粒子探針散射光強度的變化值與PSA濃度的關系。以PSA濃度為橫坐標，金納米粒子探針散射光強度的變化值為縱坐標，進行線性擬合。

優(yōu)選地，在檢測第一溶液的散射光強度之前，往第一溶液中加入氯化鈉至氯化鈉的濃度為18-30mM。

優(yōu)選地，調(diào)節(jié)檢測體系的pH為6.5-7.5。

以下結合實施例對本發(fā)明的特征和性能作進一步的詳細描述。

實施例1

本實施例提供一種金納米粒子及其制備方法，其包括：

S1：配制100mL 0.01％氯金酸溶液，放置于燒瓶中，并將燒瓶置于油浴鍋中，加熱至煮沸，保持5分鐘以上。

S2：取3.5mL新鮮配制的質(zhì)量百分數(shù)為1％的檸檬酸鈉溶液，將其快速加入到煮沸的氯金酸溶液中，繼續(xù)加熱攪拌，使之反應完全，得到澄清透明的酒紅色溶液。

S3：將酒紅色溶液在13000r/min條件下，離心30分鐘，棄上清液，用超純水分散，繼續(xù)離心，一共離心三次。棄去上清，用100mL超純水分散，得到純凈的金納米粒子溶液。

S4：將制備出的金納米粒子溶液放置于經(jīng)王水浸泡過的容量瓶中，避光放置在冰箱4℃中冷藏備用。

用透射電子顯微鏡(TEM)對上述方法制備得到的金納米粒子進行表征，結果如圖1(箭頭所指為金納米粒子)所示。所制備的金納米粒子分散均勻，粒徑均一，平均粒徑為16nm。

取3mL金納米粒子溶液于兩通比色皿中，在波長為200-700nm范圍內(nèi)掃描并記錄紫外-可見光光譜。實驗測得金納米粒子的紫外-可見光光譜，在520nm波長處有最大吸收。

實施例2

本實施例提供一種金納米粒子探針的制備方法，其包括：

S1：將100μL(10μM)修飾有聚腺嘌呤(聚合度為15)的PSA核酸適配體加入到4mL上述金納米粒子溶液中，室溫避光攪拌使之反應48小時后停止攪拌，靜置穩(wěn)定24小時，得到粗溶液。

S2：將合成出的粗溶液在15000r/min條件下，離心40min。用磷酸緩沖溶液(10mM,pH 7.0)洗滌分散，除去游離的PSA核酸適配體，重復離心三次，最后用磷酸緩沖溶液分散，得到金納米粒子探針的溶液，將金納米粒子探針溶液放入4℃中靜置待用。

實施例3

本實施例提供一種金納米粒子探針的制備方法，其包括：

S1：將100μL(10μM)修飾有聚腺嘌呤(聚合度為13)的PSA核酸適配體加入到4mL上述金納米粒子溶液中，室溫避光攪拌使之反應36小時后停止攪拌，靜置穩(wěn)定24小時，得到粗溶液。

S2：將合成出的粗溶液在13000r/min條件下，離心30min。用磷酸緩沖溶液(10mM,pH 7.2)洗滌分散，除去游離的PSA核酸適配體，重復離心三次，最后用磷酸緩沖溶液分散，得到金納米粒子探針的溶液，將金納米粒子探針溶液放入4℃中靜置待用。

實施例4

本實施例提供一種金納米粒子探針的制備方法，其包括：

S1：將100μL(10μM)修飾有聚腺嘌呤(聚合度為10)的PSA核酸適配體加入到4mL上述金納米粒子溶液中，室溫避光攪拌使之反應24小時后停止攪拌，靜置穩(wěn)定24小時，得到粗溶液。

S2：將合成出的粗溶液在10000r/min條件下，離心20min。用磷酸緩沖溶液(10mM,pH 7.4)洗滌分散，除去游離的PSA核酸適配體，重復離心三次，最后用磷酸緩沖溶液分散，得到金納米粒子探針的溶液，將金納米粒子探針溶液放入4℃中靜置待用。

實施例5

本實施例提供一種由實施例2提供的一種金納米粒子探針的制備方法制備的金納米粒子探針。

本實施例提供的金納米粒子探針，表面修飾有PSA核酸適配體，并且PSA核酸適配體與金納米粒子之間通過聚合度為15的聚腺嘌呤連接。本發(fā)明提供的金納米粒子探針同時具備金納米粒子的光散射性質(zhì)以及PSA核酸適配體高度親和及識別PSA的性質(zhì)，可用于檢測微量PSA。

實施例6

本實施例提供實施例5提供的金納米粒子探針檢測PSA的驗證實驗，其包括：

S1：取金納米粒子探針溶液，檢測其在520nm處的吸收光強度。

S2：另取三分金納米粒子探針溶液，分別加入PSA至終濃度為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL，搖勻，靜置10min，分別檢測加入PSA后的金納米粒子探針溶液在520nm處的吸收光強度。

驗證結果如圖2所示。圖2-A(a為加入PSA前，b為加入PSA后)顯示，加入PSA前，金納米粒子探針溶液為酒紅色。加入PSA后，金納米粒子探針發(fā)生聚集，溶液由酒紅色變?yōu)樽仙?。檢測金納米粒子探針溶液在520nm處的吸收光強度，結果如圖2-B所示。圖2-B(1-4分別表示加入PSA前、加入PSA濃度為5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的吸收光譜)顯示，加入PSA后吸收光強度降低，隨著PSA濃度的增加，吸收光強度降低越明顯。

將金納米粒子射探針加入PSA(5.0ng/mL)后的樣品進行電鏡表征，結果如圖3(箭頭所指為結合PSA后聚集的金納米粒子探針)所示。加入PSA后，金納米粒子探針出現(xiàn)明顯的聚集，表明金納米粒子探針與待測物蛋白PSA發(fā)生相互作用，產(chǎn)生大粒徑的散射粒子。

綜上，本發(fā)明提供的金納米粒子探針由表面修飾有PSA核酸適配體的金納米粒子構成，金納米粒子與PSA適配體之間通過聚腺嘌呤連接。金納米粒子探針兼具金納米粒子的光學性質(zhì)與PSA核酸適配體的特異性識別及結合PSA的功能。金納米粒子探針能識別并特異性結合PSA，引起金納米粒子探針聚集，產(chǎn)生大粒徑的散射粒子，引起散射光信號增強，以此檢測微量PSA。

實施例7

本實施例提供金納米粒子探針檢測PSA的檢測體系的離子強度的優(yōu)化，其包括：

S1：取金納米粒子探針溶液，分別加入氯化鈉至終濃度為2mM、4mM、8mM、12mM、16mM、18mM、20mM、22mM、24mM、28mM、30mM形成不同檢測體系，搖勻，靜置5min，檢測不同檢測體系在422nm處的散射光強度。

S2：向不同檢測體系中加入相同濃度的PSA，搖勻，靜置10min，檢測不同的檢測體系在422nm處的散射光強度。

比較在不同氯化鈉濃度下，加入PSA前后各個檢測體系在422nm處的散射光強度變化值。

結果如圖4所示。氯化鈉濃度在2mM-30mM時，檢測體系的散射光強度變化值隨氯化鈉濃度的增大先增大后減小，并且在20mM處散射光強度變化值最大。即當檢測體系的氯化鈉濃度為20mM時，金納米粒子探針對PSA的檢測最靈敏。

實施例8

本實施例提供金納米粒子探針檢測PSA的檢測體系的pH的優(yōu)化，其包括：

S1：取金納米粒子探針溶液，分別加入10mM磷酸緩沖液至pH為5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10形成不同檢測體系，搖勻，靜置5min，檢測不同檢測體系在422nm處的散射光強度。

S2：向不同檢測體系中加入PSA至PSA濃度相同，搖勻，靜置10min，檢測不同的檢測體系在422nm處的散射光強度。

比較在不同pH下，加入PSA前后各個檢測體系在422nm處的散射光強度變化值。

結果如圖5所示。pH5-10時，檢測體系的散射光強度變化值隨氯化鈉濃度的增大先增大后減小，并且在pH7處散射光強度變化值最大。即當檢測體系的pH為7時，金納米粒子探針對PSA的檢測最靈敏。

實施例9

本實施例提供一種金納米粒子探針檢測PSA的方法，其包括：

S1：取200μL金納米粒子探針溶液7份，加入氯化鈉至濃度為20mM，加入10mM磷酸緩沖液調(diào)節(jié)溶液pH為7形成檢測體系，搖勻，靜置5min，測定檢測體系在422nm波長處的散射光強度，記為I₀。

S2：向各個檢測體系中分別加入不同濃度(0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL)的PSA標準液以及PSA待測樣品，搖勻，靜置10min，測定不同檢測體系在422nm波長處的散射光強度，記為I₁。

根據(jù)加入不同濃度的PSA前后散射光強度的變化值(I₁-I₀)，計算金納米粒子探針散射光強度的變化值與PSA濃度的關系。具體地，以PSA濃度為橫坐標，金納米粒子探針散射光強度的變化值為縱坐標，進行線性擬合。

不同檢測體側的散射光光譜圖如圖6(1-7分別為加入的PSA濃度為0ng/mL、0.5ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL)所示。在0ng/mL-20ng/mL范圍內(nèi)，金納米粒子探針散射光強度隨PSA濃度增加而增加。

金納米粒子探針散射光強度的變化值與PSA濃度的關系曲線如圖7所示。0ng/mL-20ng/mL范圍內(nèi)，金納米粒子探針散射光強度變化值與PSA濃度呈線性關系，其中，線性方程為：Y＝0.31+10.73X(R＝0.9882)。

本實施例提供的金納米粒子探針檢測PSA的方法，在0.1ng/mL-20ng/mL范圍內(nèi)，PSA濃度與金納米粒子探針的散射光強度的增加值呈現(xiàn)良好的線性關系，其檢出限為0.02ng/mL。該方法具有高選擇性、高靈敏度、簡便、易行等特點。

實施例10

本實施例提供金納米粒子探針在檢測實際樣品中的準確性驗證。即應用實施例5中提供的金納米粒子探針聯(lián)合實施例9中提供檢測方法，對實際樣品中的PSA進行檢測，同時，利用PSA酶聯(lián)免疫試劑盒對相同的樣品進行檢測，以確定金納米粒子探針在檢測實際樣品中的準確性。其包括：

S1：將健康人血清樣品(由東南大學醫(yī)學院附屬鹽城市醫(yī)院提供)離心，取上清液。采用加標法，將已知濃度(1ng/mL、5ng/mL、12ng/mL)的PSA樣品加入上述上清液中，形成待測樣品。

S2：應用實施例5中提供的金納米粒子探針聯(lián)合實施例9中提供檢測方法(下文稱本方法)對上述待測樣品進行檢測。

S3：按照試劑盒說明書的方法對上述待測樣品進行檢測。

檢測結果如表1所示，表中結果均為六次平行實驗檢測的平均值。

表1本方法與酶聯(lián)免疫吸附法檢測結果比較

與表1可知，用本方法檢測PSA，檢測結果與酶聯(lián)免疫吸附測試法檢測結果一致，且回收率在90％-110％范圍內(nèi)，說明利用本發(fā)明提供的金納米粒子探針及檢測PSA的方法檢測結果準確，能夠用于臨床實際樣品的檢測。

綜上所述，本發(fā)明提供的制備金納米粒子探針的方法制備的金納米粒子探針具有良好的光散射性質(zhì)。金納米粒子探針表面修飾有PSA核酸適配體，其能特異性結合PSA，引起金納米粒子探針發(fā)生聚集，光散射強度增加，從而檢測PSA含量。利用本發(fā)明提供的金納米粒子探針及方法檢測PSA，在0.1-20ng/mL范圍內(nèi)，PSA濃度與金納米粒子探針散射光強度的增加值呈現(xiàn)良好的線性關系，檢出限為0.02ng/mL。檢測實際樣品時，其檢測結果與酶聯(lián)免疫吸附法檢測結果一致。本發(fā)明提供的金納米粒子探針檢測PSA的方法具有選擇性高、靈敏度高、簡便易行的特點。

以上所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。本發(fā)明的實施例的詳細描述并非旨在限制要求保護的本發(fā)明的范圍，而是僅僅表示本發(fā)明的選定實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 鹽城工學院

<120> 一種金納米粒子探針及其制備方法和應用、檢測PSA的方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aattaaagct cgccatcaaa tagc 24