本發(fā)明屬于顯微成像領(lǐng)域，尤其涉及一種結(jié)合旋轉(zhuǎn)全內(nèi)反射顯微和干涉對(duì)比顯微實(shí)現(xiàn)對(duì)超薄細(xì)胞的高精度軸向定位和三維成像的方法與裝置。

背景技術(shù)：

生物科學(xué)研究的發(fā)展使得對(duì)生物現(xiàn)象的觀察趨向于更精確，即要求更高的分辨率。在傳統(tǒng)的顯微方法中，照明的時(shí)整個(gè)視場(chǎng)在在z軸方向上都被照明光束照明，z軸方向的分辨率和信噪比一直都做不高，因此需要一種僅觀察超薄層樣品結(jié)構(gòu)的顯微方法有，尤其是在一些與膜相關(guān)的生物現(xiàn)象的研究中。

統(tǒng)的一些提高z軸分辨率的技術(shù)手段包括光切片(Lightsheet)顯微鏡和全內(nèi)反射顯微鏡(Tirf)。Lightsheet采用橫向照明的方式，但由于衍射極限的存在橫向照明的最細(xì)光束只能做到半波長(zhǎng)量級(jí)，其z軸分辨率依然達(dá)不到僅觀察細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的要求，而且由于細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，光切片顯微技術(shù)很難準(zhǔn)確照明到相應(yīng)的位置。Tirf利用全內(nèi)反射產(chǎn)生的倏逝場(chǎng)沿z軸方向的衰減特性，通過(guò)改變?nèi)珒?nèi)反射的入射角度實(shí)現(xiàn)不同的衰減系數(shù)，從而在細(xì)胞與裝在波片之間形成100nm厚的光場(chǎng)，這層光場(chǎng)恰好與細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)時(shí)細(xì)胞膜的位置重合，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞膜的準(zhǔn)確照明。由于激光散斑的存在會(huì)導(dǎo)致光場(chǎng)不均勻，因此產(chǎn)生了一種通過(guò)旋轉(zhuǎn)照明均勻光場(chǎng)消除散斑的方法，即旋轉(zhuǎn)全內(nèi)反射顯微鏡(Ring-tirf)。

但這種方法的穿透深度最多為幾百納米，成像范圍局限于細(xì)胞的下表面，無(wú)法對(duì)一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行完整成像，因此需要出現(xiàn)一種對(duì)細(xì)胞的上表面進(jìn)行照明的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種對(duì)超薄細(xì)胞的高精度軸向定位與成像方法與裝置，可以利用全內(nèi)反射和干涉照明方法實(shí)現(xiàn)對(duì)超薄細(xì)胞的高精度軸向定位與成像。該種方法和裝置具有成像速度快、裝置簡(jiǎn)單、操作方便等特點(diǎn)，可以很好地應(yīng)用于熒光樣品的檢測(cè)之中。

一種對(duì)超薄細(xì)胞的高精度軸向定位與成像方法，包括以下步驟：

1)將激光器發(fā)出的激光光束進(jìn)行準(zhǔn)直；

2)對(duì)光束進(jìn)行相應(yīng)的偏振調(diào)制使其能夠形成目標(biāo)照明圖案；

3)將調(diào)制后的光束通過(guò)二維掃描振鏡系統(tǒng)和顯微物鏡聚焦到樣品表面，實(shí)現(xiàn)在樣品表面上的環(huán)形掃描和變角度掃描；

4)在二維掃描過(guò)程中收集所述待測(cè)樣品各掃描點(diǎn)發(fā)出的信號(hào)光；

5)細(xì)胞下表面由入射角大于全內(nèi)反射臨界角的光全內(nèi)反射產(chǎn)生的倏逝波照明，產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度為：

其中θ為入射角，z為軸向深度，α為激發(fā)光的入射角，為激發(fā)光的方位角，I代表電場(chǎng)強(qiáng)度，ρ為考慮到發(fā)散角的激光光束強(qiáng)度的空間分布，Ω為光束的發(fā)散角，f為軸向的熒光分子強(qiáng)度。

考慮到有限的入射角和穿透深度，可以得到：

g＝Hf

其中g(shù)和f分別對(duì)應(yīng)N個(gè)角度和N個(gè)深度的向量，H為N角度和N深度的信息組成的矩陣，與上述的算符均相關(guān)。因此可以將成像過(guò)程看做一個(gè)線性系統(tǒng)，通過(guò)求解逆問(wèn)題的方式，從多角度圖像中重建出細(xì)胞的三維熒光密度分布。

6)細(xì)胞上表面由入射角小于全內(nèi)反射臨界角的透射光與反射光干涉產(chǎn)生的圖案照明，干涉產(chǎn)生的照明圖案強(qiáng)度分布滿足公式：

E～1+r^TE exp[iφ(H)]，

其中r^TE是與界面垂直的電場(chǎng)分量的菲涅爾反射系數(shù)，φ(H)是透射光與反射光之間的相位差。

與軸向位置H相關(guān)的φ(H)滿足公式：

菲涅爾系數(shù)滿足公式：

p₀＝n_Si cosθ_Si，p₁＝n_ox cosθ_ox，p₂＝n_b cosθ_b，

其中，λ為入射光真空中的波長(zhǎng)，為特征矩陣M_TE的四個(gè)參數(shù)，k_i為不同材料中的波矢；n_Si，n_ox，n_b分別為硅、二氧化硅和樣品中的折射率；θ_Si，θ_ox，θ_b分別為硅、二氧化硅和樣品中的入射光角度；d_ox為二氧化硅膜層的厚度。

本發(fā)明中，當(dāng)入射角度θ₁大于全反射角時(shí)，激發(fā)的倏逝波場(chǎng)沿著z軸發(fā)生指數(shù)衰減，對(duì)細(xì)胞的下表面照明激發(fā)熒光，通過(guò)改變照明角度改變衰減系數(shù)，實(shí)現(xiàn)z軸的差別照明和樣品的三維成像。

在產(chǎn)生全內(nèi)反射時(shí)，得到的圖像為橫向各位置光強(qiáng)軸向積分，其分布滿足公式：

其中I(0,θ_i)為載玻片表面的電場(chǎng)強(qiáng)度，φ為探測(cè)器和熒光顆粒的量子效率，Q(z)和PSF(z)為光子收集效率和系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，C(z)為熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品，z為離界面的軸向距離，d_p為穿透深度，θ_i為全內(nèi)反射的激發(fā)角，n_i和n_t分別為蓋玻片和樣品的折射率。

另外，在采集熒光光強(qiáng)信息時(shí)，保持入射角度不變?cè)陲@微物鏡的后焦面上進(jìn)行環(huán)形掃描，用于消除激光照明產(chǎn)生的散斑。

本發(fā)明還提供了一種對(duì)超薄細(xì)胞的高精度軸向定位與成像裝置，包括光源、承載待測(cè)樣品的樣品臺(tái)，所述光源與樣品臺(tái)之間依次設(shè)有：

用于準(zhǔn)直激光源發(fā)出的光束的準(zhǔn)直透鏡；

用于將光源發(fā)出的光束改變?yōu)榫€偏振光的起偏器；

用于使線偏振光源變?yōu)閳A偏振光的1/4波片；

用于使激發(fā)光在樣品面上實(shí)現(xiàn)環(huán)形掃描和角度改變的二維掃描振鏡系統(tǒng)；

用于在顯微物鏡后焦面上聚焦一個(gè)位置可控點(diǎn)的場(chǎng)鏡；

用于反射激發(fā)光、透射熒光信號(hào)的二色鏡；

用于將激發(fā)光聚焦到樣品上的顯微物鏡；

并設(shè)有用于控制所述掃描振鏡系統(tǒng)的控制器及收集所述待測(cè)樣品發(fā)出的信號(hào)光的探測(cè)系統(tǒng)。

針對(duì)細(xì)胞的下表面，所述的控制器控制二維掃描振鏡系統(tǒng)，使激發(fā)光由入射角大于全內(nèi)反射臨界角的光產(chǎn)生的倏逝波進(jìn)行照明；

針對(duì)細(xì)胞的上表面，所述的控制器控制二維掃描振鏡系統(tǒng)，使激發(fā)光由入射角度小于全內(nèi)反射臨界角透射光和其被細(xì)胞上表面附近反射一次后的反射光干涉產(chǎn)生的圖案進(jìn)行照明。

本發(fā)明中通過(guò)探測(cè)系統(tǒng)接收樣品發(fā)出的信號(hào)光，該探測(cè)系統(tǒng)包括：

用于將信號(hào)光束聚焦到探測(cè)器上的聚焦透鏡；

用于探測(cè)信號(hào)光的光強(qiáng)信號(hào)的CCD探測(cè)器。

作為優(yōu)選的，所述光源與起偏器之間依次設(shè)有用于對(duì)所述激光光束進(jìn)行濾波的單模光纖和準(zhǔn)直的準(zhǔn)直透鏡。

本發(fā)明中所述的細(xì)胞上表面附近的蓋玻片表面與細(xì)胞之間依次鍍了硅膜和二氧化硅膜用于增強(qiáng)反射效應(yīng)。

作為優(yōu)選的，在對(duì)細(xì)胞的上表面成像時(shí)，需要移除所述的1/4波片。

本發(fā)明原理如下：

顯微系統(tǒng)的分辨率受光學(xué)系統(tǒng)衍射的影響，目前一些比較卓越的超分辨方法都是針對(duì)橫向分辨率的提高，但是對(duì)于軸向分辨率的提高還是不足。Lightsheet橫向照明的最細(xì)光束只能做到半波長(zhǎng)量級(jí)，Tirf的穿透深度最多為幾百納米，成像范圍局限于細(xì)胞的下表面，無(wú)法對(duì)一個(gè)細(xì)胞進(jìn)行完整成像。

在本發(fā)明方法中，為了對(duì)一個(gè)超薄細(xì)胞進(jìn)行完整的z軸定位和三維成像，將細(xì)胞分為了上下表面兩個(gè)部分。對(duì)于細(xì)胞的下表面，利用Ring-tirf的方法實(shí)現(xiàn)多角度環(huán)形照明，得到的不同角度下的熒光強(qiáng)度與熒光顆粒的軸向位置相關(guān)。將系統(tǒng)成像過(guò)程看做是與角度和軸向位置相關(guān)的線性系統(tǒng)，通過(guò)得到的熒光強(qiáng)度用求解逆問(wèn)題的方式算得熒光顆粒的軸向分布，得到其三維圖像。這樣能夠得到細(xì)胞下表面以上大致800nm的三維圖像。在細(xì)胞的上表面附近的蓋玻片上分別鍍上硅膜和二氧化硅膜，形成對(duì)入射的激發(fā)光的高反膜。入射的激發(fā)光與其反射光干涉產(chǎn)生的圖案對(duì)細(xì)胞的上表面進(jìn)行照明，干涉產(chǎn)生的照明圖案強(qiáng)度分布與軸向位置相關(guān)。通過(guò)改變?nèi)肷浣嵌瓤梢愿淖兏缮娈a(chǎn)生的照明圖案，從而得到每個(gè)軸向位置在不同角度照明時(shí)的強(qiáng)度變化曲線，將得到的熒光信息與曲線對(duì)應(yīng)即可得到熒光顆粒的軸向分布。這樣能夠得到細(xì)胞上表面以下大致400nm的三維圖像。將兩種方法結(jié)合可以對(duì)厚度為1μm左右的超薄細(xì)胞進(jìn)行高精度的軸向定位與三維成像。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：

(1)提出了通過(guò)解逆問(wèn)題的方式處理得到的熒光信息進(jìn)行三維成像；

(2)首次提出了結(jié)合多角度環(huán)形全內(nèi)反射和干涉照明對(duì)一整個(gè)薄細(xì)胞進(jìn)行軸向定位和三維成像；

(3)裝置簡(jiǎn)單，操作方便。

附圖說(shuō)明

圖1為本實(shí)施例的三維成像裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為本實(shí)施例中以全內(nèi)反射方式對(duì)細(xì)胞下表面進(jìn)行照明的示意圖；

圖3為本實(shí)施例中以反射干涉方式對(duì)細(xì)胞上表面進(jìn)行照明的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于此。

如圖1所示的超分辨顯微裝置，包括：激光器1，準(zhǔn)直透鏡2，起偏器3，1/4波片4，第一掃描振鏡5，第一掃描透鏡6，第二掃描透鏡7，第二掃描振鏡8，場(chǎng)鏡9，二色鏡10，顯微物鏡11，樣品臺(tái)12，聚焦透鏡13和CCD探測(cè)器14。

其中，準(zhǔn)直透鏡2，起偏器3，1/4波片4依次位于激光器1出射光束的光軸之上。

其中，第一掃描振鏡5，第一掃描透鏡6，第二掃描透鏡7，第二掃描振鏡8組成了一個(gè)4f系統(tǒng)。

其中，場(chǎng)鏡9位于經(jīng)第二掃描振鏡8反射后光束的光軸之上。

其中，顯微物鏡11，樣品臺(tái)12依次位于二色鏡10反射后出射光束的光軸之上。

其中，聚焦透鏡13、CCD探測(cè)器14依次位于經(jīng)二色鏡10后透射光束的光軸之上。

其中，控制器與第一掃描振鏡5和第二掃描振鏡8相連，用于控制掃描振鏡系統(tǒng)的掃描。

上述裝置中，顯微物鏡11的數(shù)值孔徑NA＝1.49。

采用圖1所示的裝置進(jìn)行超分辨顯微的方法如下：

從激光器1發(fā)出的激光光束，經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直透鏡2完成準(zhǔn)直。經(jīng)過(guò)準(zhǔn)直后的光束入射到起偏器3變?yōu)榫€偏振光，經(jīng)過(guò)1/4波片4變?yōu)閳A偏振光。第一掃描振鏡5和第二掃描振鏡8分別位于4f系統(tǒng)的輸入和輸出面上，為共軛關(guān)系。經(jīng)過(guò)二維掃描振鏡系統(tǒng)之后的平行光經(jīng)過(guò)場(chǎng)鏡、二色鏡的反射和顯微物鏡聚焦到樣品平面上。用于控制二維掃描振鏡系統(tǒng)的控制器首先控制激發(fā)光的入射角從全內(nèi)反射的臨界角開(kāi)始增大，使激發(fā)光在載玻片界面上發(fā)生全內(nèi)反射，產(chǎn)生的倏逝波對(duì)細(xì)胞的下表面進(jìn)行照明，如圖2所示。同時(shí)在CCD探測(cè)器14的曝光時(shí)間內(nèi)改變激發(fā)光的方位角保持入射角不變形成環(huán)形照明，消除散斑對(duì)結(jié)果的影響。該倏逝波激發(fā)的熒光在CCD探測(cè)器14上被探測(cè)到的強(qiáng)度也隨z軸以指數(shù)形式衰減，可以寫(xiě)為：

其中θ為入射角，z為軸向深度，α為激發(fā)光的入射角，為激發(fā)光的方位角，I代表電場(chǎng)強(qiáng)度，ρ為考慮到發(fā)散角的激光光束強(qiáng)度的空間分布，Ω為光束的發(fā)散角，f為軸向的熒光分子強(qiáng)度?？紤]到有限的入射角和穿透深度，我們可以得到：

g＝Hf

其中g(shù)和f分別對(duì)應(yīng)N個(gè)角度和N個(gè)深度的向量，H為N角度和N深度的信息組成的矩陣，與上述的算符均相關(guān)。因此將成像過(guò)程看做一個(gè)線性系統(tǒng)，不同深度的熒光顆粒在多角度入射時(shí)的強(qiáng)度分布可以大致確定，再通過(guò)求解逆問(wèn)題的方式重建出細(xì)胞下表面以上800nm左右的三維熒光密度分布。

然后控制二維掃描振鏡系統(tǒng)使激發(fā)光的入射角從0度掃描至全內(nèi)反射臨界角之間，此時(shí)激發(fā)光直接入射到細(xì)胞上表面附近鍍了高反膜的蓋玻片上，反射一次后的反射光與直接入射光進(jìn)行干涉，產(chǎn)生干涉圖案對(duì)細(xì)胞上表面進(jìn)行照明，如圖3所示。改變角度同樣也可以得到不同深度的熒光顆粒對(duì)應(yīng)不同入射角度時(shí)被激發(fā)的熒光強(qiáng)度，得到細(xì)胞上表面以下400nm左右的三維熒光密度分布。結(jié)合兩種照明方式得到的數(shù)據(jù)，可以對(duì)厚度在1μm左右的超薄細(xì)胞進(jìn)行高精度的軸向定位與三維成像。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施舉例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。