本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種生長(zhǎng)激素定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
生長(zhǎng)激素（Growth Hormone，GH）是腺垂體細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，為一種肽類激素，血清生長(zhǎng)激素測(cè)定有助于巨人癥、肢端肥大癥、生長(zhǎng)激素缺乏癥的診斷。目前，生長(zhǎng)激素濃度檢測(cè)試劑盒90%以上采用化學(xué)發(fā)光法，且均以血清樣品作為檢測(cè)對(duì)象。對(duì)于以血清樣品作為對(duì)象進(jìn)行檢測(cè)，具有以下缺點(diǎn)：成本偏高，血標(biāo)本不易保存、不便遠(yuǎn)距離遞送、運(yùn)送過(guò)程中存在潛在生物安全隱患，給檢測(cè)者就診帶來(lái)不便；采血前，需給檢測(cè)者服用藥物進(jìn)行生長(zhǎng)激素激發(fā)試驗(yàn)，并于不同時(shí)間段多次采血，通常需要三次（含）以上采血，多次采血不僅造成身體不適，還會(huì)對(duì)心理造成影響；由于需服用藥物進(jìn)行激發(fā)試驗(yàn)，且采血量大，使得檢測(cè)不適用于新生兒和低齡兒童。
時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定（Time Resolved Immunofluorometric assay，TRIFMA）是八十年代初問(wèn)世的一項(xiàng)新型超微量免疫分析技術(shù)，其具體原理為：熒光的時(shí)間分辨技術(shù)是利用熒光發(fā)射體的熒光壽命差別，進(jìn)行分辨的熒光光譜技術(shù)，以鑭系元素為示蹤劑代替放射性同位素，用具有雙功能基團(tuán)的鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，當(dāng)解離出來(lái)的鑭系元素與特制的擴(kuò)增液形成新的螯合物時(shí)，其熒光明顯增強(qiáng)且持久，在檢測(cè)時(shí)，用延遲測(cè)量的方法可大大提高檢測(cè)靈敏度。
對(duì)于生長(zhǎng)激素檢測(cè)，如何制備一種利用時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定技術(shù)、且克服上述缺點(diǎn)的試劑盒，是目前生長(zhǎng)激素檢測(cè)亟待解決的問(wèn)題之一。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種生長(zhǎng)激素定量檢測(cè)試劑盒及其制備方法，可利用時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定技術(shù)進(jìn)行生長(zhǎng)激素定量檢測(cè)，且檢測(cè)時(shí)，以濾紙干血片為檢測(cè)樣本，可避免血清樣品不易保存、不便運(yùn)輸、需進(jìn)行生長(zhǎng)激素激發(fā)試驗(yàn)、采血量大的缺點(diǎn)，同時(shí)可確保檢測(cè)結(jié)果與血清樣品的檢測(cè)結(jié)果高度一致。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種生長(zhǎng)激素定量檢測(cè)試劑盒，包括實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液、增強(qiáng)液、包被板、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品及標(biāo)記物；實(shí)驗(yàn)緩沖液包括1.0-20.0g/L牛血清白蛋白和第一緩沖液；濃縮洗液包括1.0-10.0ml/L Tween-20和第二緩沖液；增強(qiáng)液包括1-5mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、15-30mg/L三正辛基氧化磷和第三緩沖液；包被板為采用包被液、封閉液、反應(yīng)板制成的包被板，包被液包括：1-10ppm Proclin300、第四緩沖液、1-10μg/ml生長(zhǎng)激素單克隆抗體，封閉液包括：1.0-10.0g/L海藻糖、質(zhì)量體積比0.4-0.6%的牛血清白蛋白、第四緩沖液，包被液的包被量為100-200μl/孔，封閉液的封閉量為250-280μl/孔；標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品為濾紙干血片，濾紙干血片包括8個(gè)濃度的混合物，混合物包括血紅細(xì)胞、去激素陰性血清混合基質(zhì)和生長(zhǎng)激素；標(biāo)記物由生長(zhǎng)激素單克隆抗體與鑭系元素離子螯合物按1:1-1:6m/m制得。
其中，第一緩沖液各組分及濃度為：0.009-0.011g/L乙二胺四乙酸二鈉，49-51mmol/L、pH7.7-7.9Tris-HCl；第二緩沖液各組分及濃度為：0.384-0.386mol/L NaCl，0.123-0.125mol/L、pH7.7-7.9Tris-HCl；第三緩沖液各組分及濃度為：0.9-1.1ml/L TritonX-100，0.09-0.11mol/L鄰苯二甲酸氫鉀-冰醋酸；第四緩沖液為0.04-0.06mol/L、pH9.5-9.7碳酸鈉-碳酸氫鈉。
其中，實(shí)驗(yàn)緩沖液的牛血清白蛋白的濃度為10.0g/L，Tween-20的濃度為4.0ml/L，β-萘甲酰三氟丙酮的濃度為4mg/L，三正辛基氧化磷的濃度為20mg/L，Proclin300的濃度為5 ppm，生長(zhǎng)激素單克隆抗體的濃度為10μg/ml，海藻糖的濃度為5.0g/L，牛血清白蛋白的濃度為0.5%，生長(zhǎng)激素單克隆抗體與鑭系元素離子螯合物的比例為1:1m/m。
其中，第一緩沖液各組分及濃度為：0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉，50mmol/L、pH7.8Tris-HCl；第二緩沖液各組分及濃度為：0.385mol/L NaCl，0.124mol/L、pH7.8Tris-HCl；第三緩沖液各組分及濃度為：1.0ml/L TritonX-100，0.10mol/L鄰苯二甲酸氫鉀-冰醋酸；第四緩沖液為0.05mol/L、pH9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉。
其中，反應(yīng)板為96孔反應(yīng)板。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種生長(zhǎng)激素定量檢測(cè)試劑盒的制備方法，包括以下步驟：實(shí)驗(yàn)緩沖液的制備方法：在第一緩沖液中加入1.0-20.0g/L牛血清白蛋白；濃縮洗液的制備方法：在第二緩沖液中加入1.0-10.0ml/L Tween-20；增強(qiáng)液的制備方法：在第三緩沖液中加入1-5mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、15-30mg/L三正辛基氧化磷；包被板的制備方法：包被液包括1-10ppm Proclin300、第四緩沖液、1-10μg/ml生長(zhǎng)激素單克隆抗體，封閉液包括1.0-10.0g/L海藻糖、質(zhì)量體積比0.4-0.6%的牛血清白蛋白、第四緩沖液，在反應(yīng)板中加入包被液100-200μl/孔，34-36℃條件下孵育過(guò)夜，孵育結(jié)束后，洗板1次、拍干，在洗滌后的反應(yīng)板中加入封閉液250-280μl/孔，25±2℃條件下孵育過(guò)夜，甩干；標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品的制備方法：按50%-55%的血細(xì)胞比容由血紅細(xì)胞、去激素陰性血清混合基質(zhì)將生長(zhǎng)激素混合成6個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和底、高2個(gè)濃度的質(zhì)控品，將各濃度混合物分別滴加在濾紙的不同位置，室溫干燥；標(biāo)記物的制備方法：將生長(zhǎng)激素單克隆抗體與鑭系元素離子螯合物按1:1-1:6m/m混合，27-29℃反應(yīng)43-45h，反應(yīng)液經(jīng)Sephadex G－50柱進(jìn)行洗脫，以分離鑭系元素單克隆抗體結(jié)合物和游離的鑭系元素，收集分離液，將分離液于時(shí)間分辨免疫熒光分析儀上進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)，收集第一峰中熒光計(jì)數(shù)大于10000000的洗脫液，加等體積甘油，混勻；將上述制備的實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液、增強(qiáng)液、包被板、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、標(biāo)記物分裝、組裝，完成生長(zhǎng)激素定量檢測(cè)試劑盒的制備。
其中，第一緩沖液各組分及濃度為：0.009-0.011g/L乙二胺四乙酸二鈉，49-51mmol/L、pH7.7-7.9Tris-HCl；第二緩沖液各組分及濃度為：0.384-0.386mol/L NaCl，0.123-0.125mol/L、pH7.7-7.9Tris-HCl；第三緩沖液各組分及濃度為：0.9-1.1ml/L TritonX-100，0.09-0.11mol/L鄰苯二甲酸氫鉀-冰醋酸；第四緩沖液為0.04-0.06mol/L、pH9.5-9.7碳酸鈉-碳酸氫鈉。
其中，實(shí)驗(yàn)緩沖液的牛血清白蛋白的濃度為10.0g/L，Tween-20的濃度為4.0ml/L，β-萘甲酰三氟丙酮的濃度為4mg/L，三正辛基氧化磷的濃度為20mg/L，Proclin300的濃度為5 ppm，生長(zhǎng)激素單克隆抗體的濃度為10μg/ml，海藻糖的濃度為5.0g/L，牛血清白蛋白的濃度為0.5%，生長(zhǎng)激素單克隆抗體與鑭系元素離子螯合物的比例為1:1m/m。
其中，第一緩沖液各組分及濃度為：0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉，50mmol/L、pH7.8Tris-HCl；第二緩沖液各組分及濃度為：0.385mol/L NaCl，0.124mol/L、pH7.8Tris-HCl；第三緩沖液各組分及濃度為：1.0ml/L TritonX-100，0.10mol/L鄰苯二甲酸氫鉀-冰醋酸；第四緩沖液為0.05mol/L、pH9.6碳酸鈉-碳酸氫鈉。
其中，鑭系元素為銪元素。
本發(fā)明的有益效果是：區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的情況，本發(fā)明的生長(zhǎng)激素定量檢測(cè)試劑盒包括實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液、增強(qiáng)液、包被板、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品及標(biāo)記物，通過(guò)上述各部分可對(duì)生長(zhǎng)激素進(jìn)行定量檢測(cè)，具體為采用時(shí)間分辨免疫熒光測(cè)定技術(shù)進(jìn)行測(cè)定，在測(cè)定過(guò)程中，采用濾紙干血片，使得檢測(cè)樣本便于保存和運(yùn)輸、無(wú)需進(jìn)行生長(zhǎng)激素激發(fā)試驗(yàn)、采血量低，且采用濾紙干血片與采用血清樣品的檢測(cè)結(jié)果具有高度的一致性。
附圖說(shuō)明
圖1是本發(fā)明生長(zhǎng)激素定量檢測(cè)試劑盒與對(duì)照試劑盒樣本檢測(cè)線性相關(guān)性圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明生長(zhǎng)激素定量檢測(cè)試劑盒包括實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液、增強(qiáng)液、包被板、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品及標(biāo)記物，上述各部分的制備方法具體如下。
實(shí)驗(yàn)緩沖液：在含0.01g/L乙二胺四乙酸二鈉的50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl溶液中加入10.0g/L牛血清白蛋白，混合均勻。
濃縮洗液：在含0.385mol/L NaCl的0.124mol/L、pH7.8的Tris-HCl緩沖液中加入4.0ml/L Tween-20，混合均勻。
增強(qiáng)液：在含有1ml/L TritonX-100的0.1mol/L鄰苯二甲酸氫鉀-冰醋酸溶液中加入4mg/Lβ-萘甲酰三氟丙酮、20mg/L三正辛基氧化磷，混合均勻。
包被板：采用包被液、封閉液、反應(yīng)板制備包被板，其中，反應(yīng)板為96孔反應(yīng)板。包被液的制備過(guò)程為：首先制備生長(zhǎng)激素單克隆抗體，具體地，利用單克隆抗體技術(shù)，建立生長(zhǎng)激素單克隆抗體細(xì)胞庫(kù)，然后接種小鼠腹腔制備腹水，再將腹水純化，獲得特異性為100%、純度大于95%的生長(zhǎng)激素單克隆抗體；然后將純化得到的生長(zhǎng)激素單克隆抗體用含5ppm Proclin300的0.05mol/L、pH9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液進(jìn)行稀釋，以獲得包被液，其中，包被液中生長(zhǎng)激素單克隆抗體的濃度為10μg/ml。封閉液為含5.0g/L海藻糖、0.5%BSA的0.05mol/L、pH9.6的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液。
包被板的制備過(guò)程具體為：在空白反應(yīng)板中加入包被液100-200μl/孔，35℃條件下孵育過(guò)夜，將孵育好的反應(yīng)板用工作洗滌液洗板1次，拍干；將洗滌過(guò)的反應(yīng)板加入封閉液250-280μl/孔，25±2℃條件下孵育過(guò)夜；將孵育過(guò)的反應(yīng)板甩干、過(guò)夜晾干，用鋁箔袋真空密封，置2-8℃條件下保存。
在本發(fā)明中，制得的包被板熱穩(wěn)定性良好。生長(zhǎng)激素單克隆抗體采用棋盤(pán)滴定法確定包被濃度，其中，生長(zhǎng)激素單克隆抗體的濃度為10μg/ml的包被液的包被效果最佳。
標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品：以GH國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品為參照，按50%-55%的血細(xì)胞比容由人血紅細(xì)胞和去激素陰性血清混合基質(zhì)將GH純品混合，制備成6個(gè)適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品和低、高兩個(gè)適當(dāng)濃度的質(zhì)控品，以50μl體積分別滴加在濾紙的A、B、C、D、E、F位置和C1、C2位置，經(jīng)室溫自然干燥后得到干濾紙片標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品，即濾紙干血片，用鋁箔袋真空密封。
標(biāo)記物：將1mg GH單克隆抗體加入1mg的Eu3+-N2-[P-異氰酸-芐基]-二乙烯三胺四乙酸鈉中混勻，28℃反應(yīng)44h；反應(yīng)液經(jīng)Sephadex G－50柱（1×40cm），用50mmol/L、pH7.8的Tris-HCl緩沖液洗脫，分離Eu3+-單克隆抗體結(jié)合物與游離Eu3+，采用全自動(dòng)部分收集器2ml/管進(jìn)行液體收集；于時(shí)間分辨免疫熒光分析儀上進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)，收集第一峰中熒光計(jì)數(shù)大于10000000的洗脫液，加等體積甘油，混勻后-20℃保存。
在本發(fā)明中，采用棋盤(pán)滴定法確定銪標(biāo)記工作液濃度，用實(shí)驗(yàn)緩沖液按1:50稀釋檢測(cè)效果最佳。
在本發(fā)明中，對(duì)于標(biāo)記物的制備，首先利用生長(zhǎng)激素單克隆抗體與鑭系元素離子螯合物按1:1-1:6（m/m）標(biāo)記制得母液，母液再用標(biāo)記物稀釋液按1:10-1:25倍稀釋而成。其中，1:1-1:6為質(zhì)量比。
將上述制備的實(shí)驗(yàn)緩沖液、濃縮洗液、增強(qiáng)液、包被板、標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品及標(biāo)記物分裝、貼標(biāo)簽、組裝，完成試劑盒的制備。
在本發(fā)明中，分裝后即為半成品，抽出3份進(jìn)行特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定，檢定合格后，才能組裝成試劑盒。
下面詳細(xì)闡述上述制備的試劑盒的操作方法。
A. 試劑準(zhǔn)備：將反應(yīng)板平衡至室溫；將40ml濃縮洗液和960ml純化水混合成工作洗滌液，該工作洗滌液可用于包被板的制備過(guò)程；將銪標(biāo)記物用實(shí)驗(yàn)緩沖液按體積比1:50稀釋成標(biāo)記物工作液。
B. 檢測(cè)：將標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品、樣本用直徑3.0mm的打孔器打入支架上或直接打入包被板的微孔中，向每孔中分別加入100-200μl的銪標(biāo)記物工作液；包被板在室溫下，緩慢振蕩孵育1～4h，用工作洗滌液洗板6次，拍干；向每孔中加入100-200μl增強(qiáng)液，緩慢振蕩5min，于時(shí)間分辨免疫熒光分析儀上進(jìn)行熒光計(jì)數(shù)，按測(cè)定參數(shù)進(jìn)行擬合分析，得到定量結(jié)果。
請(qǐng)參閱圖1，圖1為本發(fā)明生長(zhǎng)激素定量檢測(cè)試劑盒與對(duì)照試劑盒樣本檢測(cè)線性相關(guān)性圖，從圖1可以看出，本發(fā)明試劑盒的樣本檢測(cè)結(jié)果與對(duì)照試劑盒的樣本檢測(cè)結(jié)果具有高度的一致性。其中，本發(fā)明濾紙干血片樣本測(cè)量值為本發(fā)明試劑盒的樣本測(cè)量結(jié)果，國(guó)內(nèi)試劑盒血清樣本測(cè)量值為對(duì)照試劑盒的樣本檢測(cè)結(jié)果。
請(qǐng)參閱表1，表1為本發(fā)明試劑盒與對(duì)照試劑盒對(duì)樣本中生長(zhǎng)激素臨床判斷結(jié)果統(tǒng)計(jì)表，從表1中可以看出，二者的檢測(cè)結(jié)果一致。
表1 本發(fā)明試劑盒與對(duì)照試劑盒對(duì)樣本中生長(zhǎng)激素臨床判斷結(jié)果
上述制備的試劑盒其性能指標(biāo)為：空白限，空白限不高于0.5μg/L；線性，在線性區(qū)間內(nèi)，相關(guān)系數(shù)（r）不低于0.9900；準(zhǔn)確度，在試劑盒規(guī)定的線性區(qū)間范圍內(nèi)檢測(cè)生長(zhǎng)激素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品，其測(cè)量結(jié)果的相對(duì)偏差在±10%范圍內(nèi)；批內(nèi)精密度，平行測(cè)定試劑盒范圍內(nèi)的高、低質(zhì)控品，測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)（CV）不高于15%；批間精密度，在3個(gè)不同批次產(chǎn)品之間，平行測(cè)定試劑盒范圍內(nèi)的高、低質(zhì)控品，測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)（CV）不高于20%；特異性，測(cè)定濃度不低于2000mIU/L的泌乳素樣本、其測(cè)定結(jié)果不高于0.5μg/L；穩(wěn)定性，試劑盒在37℃條件下放置7天，上述性能指標(biāo)依然符合要求。
綜上所述，本發(fā)明試劑盒具有如下優(yōu)點(diǎn)：濾紙干血片作為血液極好的載體，相比血清樣品，可以降低采血量，降低待檢者疼痛感和不適感，減少心理負(fù)擔(dān)，以濾紙干血片為檢測(cè)樣本，一滴血（約50μl）即可形成約10mm的血斑，本發(fā)明試劑盒所需要的樣本只需3.0mm-3.2mm的血斑，而以血清樣品為檢測(cè)樣本，通常單次取血量在1ml-5ml；以濾紙干血片為檢測(cè)樣本，可以推廣至新生兒、低齡兒童及激發(fā)試驗(yàn)藥物過(guò)敏等特殊患者的疾病篩查，達(dá)到疾病早發(fā)現(xiàn)早干預(yù)早治療的意義；以濾紙干血片為檢測(cè)樣本，樣本遞送較血清樣品便捷，另外，濾紙干血片為檢測(cè)樣本保存起來(lái)也較為便利，有利于潛在醫(yī)療糾紛的處理；以濾紙干血片為檢測(cè)樣本，可以提供一種新型的檢測(cè)模式，具體地，因血清樣本不便運(yùn)輸和保存，患者必須至檢驗(yàn)結(jié)構(gòu)進(jìn)行采血，采用濾紙干血片為檢測(cè)樣本，可在住所附近的衛(wèi)生站或醫(yī)院進(jìn)行采血，然后集中遞送至檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)；以濾紙干血片為檢測(cè)樣本，可以避免因服藥帶來(lái)的潛在不良反應(yīng)，具體地，由于人體內(nèi)生長(zhǎng)激素呈脈沖式分泌，人為干預(yù)使用藥物激發(fā)垂體分泌，使機(jī)體生長(zhǎng)激素含量在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)到較高水平，而使用濾紙干血片為檢測(cè)樣本，患者可以于不同時(shí)間段前往當(dāng)?shù)匦l(wèi)生站或醫(yī)院進(jìn)行血液采集，這樣檢測(cè)出來(lái)的結(jié)果更能真實(shí)、直接反映機(jī)體生長(zhǎng)激素水平，從而更加準(zhǔn)確評(píng)判垂體發(fā)育狀況；生長(zhǎng)激素抗原在規(guī)定的儲(chǔ)存條件下能穩(wěn)定的存在濾紙干血片中；采用濾紙干血片樣本與血清樣品為對(duì)象的檢測(cè)結(jié)果具有高度的一致性；濾紙干血片適合在全國(guó)大量樣品篩查中應(yīng)用，特別是新生兒生長(zhǎng)激素缺乏癥的篩查。
以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其他相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。