本發(fā)明屬于液晶生物傳感器領(lǐng)域，尤其是涉及一種用于檢測UO₂²⁺的液晶生物傳感方法。

背景技術(shù)：

液晶(LC)是一種在一定溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)既不同于固態(tài)、液態(tài)，又不同于氣態(tài)的特殊物質(zhì)態(tài)，它既具有各向異性的晶體所特有的雙折射性，又具有液體的流動(dòng)性，對(duì)外界條件的刺激能夠靈敏響應(yīng)，并能將界面事件轉(zhuǎn)變?yōu)閮H用偏光顯微鏡就能觀察到的光學(xué)響應(yīng)。液晶已成為在固相界面和液晶-水相相界面監(jiān)控界面現(xiàn)象的一個(gè)強(qiáng)有力的工具。固相界面的傳感機(jī)理主要是基于固定在傳感基底表面的自組裝敏感膜能夠識(shí)別生物、化學(xué)分子前后發(fā)生的空間構(gòu)象和幾何尺寸的變化，引起基底表面物理形貌改變，擾亂液晶分子初始有序排列，導(dǎo)致液晶分子在偏振光顯微鏡下的光學(xué)成像變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)特定的蛋白質(zhì)、核酸、重金屬離子等分子的檢測。液晶-水相界面的傳感機(jī)理主要是基于自組裝敏感膜與液晶分子在均相介質(zhì)中相互作用誘導(dǎo)液晶分子垂直于水-液晶界面取向排列，目標(biāo)分子的存在會(huì)打亂這種作用，使得界面的微環(huán)境性質(zhì)改變(如pH變化，電荷密度變化，親疏水性變化等)，誘導(dǎo)液晶分子重新取向排列，導(dǎo)致液晶分子在偏正光顯微鏡下的光學(xué)成像變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的分析檢測。

鈾(U)是一種具有放射性的重金屬，而UO₂²⁺是U在水中存在最穩(wěn)定的化學(xué)形式，UO₂²⁺高溶解性對(duì)人類的健康構(gòu)成重大威脅，能夠造成機(jī)體免疫、消化、造血以及生殖系統(tǒng)紊亂。目前，大多數(shù)檢測U的方法主要依靠儀器分析方法，根據(jù)U元素本身特有的性質(zhì)，主要有原子吸收光譜法、電感耦合等離子體法、電位滴定法、分光光度法、熒光法和拉曼光譜法等，大多數(shù)儀器分析方法需要繁瑣的樣本預(yù)處理，并且所需設(shè)備精密昂貴。因此，構(gòu)建操作簡單、方便快捷、靈敏、選擇性高的U檢測新方法是困難而又重要的，對(duì)于安全評(píng)估、監(jiān)測環(huán)境中U污染、環(huán)境治理及減少人群暴露等有著重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明旨在提出一種用于檢測UO₂²⁺的液晶生物傳感方法，發(fā)展了一種簡單直觀的檢測UO₂²⁺的液晶生物傳感方法，該方法操作簡單，特異性好且不需要標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)最低濃度為25nMUO₂²⁺的檢測。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一種用于檢測UO₂²⁺的液晶生物傳感方法，首先在傳感基底表面修飾TEA/DMOAP混合自組裝膜，將捕獲探針固定于經(jīng)過化學(xué)敏感膜修飾的下玻片基底表面，然后滴加UO₂²⁺與DNA酶雙鏈復(fù)合物反應(yīng)的混合溶液，將修飾有DMOAP敏感膜的上玻片和修飾TEA/DMOAP混合敏感膜且接有DNA的下玻片面對(duì)面組裝制成液晶盒，用偏光顯微鏡觀察光學(xué)信號(hào)響應(yīng)。

進(jìn)一步的,一種用于檢測UO₂²⁺的液晶生物傳感方法，包括以下步驟：

(1)玻片基底的預(yù)處理：將載玻片用鋼化玻璃刀切成大小約為1.5cm×2cm的方塊，置于培養(yǎng)皿中，用新鮮配制的體積比為6：3～8：3的濃硫酸與雙氧水的Piranha溶液在恒溫槽中浸泡，然后用超純水沖洗，在無水乙醇中浸泡，氮?dú)獯蹈?，放置于烘箱中加熱干燥，取出防塵備用；

(2)玻片基底敏感膜的組裝：(a)、上玻片組裝：將Piranha處理過的玻片浸泡在體積分?jǐn)?shù)為0.2％～0.6％的DMOAP水溶液中，室溫放置10min，然后取出用超純水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈珊笾糜诤嫦渲屑訜岣稍铮?/p>

(b)、下玻片組裝：將Piranha處理過的玻片浸泡在TEA和DMOAP的乙醇混合溶液中，恒溫浸泡后依次用乙醇、超純水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?，置于烘箱中加熱干燥?/p>

(3)捕獲探針的固定：將捕獲探針滴加到經(jīng)過化學(xué)敏感膜修飾的下玻片基底表面，37℃恒溫反應(yīng)1～3h，然后依次用1×SSC洗液、超純水沖洗，氮?dú)獯蹈桑?/p>

(4)鈾酶鏈和底物鏈進(jìn)行雜交反應(yīng)：在pH 5.5的MES緩沖液中將DNA酶鏈和等量的底物鏈充分混合，在水浴鍋中加熱到75～90℃退火2～5min，然后冷卻到室溫，得到DNA酶雙鏈復(fù)合物，然后加入不同濃度的UO₂²⁺，混合均勻后于室溫下反應(yīng)，將上述溶液滴加到固定有捕獲探針的下玻片上，37℃反應(yīng)1～3h，然后依次用1×SSC洗液、超純水沖洗，氮?dú)獯蹈桑?/p>

(5)液晶盒的制備：將步驟(4)得到的接有目標(biāo)物的下玻片與上玻片面對(duì)面組裝，中間用一邊緣開有小口的厚度約為20μm的凸型Mylar聚酯片隔開，除開有小孔方向的其他三邊用長尾夾固定，將其放置于自制的密閉加熱裝置中，加熱至40℃使液晶分子成各向同性的液態(tài)，通過開有小口的玻片邊緣處移取5～10μL的5CB液晶注入液晶盒，然后冷卻到室溫；

(6)用偏光顯微鏡觀察并采集圖片、分析結(jié)果。

進(jìn)一步的，所述1×SSC洗液由6×SSC儲(chǔ)備洗液稀釋得到；6×SSC儲(chǔ)備洗液為0.9mol/L NaCl、0.09mol/L二水合檸檬酸三鈉、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01％十二烷基硫酸鈉的混合溶液。

相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明所述的一種用于檢測UO₂²⁺的液晶生物傳感方法具有以下優(yōu)勢(shì)：

(1)本發(fā)明所述的提出了一種新穎的液晶生物傳感策略用于UO₂²⁺檢測，利用在UO₂²⁺存在的條件下，UO₂²⁺能跟DNA酶結(jié)合，引起液晶盒前后偏光圖像信號(hào)改變，發(fā)展了一種簡單直觀的液晶生物傳感方法并實(shí)現(xiàn)了對(duì)UO22+的檢測，該方法具有操作簡單，特異性好且不需要標(biāo)記等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)最低濃度為25nMUO₂²⁺的檢測；

(2)本發(fā)明所述的一種用于檢測UO₂²⁺的液晶生物傳感方法，該傳感器實(shí)現(xiàn)了UO₂²⁺特異性的DNA酶的高通量檢測。

附圖說明

構(gòu)成本發(fā)明的一部分的附圖用來提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，本發(fā)明的示意性實(shí)施例及其說明用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的不當(dāng)限定。在附圖中：

圖1為本發(fā)明的原理示意圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例所述的不同UO₂²⁺濃度的響應(yīng)信號(hào)圖像；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例所述的不同金屬離子的光學(xué)響應(yīng)圖像。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明。

實(shí)施例1

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)：20mM Tris-HCl、50mM NaCl、100mM Mg²⁺、10mM NaBH₃CN。

6×SSC儲(chǔ)備洗液(pH 7.0)：0.9M NaCl、0.09M二水合檸檬酸三鈉、0.01％十二烷基硫酸鈉；使用時(shí)用超純水稀釋至1×SSC(用于除去非特異性吸附的DNA)。

MES緩沖液(pH 5.5)：50mM MES、300mM NaCl

UO₂²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取42.4mgUO₂(CH₃COO)₂于10ml離心管中加滅菌水溶解，避光保存。

UO₂²⁺工作溶液：取一定體積的UO₂²⁺標(biāo)準(zhǔn)溶液用MES緩沖溶液稀釋至所需濃度。

實(shí)驗(yàn)中用到的核苷酸序列均由大連寶生物工程有限公司合成，如下表：

表3.1本實(shí)驗(yàn)所用到的核酸序列

具體實(shí)驗(yàn)步驟如下：

(1)玻片基底的預(yù)處理：將載玻片用鋼化玻璃刀切成大小約為1.5cm×2cm的方塊，置于培養(yǎng)皿中，用新鮮配制的體積比為6：3～8：3的濃硫酸與雙氧水的Piranha溶液在恒溫槽中浸泡，然后用超純水沖洗，在無水乙醇中浸泡，氮?dú)獯蹈桑胖糜诤嫦渲屑訜岣稍?，取出防塵備用；

(2)玻片基底敏感膜的組裝：(a)、上玻片組裝：將Piranha處理過的玻片浸泡在體積分?jǐn)?shù)為0.2％～0.6％的DMOAP水溶液中，室溫放置10min，然后取出用超純水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈珊笾糜诤嫦渲屑訜岣稍铮?/p>

(b)、下玻片組裝：將Piranha處理過的玻片浸泡在TEA和DMOAP的乙醇混合溶液中，恒溫浸泡后依次用乙醇、超純水沖洗干凈，氮?dú)獯蹈?，置于烘箱中加熱干燥?/p>

(3)捕獲探針的固定：將捕獲探針滴加到經(jīng)過化學(xué)敏感膜修飾的下玻片基底表面，37℃恒溫反應(yīng)1～3h，然后依次用1×SSC洗液、超純水沖洗，氮?dú)獯蹈桑?/p>

(4)鈾酶鏈和底物鏈進(jìn)行雜交反應(yīng)：在pH 5.5的MES緩沖液中將DNA酶鏈和等量的底物鏈充分混合，在水浴鍋中加熱到75～90℃退火2～5min，然后冷卻到室溫，得到DNA酶雙鏈復(fù)合物，然后加入不同濃度的UO₂²⁺，混合均勻后于室溫下反應(yīng)，將上述溶液滴加到固定有捕獲探針的下玻片上，37℃反應(yīng)1～3h，然后依次用1×SSC洗液、超純水沖洗，氮?dú)獯蹈桑?/p>

(5)液晶盒的制備：將步驟(4)得到的接有目標(biāo)物的下玻片與上玻片面對(duì)面組裝，中間用一邊緣開有小口的厚度約為20μm的凸型Mylar聚酯片隔開，除開有小孔方向的其他三邊用長尾夾固定，將其放置于自制的密閉加熱裝置中，加熱至40℃使液晶分子成各向同性的液態(tài)，通過開有小口的玻片邊緣處移取5～10μL的5CB液晶注入液晶盒，然后冷卻到室溫；

(6)用偏光顯微鏡觀察并采集圖片、分析結(jié)果。

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，本實(shí)驗(yàn)考察了傳感體系對(duì)UO₂²⁺的響應(yīng)信號(hào)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，本傳感方法具有良好的信噪比，隨著UO₂²⁺濃度的降低，雙折射現(xiàn)象越不明顯，偏光圖像中出現(xiàn)的彩色織構(gòu)越少。當(dāng)UO₂²⁺濃度的為600nM時(shí)，整個(gè)圖像都是黑白織構(gòu)(如圖2中A圖)。當(dāng)UO₂²⁺濃度降低時(shí)，與玻片基底表面結(jié)合的目標(biāo)DNA序列減少，對(duì)液晶有序排列的擾亂作用變小，光學(xué)圖象中的光亮度及液晶織構(gòu)現(xiàn)象減弱(如圖2中B-D圖)；當(dāng)UO₂²⁺濃度降低至25nM時(shí)，圖像上出現(xiàn)一點(diǎn)點(diǎn)但可明顯區(qū)分的雙折射亮區(qū)(如圖2中E圖)；當(dāng)UO₂²⁺濃度低于25nM時(shí)，光學(xué)圖像趨于黑色(如圖2中F圖)，說明本傳感方法能檢測到UO₂²⁺的濃度為25nM。

選擇性實(shí)驗(yàn)

選擇性是檢測傳感器性能的一個(gè)十分重要的指標(biāo)，為了檢驗(yàn)本方法對(duì)UO₂²⁺檢測的特異性，本實(shí)驗(yàn)中UO₂²⁺的濃度為50nM，濃度為50μM的Ca²⁺；Zn²⁺；Mn²⁺；Fe²⁺；Mg²⁺；Ni²⁺；Cu²⁺；Cd²⁺8中不同的金屬離子在同等條件下進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示50nM UO₂²⁺所獲得的圖像與50μM其他金屬離子的所獲得的圖像存在明顯差異。只有當(dāng)溶液中有UO₂²⁺存在時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)能夠產(chǎn)生明顯雙折射現(xiàn)象的光學(xué)信號(hào)響應(yīng)，說明只有UO₂²⁺存在條件下才能有效擾亂液晶分子的有序排列，干擾金屬離子不會(huì)擾亂液晶垂直排列，偏光圖像仍然是全黑背景。這些結(jié)果表明該傳感器具有極高的選擇性，DNA酶對(duì)UO₂²⁺特異性強(qiáng)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。