本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種幽門螺旋桿菌IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylor,Hp)是一種革蘭氏陰性螺旋狀桿菌，在胃上皮細(xì)胞定居繁殖。感染幽門螺旋桿菌后不僅是慢性胃炎、消化道潰瘍的主要病原菌，也是引起胃癌的危險因子，而且還與胃外許多疾病相關(guān)。因此，幽門螺旋桿菌感染的診斷日益引起許多國家和地區(qū)的重視。實(shí)驗(yàn)室診斷檢測幽門螺旋桿菌感染的方法很多，包括傳統(tǒng)的用病理標(biāo)本的直接鏡檢、活體組織細(xì)菌培養(yǎng)和尿素酶試驗(yàn)等，但是這些方法均屬于侵入性創(chuàng)傷性檢查，給患者造成的痛苦大，不易被患者和家屬接受。而近年來的研究熱點(diǎn)多集中在應(yīng)用免疫學(xué)、基因?qū)W和蛋白質(zhì)組學(xué)方法等。
幽門螺旋桿菌感染后誘發(fā)全身細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng)。幽門螺旋桿菌菌體表面存在的鞭毛以及分泌的多種抗原組分均可激發(fā)宿主的免疫答應(yīng)誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，檢測血清中特異性抗體同樣可以反映病原體的感染情況。幽門螺旋桿菌全身性抗體(即血清抗體)主要為IgG和IgA，而IgM極為少見。IgG常在感染后21d出現(xiàn)，持續(xù)時間較長；IgA在不同患者以及同一患者不同感染時期均有很大差異。這些免疫反應(yīng)對機(jī)體無保護(hù)作用，但對幽門螺旋桿菌檢測提供了方便，臨床上常將IgG作為血清學(xué)檢測幽門螺旋桿菌的主要測定指標(biāo)。
酶聯(lián)免疫診斷方法是幽門螺旋桿菌血清學(xué)抗體常用的檢測方法，其在幽門螺旋桿菌抗體診斷中表現(xiàn)出了快速、操作簡便、易于標(biāo)準(zhǔn)化合高通量檢驗(yàn)的優(yōu)勢。國內(nèi)外研究者開發(fā)了多種幽門螺旋桿菌抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，在試劑臨床中得到了廣泛的應(yīng)用。在酶聯(lián)免疫診斷試劑盒使用中，試劑盒的穩(wěn)定性是制約產(chǎn)品市場化的關(guān)鍵?，F(xiàn)在市場不同廠家生產(chǎn)的幽門螺旋桿菌抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒普遍存在著保存期短、穩(wěn)定性差等問題，極大限制了幽門螺旋桿菌抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒在臨床上推廣和應(yīng)用。國外已有多項(xiàng)的有關(guān)穩(wěn)定劑的專利和產(chǎn)品問世，而國內(nèi)在診斷試盒穩(wěn)定劑方面尚在探索階段，穩(wěn)定劑研究成為我國酶聯(lián)免疫診斷試劑盒研發(fā)必須克服的技術(shù)瓶頸。目前，已有針對蔗糖、海藻糖、乳糖、明膠、甘油、山梨醇、谷氨酸鈉、聚乙二醇等穩(wěn)定劑的研究。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有幽門螺旋桿菌抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒中普遍存在的保存期短、穩(wěn)定性差等問題，本發(fā)明提供了一種幽門螺旋桿菌IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，該試劑盒具有良好的穩(wěn)定性，在室溫條件下有效期為1年，在4℃條件下有效期可達(dá)3年，顯著提高了試劑盒的保存期。
本發(fā)明提供的幽門螺旋桿菌IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒，由幽門螺旋桿菌抗原包被板、樣品稀釋液、酶標(biāo)記液、洗滌液、顯色液、陰性對照品、陽性對照品和終止液組成；
其中，所述幽門螺旋桿菌抗原包被板的制備過程為：將包被用的幽門螺旋桿菌抗原用0.05mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液液稀釋后，按0.1mL/孔包被到微孔板內(nèi)，在4～8℃吸附24～26小時后，用0.05mol/L pH9.5的磷酸鹽緩沖液洗板，再用封閉液在4～8℃封閉18～20小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后制得幽門螺旋桿菌抗原包被板；
所述樣品稀釋液為含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液；
所述酶標(biāo)記液為含0.5mg/L的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體、0.1～0.6mg/L的聚乙二醇-200和0.5～1mg/L的殼聚糖的15mmol/L pH8.5磷酸鹽緩沖液；
所述陰性對照品為含幽門螺旋桿菌IgG抗體陰性的血清溶液；
所述陽性對照品為含幽門螺旋桿菌IgG抗體陽性的血清溶液。
進(jìn)一步的，所述洗滌液為含0.5g/L的吐溫-20的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
進(jìn)一步的，所述顯色液為四甲基聯(lián)苯胺的甲醇溶液，濃度為0.1mg/mL。
進(jìn)一步的，所述終止液為3mol/L H2SO4溶液。
進(jìn)一步的，所述封閉液為含4～6g/L的甘油、0.5～2g/L的烷基糖苷和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液。所述烷基糖苷具體為碳鏈長度為C8～C10的烷基糖苷。
進(jìn)一步的，所述陰性對照品為在含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，按5％的比例加入陰性血清制成，陰性對照的OD值應(yīng)小于0.15。
進(jìn)一步的，所述陽性對照品為在含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入陽性血清制成，陽性對照的OD值應(yīng)大于0.80。
本發(fā)明幽門螺旋桿菌IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的檢測原理：
本試劑盒在微孔板內(nèi)包被幽門螺旋桿菌抗原，若待測樣本中有幽門螺旋桿菌抗體即可與之結(jié)合，再與酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體反應(yīng)，形成“抗原-抗體-酶復(fù)合物”，酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色程度可判斷幽門螺旋桿菌IgG抗體的有無。另外，本發(fā)明試劑盒在包被抗原的過程中使用了含有甘油和烷基糖苷的封閉液，在酶標(biāo)記液中添加了聚乙二醇-200和殼聚糖。甘油和烷基糖苷的組合，以及聚乙二醇-200和殼聚糖的組合作為穩(wěn)定劑，對包被抗原、酶標(biāo)抗體起到了很好的保護(hù)作用，使包被抗原、酶標(biāo)抗體的親和力、免疫活性、靈敏度等不降低，從而顯著提高本發(fā)明試劑盒的保存期。
因此，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢在于：
本發(fā)明幽門螺旋桿菌IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高，且具有良好的穩(wěn)定性，在室溫條件下有效期為1年，在4℃條件下有效期可達(dá)3年，顯著提高了試劑盒的保存期，有利于幽門螺旋桿菌抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒在臨床上的推廣和應(yīng)用。
具體實(shí)施方式
下面將進(jìn)一步的詳細(xì)說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
在本發(fā)明中，幽門螺旋桿菌抗原和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體均可通過商業(yè)渠道獲得。C8～C10烷基糖苷(活性物52.0wt％)購自廣州市西陸化工有限公司。殼聚糖(有效物質(zhì)含量99％)購自西安南斯生物科技有限公司。
另外，下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和操作的方法，均按照常規(guī)方法進(jìn)行。
實(shí)施例1、本發(fā)明幽門螺旋桿菌IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒
本實(shí)施例試劑盒由幽門螺旋桿菌抗原包被板(96孔)、樣品稀釋液1瓶、酶標(biāo)記液1瓶、洗滌液1瓶、顯色液1瓶、陰性對照品1瓶、陽性對照品1瓶和終止液1瓶組成。
其中，所述幽門螺旋桿菌抗原包被板的制備過程為：將包被用的幽門螺旋桿菌抗原用0.05mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液液稀釋后，按0.1mL/孔包被到微孔板內(nèi)，在4℃吸附24小時后，用0.05mol/L pH9.5的磷酸鹽緩沖液洗板，再用封閉液在4℃封閉18小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后制得幽門螺旋桿菌抗原包被板。
所述樣品稀釋液為含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述酶標(biāo)記液為含0.5mg/L的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體、0.1mg/L的聚乙二醇-200和0.5mg/L的殼聚糖的15mmol/L pH8.5磷酸鹽緩沖液。
所述洗滌液為含0.5g/L的吐溫-20的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述顯色液為四甲基聯(lián)苯胺的甲醇溶液，濃度為0.1mg/mL。
所述終止液為3mol/L H2SO4溶液。
所述封閉液為含4g/L的甘油、0.5g/L的C8～C10烷基糖苷和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液。
所述陰性對照品為在含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，按5％的比例加入陰性血清制成，陰性對照的OD值應(yīng)小于0.15。
所述陽性對照品為在含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入陽性血清制成，陽性對照的OD值應(yīng)大于0.80。
實(shí)施例2、本發(fā)明幽門螺旋桿菌IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒
本實(shí)施例試劑盒由幽門螺旋桿菌抗原包被板(96孔)、樣品稀釋液1瓶、酶標(biāo)記液1瓶、洗滌液1瓶、顯色液1瓶、陰性對照品1瓶、陽性對照品1瓶和終止液1瓶組成。
其中，所述幽門螺旋桿菌抗原包被板的制備過程為：將包被用的幽門螺旋桿菌抗原用0.05mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液液稀釋后，按0.1mL/孔包被到微孔板內(nèi)，在8℃吸附26小時后，用0.05mol/L pH9.5的磷酸鹽緩沖液洗板，再用封閉液在8℃封閉20小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后制得幽門螺旋桿菌抗原包被板。
所述樣品稀釋液為含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述酶標(biāo)記液為含0.5mg/L的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體、0.6mg/L的聚乙二醇-200和1mg/L的殼聚糖的15mmol/L pH8.5磷酸鹽緩沖液。
所述洗滌液為含0.5g/L的吐溫-20的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述顯色液為四甲基聯(lián)苯胺的甲醇溶液，濃度為0.1mg/mL。
所述終止液為3mol/L H2SO4溶液。
所述封閉液為含6g/L的甘油、2g/L的C8～C10烷基糖苷和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液。
所述陰性對照品為在含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，按5％的比例加入陰性血清制成，陰性對照的OD值應(yīng)小于0.15。
所述陽性對照品為在含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入陽性血清制成，陽性對照的OD值應(yīng)大于0.80。
實(shí)施例3、本發(fā)明幽門螺旋桿菌IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒
本實(shí)施例試劑盒由幽門螺旋桿菌抗原包被板(96孔)、樣品稀釋液1瓶、酶標(biāo)記液1瓶、洗滌液1瓶、顯色液1瓶、陰性對照品1瓶、陽性對照品1瓶和終止液1瓶組成。
其中，所述幽門螺旋桿菌抗原包被板的制備過程為：將包被用的幽門螺旋桿菌抗原用0.05mol/L pH9.5的碳酸鹽緩沖液液稀釋后，按0.1mL/孔包被到微孔板內(nèi)，在6℃吸附24小時后，用0.05mol/L pH9.5的磷酸鹽緩沖液洗板，再用封閉液在6℃封閉18小時，棄除多余的封閉液，經(jīng)真空干燥處理后制得幽門螺旋桿菌抗原包被板。
所述樣品稀釋液為含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述酶標(biāo)記液為含0.5mg/L的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗人IgG抗體、0.3mg/L的聚乙二醇-200和0.8mg/L的殼聚糖的15mmol/L pH8.5磷酸鹽緩沖液。
所述洗滌液為含0.5g/L的吐溫-20的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液。
所述顯色液為四甲基聯(lián)苯胺的甲醇溶液，濃度為0.1mg/mL。
所述終止液為3mol/L H2SO4溶液。
所述封閉液為含5g/L的甘油、1g/L的C8～C10烷基糖苷和1.5g/L的蛋清白蛋白的20mmol/L pH9.0的磷酸鹽緩沖液。
所述陰性對照品為在含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，按5％的比例加入陰性血清制成，陰性對照的OD值應(yīng)小于0.15。
所述陽性對照品為在含0.2g/L的吐溫-20和0.5g/L酪蛋白的15mmol/L pH7.4的磷酸鹽緩沖液中，加入陽性血清制成，陽性對照的OD值應(yīng)大于0.80。
對比例1
與實(shí)施例3相比，本對比例的區(qū)別僅在于：所述封閉液中不添加C8～C10烷基糖苷，甘油含量由5g/L改為6g/L。
對比例2
與實(shí)施例3相比，本對比例的區(qū)別僅在于：所述封閉液中C8～C10烷基糖苷的含量由1g/L改為3g/L，甘油含量由5g/L改為3g/L。
對比例3
與實(shí)施例3相比，本對比例的區(qū)別僅在于：所述酶標(biāo)記液中不添加殼聚糖，聚乙二醇-200含量由0.3mg/L改為1.1mg/L。
對比例4
與實(shí)施例3相比，本對比例的區(qū)別僅在于：所述酶標(biāo)記液中殼聚糖的含量由0.8mg/L改為3mg/L。
試驗(yàn)例一、本發(fā)明幽門螺旋桿菌IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的檢測：
1.檢測方法的操作過程：
(1)試劑準(zhǔn)備：將試劑盒平衡至室溫；
(2)加樣：將所需數(shù)量的幽門螺旋桿菌抗原包被板條固定于板架上，各孔加入100μl樣品稀釋液，按序加入5μl待測樣本；每次實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對照(用雙波長檢測時可以不設(shè)空白對照)、陰性對照、陽性對照各2孔，分別加入陰性對照品、陽性對照品各100μl/孔；震蕩混勻，封板，37℃溫育10分鐘，用洗滌液洗板5次，拍干。
(3)加酶：每孔加入酶標(biāo)記液100μl，震蕩混勻，封板，37℃溫育10分鐘，用洗滌液洗板5次，拍干。
(4)顯色讀值：每孔加入顯色液50μl，混勻，封板，置37℃避光顯色10分鐘。每孔加終止液50μl，混勻，10分鐘內(nèi)完成結(jié)果測定。單波長測定：可用空白對照凋零，在酶標(biāo)儀450nm波長下測定各孔的OD值；雙波長檢測：在酶標(biāo)儀450nm/630nm波長下測定各孔OD值。
陰性對照的OD值應(yīng)<0.15，陽性對照的OD值應(yīng)>0.80。
本方面試劑盒檢測樣本為血清，分離的樣本可在2～8℃保存下存儲7天，長期存儲應(yīng)置-20℃，避免反復(fù)凍融，冷藏或冷凍保存的樣本使用前應(yīng)平衡至室溫，并充分混勻。
2.檢驗(yàn)結(jié)果的解釋：
(1)臨界值(Cutoff)計(jì)算：Cutoff＝陰性對照品OD值+0.2
(2)檢驗(yàn)結(jié)果的判斷：
[樣本的OD值]≤[Cutoff]為：幽門螺旋桿菌IgG抗體陰性。
[樣本的OD值]>[Cutoff]為：幽門螺旋桿菌IgG抗體陽性。
3.性能指標(biāo)：
(1)符合率：使用企業(yè)參考品進(jìn)行檢測，其中陽性參考品和陰性參考品符合率為100％。
(2)精密度：試驗(yàn)內(nèi)不精密度<15％；試驗(yàn)間不精密度<15％。
(3)常見藥物、病理狀態(tài)和內(nèi)源性物質(zhì)干擾：
A.下列藥物在2.5倍治療水平不影響檢測結(jié)果：利福平、異煙肼、吡嗪酰胺、鏈霉素、阿米卡星、青霉素、頭孢曲松、紅霉素、地高辛、心痛定、雷尼替丁、呋塞米、利多卡因、酮康唑、甲基強(qiáng)的松龍、強(qiáng)的松。
B.下列情況對于檢測結(jié)果無干擾：輕度溶血、血甘油三酯升高(>980mg/dL)、血糖升高(>11.1mmol/L)、膽紅素升高(>6.3mg/mL)、注射流感疫苗、HBV陽性、HCV陽性、HIV陽性、類風(fēng)濕因子陽性、肺炎、肺癌等。
試驗(yàn)例二、本發(fā)明幽門螺旋桿菌IgG抗體酶聯(lián)免疫診斷試劑盒的穩(wěn)定性考察：
1.包被抗原的活性檢測：
將實(shí)施例1～3和對比例1～2的幽門螺旋桿菌抗原包被板放置在37℃溫箱中進(jìn)行加速破壞試驗(yàn)，每隔2d取出2條放入4℃冰箱，連續(xù)取樣6次，在第6次取樣后，將所有酶標(biāo)板按照間接ELISA程序進(jìn)行測定，檢測包被抗原的活性。結(jié)果見下表1。
表1各包被抗原穩(wěn)定性比較試驗(yàn)結(jié)果
由上表1可知：實(shí)施例1～3酶標(biāo)板隨著時間的延長，P/N值變化不明顯，而對比例1(不含烷基糖苷)和對比例2(甘油和烷基糖苷的配比為1:1)酶標(biāo)板隨著時間的延長，P/N值均明顯下降，可見本發(fā)明甘油和烷基糖苷的組合能延長抗原的保存時間。
2.酶標(biāo)抗體的活性檢測：
將實(shí)施例1～3和對比例3～4的酶標(biāo)記液放置在37℃溫箱中進(jìn)行加速破壞試驗(yàn)，每隔1天取出并測定其D450值，連續(xù)測定12d。結(jié)果見下表2。
表2各酶標(biāo)抗體穩(wěn)定性比較試驗(yàn)結(jié)果
由上表2可知：經(jīng)過37℃溫箱加速破壞試驗(yàn)，實(shí)施例1～3酶標(biāo)抗體活性在12d仍然很高，在1.6左右，而對比例3(不含殼聚糖)的酶標(biāo)抗體很快失去活性，在第7d左右低于1.0，可見本發(fā)明聚乙二醇-200和殼聚糖的組合對酶標(biāo)抗體有很好的保護(hù)作用。另外，對比例4增加了殼聚糖的用量，但是其對酶標(biāo)抗體的保護(hù)作用并沒有提高，反而產(chǎn)生了影響。
3.試劑盒的有效期考察：
對實(shí)施例1～3和對比例1～4試劑盒分別在室溫和4℃條件下的有效期進(jìn)行考察，結(jié)果，實(shí)施例1～3試劑盒在室溫下保存12個月，在4℃下保存36個月，其靈敏度及線性良好，與剛制備的試劑盒無明顯差別。因此，實(shí)施例1～3試劑盒在室溫條件下有效期為1年，在4℃條件下有效期可達(dá)3年，顯著提高了試劑盒的保存期。而對比例1～4試劑盒在室溫條件下有效期在6個月以內(nèi)，對比例1～3試劑盒在4℃條件下有效期在12個月以內(nèi)，對比例4試劑盒在4℃條件下有效期約為18個月。
本發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個或更多個技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。