本發(fā)明涉及分析化學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于肉雞血清蛋白質(zhì)組的鑒定方法。

背景技術(shù)：

血清具有維持血液的正常粘度、酸堿度、滲透壓等作用，血清中的蛋白質(zhì)來(lái)源幾乎與所有細(xì)胞、組織、器官有關(guān)，從而可以直接反映機(jī)體的病理和生理狀態(tài)，是疾病診斷和生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的重要標(biāo)本。與組織蛋白和細(xì)胞蛋白相比，血清蛋白種類(lèi)繁多，性質(zhì)各異，還存在大量的蛋白質(zhì)剪切體、翻譯后修飾、降解片段。另外，血清蛋白質(zhì)的豐度差異巨大(蛋白濃度范圍跨越10個(gè)數(shù)量級(jí))，高豐度蛋白占據(jù)蛋白總量的99％以上，嚴(yán)重干擾低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)和鑒定。因此在進(jìn)行蛋白組學(xué)研究中，有必要先去除血清中的高豐度蛋白，以降低高豐度蛋白對(duì)低豐度蛋白質(zhì)的掩蓋作用，提高靈敏度，有助于更好地鑒定其他蛋白，促進(jìn)低豐度蛋白質(zhì)的檢出。

目前常用的技術(shù)有蛋白質(zhì)沉淀法、親和技術(shù)等。蛋白質(zhì)沉淀法采用乙腈、乙醇、丙酮等以不同程度地沉降血清中的高豐度蛋白，但是該方法的特異性不高；親和技術(shù)利用蛋白質(zhì)和其配體或抗體間的相互作用來(lái)特異結(jié)合白蛋白、IgG等高豐度靶蛋白，特異性高，但是該方法的成本增加，且值得注意的是，現(xiàn)有的商業(yè)化產(chǎn)品多針對(duì)物種來(lái)源為人和鼠的血清而開(kāi)發(fā)，使其應(yīng)用受限。

而目前尚無(wú)肉雞血清蛋白質(zhì)組鑒定方法的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于肉雞血清蛋白質(zhì)組的鑒定方法，利用膠內(nèi)酶解結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)以高通量鑒定肉雞血清蛋白的方法，能夠有效降低血清高豐度蛋白對(duì)質(zhì)譜分析時(shí)的干擾，增加檢出蛋白的數(shù)量和種類(lèi)，解決肉雞物種去除高豐度蛋白的方法受限問(wèn)題，為進(jìn)一步開(kāi)展肉雞血清蛋白與肉雞營(yíng)養(yǎng)、肉雞免疫的研究提供方法依據(jù)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：一種用于肉雞血清蛋白質(zhì)組的鑒定方法，采用膠內(nèi)酶解的方法肉雞血清蛋白進(jìn)行分級(jí)分離，通過(guò)nano-HPLC-MS/MS進(jìn)行分析，并獲得蛋白表達(dá)譜，然后通過(guò)GO分析獲得蛋白的功能和。

具體實(shí)現(xiàn)步驟如下：

(1)血清樣品采集：收集n只正常肉雞的血液，置于不含肝素的負(fù)壓管中，負(fù)壓管在冰上凝集15-20min，在溫度為4-8℃、離心力為1600-1800g條件下離心時(shí)間15-20min后取上清液，即為所需的n個(gè)血清樣品，獲得的血清樣品進(jìn)行蛋白定量；

(2)SDS-PAGE電泳：①取10～30μg蛋白進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10～15％的SDS-PAGE電泳，電泳條件：60～90V，20～30min，90～110V電泳直到溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠前緣時(shí)即可結(jié)束電泳；②用考馬斯亮藍(lán)染色方法對(duì)步驟①獲得的凝膠進(jìn)行染色：將凝膠置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％R-250染色液中，25-40℃搖床上振蕩染色1～2h，脫色液脫色30min～1h，超純水水洗，每30-40min換水一次，至凝膠背景脫凈、條帶清晰為止；所述染色液為乙醇、乙酸和水組成，其中乙醇和乙酸體積比在1:1～1:4，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1～0.125％的R-250，脫色液為乙醇、乙酸和水組成，其中乙醇和乙酸體積比在1:1～1:4；

(3)蛋白凝膠膠內(nèi)酶解：①高豐度蛋白40～70kDa，20～25kDa按照條帶大小切成1～2mm³大小的膠塊，其余蛋白條帶按照分子量的分布分別切成1～2mm³大小的膠塊；②步驟①中的凝膠用100-200μl脫色液脫色2-3次，15-20min，可重復(fù)脫色，直到考馬斯亮藍(lán)顏色脫盡為止，棄上清，于真空濃縮凍干機(jī)中凍干凝膠；所述脫色液為體積比為50:50的乙腈和25-100mM NH₄HCO₃溶液組成；③加入10-15mM，體積100-200μl DTT溶液，37-56℃恒溫箱中孵育45min-1h，棄廢液；④加入一定體積的50-100mM碘乙酰胺溶液，使得碘乙酰胺的物質(zhì)的量5倍于步驟③中所加DTT的物質(zhì)的量，室溫暗反應(yīng)30-45min，棄廢液；⑤加入100-200μl脫色液清洗2-3次，每次10-15min，于真空濃縮凍干機(jī)中凍干凝膠；⑥加入10-15μl胰酶溶液，于4℃或冰水混合物上放置20-30min，待凝膠溶脹；⑦加入15-20μl,25-100mM NH₄HCO₃溶液浸沒(méi)凝膠，37℃-40℃孵育過(guò)夜；⑧加入50-100μl提取液，所述提取液為1-5％甲酸溶液或三氟乙酸溶液，37℃-40℃孵育30min-1h，取上清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中；⑨膠塊中再次加入50-100μl提取液，所述提取液為體積比為50:50的乙腈和1-5％甲酸溶液或三氟乙酸溶液；⑩步驟⑧和⑨的兩次提取液合并，于真空濃縮凍干機(jī)中濃縮凍干，得到肽段樣品；

(4)樣品質(zhì)譜分析：將步驟(3)所獲得的肽段樣品，加入10-15μl,0.1-0.5％甲酸溶液，進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得肽段及其碎片離子的質(zhì)荷比。

所述樣品質(zhì)譜分析如下：

液相色譜條件：采用液相色譜系統(tǒng)，該液相色譜系統(tǒng)含二元溶劑管理器、自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱為C18柱，規(guī)格為0.075×150mm，5μm，進(jìn)樣量：1-5μL；上樣流動(dòng)相：3-5％乙腈+0.1％甲酸水溶液；分離流動(dòng)相：A為3-5％乙腈+5％DMSO+0.1％甲酸水溶液，B為90-95％乙腈+5％DMSO+0.1％甲酸溶液；以梯度洗脫條件對(duì)肽段混合物進(jìn)行分離，柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)；

質(zhì)譜條件：應(yīng)用串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，條件為電噴霧nanoESI離子源，掃描方式：正離子掃描模式，設(shè)置干燥氣流速和去簇電壓，MS掃描范圍m/z 350～1250，掃描速率為4-5spectrum/s，MS/MS掃描范圍m/z 100～1500，掃描速率為20-30spectrum/s，其中母離子動(dòng)態(tài)功能設(shè)置排除時(shí)間為20s 20-30s，在數(shù)據(jù)依賴(lài)模式下，選擇豐度最高的40-50個(gè)母離子進(jìn)行碰撞，其中豐度絕對(duì)閾值：150-200cps，價(jià)態(tài)滿(mǎn)足2+～4+，碰撞能量隨質(zhì)量數(shù)在目標(biāo)值±10V范圍內(nèi)自動(dòng)調(diào)整。

所述數(shù)據(jù)檢索如下：采用搜索引擎進(jìn)行檢索，數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源為蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，種屬選擇Gallus gallus，樣品類(lèi)型為Identification，半胱氨酸修飾選擇Iodoacetamide，胰酶酶切，儀器來(lái)源為T(mén)ripple TOF 6600，蛋白水平FDR(false discovery rate)設(shè)置為1％。

所述Gene Ontology分析如下：對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行Gene Ontology分析，采用生物信息學(xué)工具AmiGO v1.8進(jìn)行富集分析，得到血清蛋白組的細(xì)胞組分、分子功能及所參與的生物學(xué)過(guò)程。

所述n為5的整倍數(shù)。

所述液相色譜條件中的梯度洗脫條件：0～0.5min為95％變化至92％A相，0.5-40min線(xiàn)性變化至70％A相，40-48min線(xiàn)性變化至10％A相并保持6min，再切換95％A相并保持6min；流速為0.3μl/min。

所述質(zhì)譜條件中，干燥氣流速3psi，去簇電壓80V。

本發(fā)明對(duì)n個(gè)血清樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析過(guò)程中，將n個(gè)樣本進(jìn)行等質(zhì)量混合，以消除個(gè)體差異，并進(jìn)行兩次膠內(nèi)酶解及液質(zhì)聯(lián)用分析，以確保獲得可靠的數(shù)據(jù)。

本發(fā)明獲得的血清樣品可來(lái)自于21日齡后至屠宰前所有生長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)的肉雞樣本。

本發(fā)明具有的效果是：本發(fā)明所采用的膠內(nèi)酶解方法過(guò)程簡(jiǎn)易，成本低，同時(shí)采用納流高效液相色譜-串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用的蛋白質(zhì)組學(xué)研究平臺(tái)，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣品的高通量的分離，及高靈敏度的檢測(cè)，所鑒定的蛋白組經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)在免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激和細(xì)胞表面受體信號(hào)途徑中富集，這為進(jìn)一步開(kāi)展肉雞血清蛋白質(zhì)組的研究工作提供了依據(jù)。。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明方法的實(shí)現(xiàn)流程圖；

圖2為本發(fā)明中肉雞血清SDS-PAGE電泳圖；

圖3為本發(fā)明中膠內(nèi)酶解后液質(zhì)聯(lián)用分析的總離子流色譜圖；

圖4為本發(fā)明中兩次重復(fù)獲得的蛋白鑒定結(jié)果韋恩圖；

圖5為本發(fā)明中肉雞血清蛋白質(zhì)組的GO分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

如圖1所示，本發(fā)明方法的具體實(shí)現(xiàn)過(guò)程如下：

(1)血清樣品采集：收集5只正常肉雞的血液，置于不含肝素的負(fù)壓管中，負(fù)壓管在冰上凝集15-20min，在溫度為4-8℃、離心力為1600-1800g條件下離心時(shí)間15-20min后取上清液，獲得的血清樣品進(jìn)行蛋白定量，并等質(zhì)量混合。

(2)SDS-PAGE電泳：①取20μg蛋白進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12％的SDS-PAGE電泳，電泳條件：80V電泳30min后，110V電泳直到溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠前緣時(shí)即可結(jié)束電泳；②用考馬斯亮藍(lán)染色方法對(duì)步驟①獲得的凝膠進(jìn)行染色：將凝膠置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％R-250染色液中，25-40℃搖床上振蕩染色2h，脫色液脫色1h，超純水水洗約4h，每30min換水一次，至凝膠背景脫凈、條帶清晰為止；所述染色液為體積比為25:10:65的乙醇、乙酸和水組成，含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％的R-250，脫色液為體積比為45:10:45的乙醇、乙酸和水組成；圖2展示的是肉雞血清SDS-PAGE電泳圖，血清白蛋白(約70kDa)和載脂蛋白(約52kDa)占血清總蛋白含量高，從圖中可以看出55～72kDa的條帶顯色最明顯，說(shuō)明該部分的蛋白濃度最高，豐度高，質(zhì)譜分析結(jié)果亦鑒定為血清白蛋白和載脂蛋白。

(3)蛋白凝膠膠內(nèi)酶解：①高豐度蛋白按照條帶大小切成約1mm³大小的膠塊，其余蛋白條帶按照分子量的分布分別切成約1mm³大小的膠塊；②步驟①中的凝膠用100μl脫色液脫色兩次，每次15min，可重復(fù)脫色，直到考馬斯亮藍(lán)顏色脫盡為止，棄上清，于Labconco中凍干凝膠；所述脫色液為體積比為50:50的乙腈和50mM NH₄HCO₃溶液組成；③加入100μl 10mM DTT溶液，56℃恒溫箱中孵育45min，棄廢液；④加入100μl 50mM碘乙酰胺溶液，室溫暗反應(yīng)30min，棄廢液；⑤加入100μl脫色液清洗兩次，每次10min，于Labconco中凍干凝膠；⑥加入15μl胰酶溶液(10ng/μl)，于4℃放置30min，待凝膠溶脹；⑦加入15μl 50mM NH₄HCO₃溶液浸沒(méi)凝膠，37℃孵育過(guò)夜；⑧加入50μl提取液，所述提取液為5％甲酸溶液，37℃孵育1h，取上清轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中；⑨膠塊中再次加入50μl提取液，所述提取液為體積比為50:50的乙腈和5％甲酸溶液；⑩步驟⑧和⑨的兩次提取液合并，于Labconco中濃縮凍干。

(4)樣品質(zhì)譜分析：

將步驟(2)所獲得的樣品，加入10μl 0.1％甲酸溶液，待質(zhì)譜分析。

液相色譜條件：采用AB Sciex公司ekspert nano LC液相色譜系統(tǒng)，該系統(tǒng)含二元溶劑管理器、自動(dòng)進(jìn)樣器；色譜柱為C18柱，規(guī)格為0.075×150mm，5μm，進(jìn)樣量：1-5μL；上樣流動(dòng)相：5％乙腈+0.1％甲酸水溶液；分離流動(dòng)相：A為5％乙腈+5％DMSO+0.1％甲酸水溶液，B為90％乙腈+5％DMSO+0.1％甲酸溶液；梯度洗脫條件：0～0.5min為95％變化至92％A相，0.5-40min線(xiàn)性變化至70％A相，40-48min線(xiàn)性變化至10％A相并保持6min，再切換95％A相并保持6min；流速為0.3μl/min，柱后流出液不經(jīng)分流直接導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測(cè)；

質(zhì)譜條件：應(yīng)用AB Sciex Tripple TOF 6600串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，其條件為電噴霧nanoESI離子源，掃描方式：正離子掃描模式，干燥氣流速3psi，去簇電壓80V，MS掃描范圍m/z 350～1250，掃描速率為4spectrum/s，MS/MS掃描范圍m/z100～1500，掃描速率為20spectrum/s，其中母離子動(dòng)態(tài)功能設(shè)置排除時(shí)間為20s，在數(shù)據(jù)依賴(lài)模式下，選擇豐度最高的40個(gè)母離子進(jìn)行碰撞(豐度絕對(duì)閾值：150cps，價(jià)態(tài)滿(mǎn)足2+～4+)，碰撞能量隨質(zhì)量數(shù)在目標(biāo)值±10V范圍內(nèi)自動(dòng)調(diào)整。圖3展示了血清樣品經(jīng)膠內(nèi)酶解后的1個(gè)餾分進(jìn)樣分析后得到的總離子流色譜圖，橫向坐標(biāo)表示出峰時(shí)間，縱向坐標(biāo)表示峰的高度。

(5)數(shù)據(jù)檢索：

采用Protein Pilot搜索引擎進(jìn)行檢索，數(shù)據(jù)庫(kù)來(lái)源為Swissprot蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.uniprot.org/downloads)，種屬選擇Gallus gallus，樣品類(lèi)型為Identification，半胱氨酸修飾選擇Iodoacetamide，胰酶酶切，儀器來(lái)源TrippleTOF 6600，蛋白水平FDR(false discovery rate)設(shè)置為1％。圖4展示兩次重復(fù)下鑒定到的蛋白信息，從圖中可以看出，在兩次膠內(nèi)酶解及液質(zhì)聯(lián)用分析中被鑒定到的蛋白有551個(gè)，各自有84和258個(gè)蛋白唯一出現(xiàn)于一次鑒定中，總計(jì)鑒定蛋白數(shù)目893個(gè)。

(6)Gene Ontology分析：對(duì)鑒定的蛋白進(jìn)行Gene Ontology分析，采用生物信息學(xué)工具AmiGO v1.8進(jìn)行富集分析，討論血清蛋白組的細(xì)胞組分、分子功能及所參與的生物學(xué)過(guò)程。血清是反映機(jī)體狀態(tài)的重要生物樣本，血清蛋白組學(xué)的研究對(duì)象是血清中出現(xiàn)的全部蛋白質(zhì)，包括：組織分泌蛋白、免疫球蛋白、遠(yuǎn)程配體與受體蛋白、局部配體與受體蛋白、一過(guò)性蛋白、組織漏出蛋白、異常分泌蛋白和外源性蛋白等。圖5展示的是血清蛋白組在細(xì)胞組分、分子功能和生物學(xué)過(guò)程三方面的GO注釋?zhuān)瑱M坐標(biāo)為蛋白數(shù)目，縱坐標(biāo)為各類(lèi)注釋。由圖5可知，血清蛋白組主要組成了細(xì)胞的質(zhì)膜、膜內(nèi)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)、線(xiàn)粒體和血液小分子，發(fā)揮了分子結(jié)合功能，包括與核苷酸、蛋白、激酶、碳水化合物、細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合功能，以及酶的調(diào)節(jié)功能，參與到蛋白、脂肪和碳水化合物的代謝過(guò)程中，在免疫應(yīng)答、氧化應(yīng)激和細(xì)胞表面受體信號(hào)途徑，這些重要的生物學(xué)過(guò)程中亦有蛋白被鑒定到，這為進(jìn)一步開(kāi)展肉雞血清蛋白質(zhì)組的研究工作提供了依據(jù)。

本發(fā)明說(shuō)明書(shū)未詳細(xì)闡述部分屬于本領(lǐng)域公知技術(shù)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。