本發(fā)明涉及一種t2毒素的適配體親和柱及其制備方法和用途，屬食品安全檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

毒素是由多種真菌，主要是三線鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物(trichothecenes，ts)之一。它廣泛分布于自然界，是常見的污染田間作物和庫存谷物的主要毒素，對人、畜危害較大。t-2毒素為白色針狀結(jié)晶，在室溫條件下相當(dāng)穩(wěn)定，放置6~7年或加熱至100~120℃1小時毒性不減。t-2毒素帶有酯基，用堿處理后水解成相應(yīng)的醇。要使雙鍵還原可用接觸氫化。四氫鉀鋁或氫硼化鈉可使環(huán)氧基還原成醇。

毒素主要作用于細(xì)胞分裂旺盛的組織器官，如胸腺、骨髓、肝、脾、淋巴結(jié)、生殖腺及胃腸粘膜等，抑制這些器官細(xì)胞蛋白質(zhì)和dna合成。此外，還發(fā)現(xiàn)該毒素可引起淋巴細(xì)胞中dna單鏈的斷裂。t-2毒素還可作用于氧化磷酸化的多個部位而引起線粒體呼吸抑制。1973年聯(lián)合國糧農(nóng)組織(faq)和世界衛(wèi)生組織(who)在日內(nèi)瓦召開的聯(lián)席會議上，把這類毒素同黃曲霉素一樣作為自然存在的最危險(xiǎn)的食品污染源。我國國標(biāo)gb21693-2008規(guī)定，飼料中的t2毒素含量不能超過1000ug/kg。

目前t2毒素的檢測方法有薄層層析法、高效液相色譜法（hplc）、酶聯(lián)免疫吸附法（elisa）等。

其中薄層層析法是最早使用也是最廣泛使用的檢測t2毒素的方法，其優(yōu)點(diǎn)是適合于沒有經(jīng)過專門培訓(xùn)的人員操作,且成本低,無需價(jià)格昂貴的儀器,。但是薄層層析法對樣品處理繁瑣，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，所需檢測周期較長，容易受到雜質(zhì)的干擾。測定時用目測半定量,主觀影響較大,靈敏度不高等,已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測要求。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（elisa）檢測方法檢測特異、快速、靈敏度高、并且成本較低。成本低的特點(diǎn),適用于基層機(jī)構(gòu)大量樣品的篩選和普查,可以大大節(jié)省時間和費(fèi)用,因此越來越受到基層檢驗(yàn)單位的歡迎。elisa方法的主要問題是容易造成假陽性。因此主要用于基層的篩查檢測。

高效液相色譜法(hplc)具有準(zhǔn)確度高、靈敏性強(qiáng)、可微量測定等優(yōu)點(diǎn),是目前常用于食品中毒素檢測的方法。但因其對樣品中毒素純度的要求較高,導(dǎo)致檢測成本高、周期長,無法滿足大批量樣品快速篩選的需要,所以使用受到限制。今年來發(fā)展起來的免疫親和柱-高效液相色譜（iac-hplc)）將免疫親和純化技術(shù)與高效液相色譜相結(jié)合。使hplc的使用更加廣泛。免疫親和柱作為一種新的凈化技術(shù),在真菌毒素的分析檢測中應(yīng)用越來越廣泛。它是將特異性抗體結(jié)合到活化的固相載體上填充而成。當(dāng)樣品提取液通過柱子時,其中的抗原與抗體結(jié)合,其他雜質(zhì)則通過水溶液洗掉,再用有機(jī)溶劑將抗原即毒素洗脫下來,從而使樣品中的毒素得以凈化。

免疫親和柱具有操作簡單，特異性高的優(yōu)點(diǎn)。但是由于抗體獲得困難，免疫親和柱通常比較昂貴。并且由于抗體本身是一種蛋白質(zhì)，其活性受到周圍環(huán)境的影響。保存不當(dāng)或者操作不當(dāng)很容易造成抗體失活從而影響免疫親和柱的效率。

適配體是一段核酸序列，通常為dna或者rna序列。單鏈的核酸序列可以形成二級結(jié)構(gòu)，從而能與靶點(diǎn)特異性結(jié)合。通過多次的富集和篩選，能夠篩選到與靶點(diǎn)有高親和力的特異性適配體。herman等描述了核酸適配體的結(jié)合特異性，[science287,820-825].核酸適配體相對于抗體來說更穩(wěn)定，不易受到環(huán)境的影響，并且核酸適配體可以化學(xué)合成，保證序列的準(zhǔn)確性。[song.trendsanaly.chem2008.27(2)]。

核酸適配體被應(yīng)用于小分子的檢測，在專利cn103808701a中描述了一種基于赭曲霉毒素的核酸適配體熒光嵌合染料檢測赭曲霉毒素的方法，利用赭曲霉毒素的核酸適配體與互補(bǔ)序列形成一個檢測元件，利用嵌合染料作為報(bào)告分子檢測樣本中的赭曲霉毒素。在專利cn102735704a中，描繪了一種赭曲霉毒素的電化學(xué)傳感器，利用赭曲霉毒素的適配體包被在裸金電極上，制備電化學(xué)傳感器，用于檢測赭曲霉毒素。在專利cn105372213a中，描述了一種利用赭曲霉毒素適配體檢測方法，將赭曲霉毒素的適配體用上轉(zhuǎn)發(fā)光材料標(biāo)記，利用上轉(zhuǎn)發(fā)光材料的熒光能量轉(zhuǎn)移特性進(jìn)行檢測。

基于核酸適配體的檢測方法很多，但是凈化和純化方法較少。在專利cn104399283中，描述了一種黃曲霉毒素b1的適配體親和柱。該專利利用環(huán)氧基活化的瓊脂糖微球，將黃曲霉毒素b1的適配體偶聯(lián)，制備成親和柱。實(shí)現(xiàn)黃曲霉毒素的分離。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種t2毒素適配體親和柱及其制備方法和用途。在本發(fā)明中，我們利用selex系統(tǒng)，從適配體文庫中篩選出來一條高特異性、高親和力的的新的t2毒素的dna適配體。適配體修飾后與n-羥基琥珀酰亞胺活化的載體通過共價(jià)鍵進(jìn)行偶聯(lián)。經(jīng)過洗滌和封閉得到t2毒素的特異性載體。載體裝柱后就形成了高親和力的t2毒素適配體親和柱。該親和柱操作簡便，純化t2毒素毒素效率高。能耐受有機(jī)溶劑，并且可以重復(fù)使用。樣本經(jīng)過簡單的處理后就可以進(jìn)行純化，得到純度很高的t2毒素。用于高效液相色譜檢測和熒光儀檢測。

本發(fā)明最大的優(yōu)勢就是利用了核酸適配體的特性，通過多輪的富集、洗滌、擴(kuò)增等步驟，篩選出針對t2毒素的特異性適配體。通過序列測定得到適配體的序列。

核酸適配體相對于抗體來說，具有適應(yīng)環(huán)境廣泛，能夠耐受高溫、能耐受有機(jī)溶劑并且操作方便等優(yōu)點(diǎn)。最主要的，適配體在制備過程中不需要經(jīng)過動物體內(nèi)的過程，而是通過化學(xué)合成來獲得。因此，生產(chǎn)周期短，并且可以通過合成條件保證序列的準(zhǔn)確性。

以核酸適配體為基礎(chǔ)制備的親和柱具有特異性好，t2毒素結(jié)合量大，純化效率高的特點(diǎn)。

毒素適配體親和柱及其制備方法說明如下：⑴載體活化：選擇n-羥基琥珀酰亞胺（nhs）修飾的瓊脂糖載體sepharose4b，進(jìn)行活化。取1gn-羥基琥珀酰亞胺修飾的瓊脂糖，加入用50ml1mm的hcl，溶脹30min后，凝膠用100ml1mmhcl洗滌6次，再用100ml超純水洗滌。⑵將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4b用偶聯(lián)緩沖液（0.1m的nahco3，0.8mnacl，ph8.2）洗滌3次。加入20mol/l的氨基修飾的t2毒素適配體，室溫偶聯(lián)8小時。⑶將偶聯(lián)好的t2毒素適配體-瓊脂糖載體用20mm，ph7.4的磷酸緩沖液pbs洗滌3次。⑷封閉：將偶聯(lián)好的t2毒素適配體-瓊脂糖載體中加入100mmol/l的tris.clph8.0，室溫反應(yīng)2小時。⑸將封閉好的t2毒素適配體-瓊脂糖載體用20mm，ph7.4的磷酸緩沖液pbs洗滌3次。⑹裝柱：將t2毒素—瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量的t2毒素親和柱。層析柱的結(jié)構(gòu)如附圖1所示。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：⑴本發(fā)明充分的利用了核酸適配體的優(yōu)點(diǎn)，通過多輪的篩選和富集。得到了高特異性高親和力的t2毒素核酸適配體。該適配體能夠特異性的結(jié)合樣本中的t2毒素，降低了抗體親和柱經(jīng)常遇到的交叉反應(yīng)性。親和柱效率大幅度提高。核酸適配體不受操作環(huán)境和有機(jī)溶劑的影響，尤其適合真菌毒素類的脂溶性物質(zhì)的純化。相比較，由于免疫親和柱中的抗體不耐有機(jī)溶劑，有機(jī)溶劑常常會造成抗體的失活而使親和柱效率降低。此外，由于有機(jī)溶劑導(dǎo)致抗體失活，因此免疫親和柱通常為一次性使用。而核酸適配體親和柱可以耐受有機(jī)溶劑，可以重復(fù)使用多次，大幅度降低了使用成本。⑵本發(fā)明使用的核酸適配體可以通過化學(xué)合成法獲得，可以保證序列的正確性。大幅度降低了不同批次間的變異。而相對來說，不同批次的抗體來自于不同的小鼠或者兔子，導(dǎo)致抗體間質(zhì)量變異較大，使親和柱質(zhì)量存在差別。⑶使用本發(fā)明純化t2毒素操作簡便，幾步就可以得到純度較高的t2毒素。更方便操作者使用。⑷使用本發(fā)明的產(chǎn)品得到的t2毒素純度很高，后續(xù)不用再做別的純化處理就可以直接用于高效液相色譜檢測或者熒光檢測。節(jié)省了操作者的時間和費(fèi)用。

附圖說明

圖1：t2毒素適配體親和柱結(jié)構(gòu)組份示意圖

a：進(jìn)樣口塞；b：活塞適配器；c：穩(wěn)定箍；d：上篩板；e：柱體；f：載體填料；

g：下篩板；h：出樣口堵頭

圖2：t2毒素適配體親和柱外觀結(jié)構(gòu)圖

a：進(jìn)樣口塞；b：活塞適配器；c：穩(wěn)定箍；d：上篩板；e：柱體；f：載體填料；

g：下篩板；h：出樣口堵頭

圖3：玉米樣品中加入t2毒素標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜檢測圖

圖4：飼料樣品中加入t2毒素標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜檢測圖。

實(shí)施例1：利用氨基修飾的t2毒素適配體制備親和柱

本發(fā)明制備t2毒素適配體親和柱的一個優(yōu)選的實(shí)施方案如下：

1.載體活化：

選擇n-羥基琥珀酰亞胺（nhs）修飾的瓊脂糖載體sepharose4b，進(jìn)行活化；取1gn-羥基琥珀酰亞胺修飾的瓊脂糖，加入用50ml1mm的hcl，溶脹30min后，凝膠用100ml1mmhcl洗滌6次，再用100ml超純水洗滌；

2.將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4b用偶聯(lián)緩沖液（0.1m的nahco3，0.8mnacl，ph8.2）洗滌3次。加入20mol/l的氨基修飾的t2毒素適配體，室溫偶聯(lián)8小時；

3.將偶聯(lián)好的t2毒素適配體-瓊脂糖載體用20mm，ph7.4的磷酸緩沖液pbs洗滌3次；

4.封閉：將偶聯(lián)好的t2毒素適配體-瓊脂糖載體中加入100mmol/l的tris.clph8.0，室溫反應(yīng)2小時；

5.將封閉好的t2毒素適配體-瓊脂糖載體用20mm，ph7.4的磷酸緩沖液pbs洗滌3次；

6.裝柱：將t2毒素—瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量的t2毒素親和純化柱。將交聯(lián)后的t2毒素-瓊脂糖凝膠用10毫升20mmpbsph7.4重懸，然后裝入空的親和純化柱柱體中

1)取空的柱體，加入下方篩板，加入1mlpbs，使其自然流干；

2)加下方出樣口堵頭，在柱體中加入1ml上述處理后的t2毒素適配體-瓊脂糖凝膠載體，靜止5分鐘，使載體自然沉降；

3)加入上方篩板，按壓篩板，使其到達(dá)載體上方；

4)加入活塞適配器，適配器有一個壓緊作用，使上方篩板緊貼載體；

5)從下方將穩(wěn)定箍套在柱體上，使其緊貼進(jìn)樣口；

6)拔掉出樣口堵頭，用注射器取5mlpbs，將注射器接在進(jìn)樣口上，緩慢的將pbs注入親和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液體注入親和柱；

7)套上出樣口堵頭，套上進(jìn)樣口塞，將制備好的t2毒素適配體親和柱放入4℃保存

實(shí)施例2：利用生物素修飾的t2毒素適配體制備親和柱

本發(fā)明制備t2毒素適配體親和柱的一個優(yōu)選的實(shí)施方案如下：

1.取1ml鏈霉親和素（sa）修飾的瓊脂糖凝膠sepharose4b，用10ml超純水洗滌3次；

2.將（sa）修飾的瓊脂糖凝膠sepharose4b用偶聯(lián)緩沖液（0.02m的pbs，0.8mnacl，ph7.4）洗滌3次。加入20mol/l的生物素修飾的t2毒素適配體，室溫偶聯(lián)4小時；

3.將偶聯(lián)好的t2毒素適配體-瓊脂糖載體用20mm，ph7.4的磷酸緩沖液pbs洗滌3次；

4.裝柱

將t2毒素—瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量的t2毒素親和純化柱

1)取空的柱體，加入下方篩板，加入1mlpbs，使其自然流干；

2)加下方出樣口堵頭，在柱體中加入1ml上述處理后的t2毒素適配體-瓊脂糖凝膠載體，靜止5分鐘，使載體自然沉降；

3)加入上方篩板，按壓篩板，使其到達(dá)載體上方；

4)加入活塞適配器，適配器一個壓緊作用，使上方篩板緊貼載體；

5)從下方將穩(wěn)定箍套在柱體上，使其緊貼進(jìn)樣口；

6)拔掉出樣口堵頭，用注射器取5mlpbs，將注射器接在進(jìn)樣口上，緩慢的將pbs注入親和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液體注入親和柱；

7)套上出樣口堵頭，套上進(jìn)樣口塞，將制備好的t2毒素適配體親和柱放入4℃保存

實(shí)施例3：利用t2毒素適配體親和柱純化和檢測玉米樣品中的t2毒素

本實(shí)施例利用正常的玉米樣本定量加入t2毒素的標(biāo)準(zhǔn)品，然后用t2毒素適配體親和柱進(jìn)行純化，純化后用高效液相色譜檢測。測定回收率。1.玉米樣品處理：按照每克樣品500ng的標(biāo)準(zhǔn)，在粉碎后的玉米樣品中添加t2毒素標(biāo)準(zhǔn)品

1)提取

----20g±0.01g樣品（固體樣品需粉碎，并過2mm分樣篩），5g氯化鈉于三角瓶中，加入100ml的80%甲醇；

----高速均質(zhì)（≥10,000r/min）1min（或用搖床200r/min～300r/min劇烈振蕩20min）；

----用快速定性濾紙過濾，收集濾液；

----取10ml濾液加入40ml去離子水稀釋，混勻；

----用微纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液；

----取25ml上樣液過t2毒素適配體親和柱凈化；

稀釋倍數(shù)：1

2)凈化

----將t2毒素適配體親和柱連接于10.0ml一次性注射器下。準(zhǔn)確移取相應(yīng)的樣品提取液注入一次性注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以1～2滴/秒的速度流出；

---待液體排干，用10ml去離子水淋洗免疫親和柱兩次，流速2~3滴/秒；

----待液體排干后，更換新針筒，上樣2ml洗脫液（2%乙酸甲醇溶液），用試管接洗脫液，流速1滴/秒，收集洗脫液并定容至2ml；

----洗脫液用0.22μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于hplc分析；

2.洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜hplc檢測；

高效液相色譜檢測結(jié)果見表1，色譜圖見附圖3：

從檢測結(jié)果可以看出，在1g的粉碎后玉米樣品中加入500ng的t2毒素，用本發(fā)明的適配體親和柱可以回受到511.05ng。回收率為102.21%。

實(shí)施例4：利用t2毒素適配體親和柱純化和檢測飼料樣品中的t2毒素

按照每克樣品500ng的標(biāo)準(zhǔn)，在豬配合飼料樣品中添加t2毒素標(biāo)準(zhǔn)品；

1.前處理

1)25g±0.01g樣品（固體樣品需粉碎，并過2mm分樣篩）加入5g氯化鈉與125ml提取液（70%甲醇-水溶液）混勻；

2)高速均質(zhì)（≥10,000r/min）1min，或搖床（200r/min～300r/min）劇烈振蕩20min，用快速定性濾紙過濾，收集濾液；

3)取10ml濾液加入20ml蒸餾水稀釋（稀釋后的液體ph值應(yīng)保證在6~8之間，可用1m“naoh”或“hcl”進(jìn)行調(diào)節(jié)），再用微纖維濾紙過濾，并收集濾液作為上樣液；

4)取15ml上樣液過t2毒素適配體親和柱凈化；

2.凈化

1)將t2毒素適配體親和柱連接于10.0ml一次性注射器下。按照前處理要求，準(zhǔn)確移取相應(yīng)體積的樣品提取液注入一次性注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接調(diào)節(jié)開關(guān)，使液體以1～2滴/秒的速度流出；

2)待液體排干后，用蒸餾水或去離子水洗滌2次，每次10ml；

3)待液體排干后，上樣1ml甲醇，流速1滴/秒，收集洗脫液并定容至1ml；

4)洗脫液用0.22μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于hplc分析；

5)檢測結(jié)果見表2：

色譜圖見附圖4。

實(shí)施例5：t2毒素適配體親和柱重復(fù)使用柱容量的變化

本實(shí)施例利用定量的t2毒素的標(biāo)準(zhǔn)品，然后用t2毒素適配體親和柱進(jìn)行純化。親和柱上的t2毒素用有機(jī)溶劑洗脫后，用高效液相色譜檢測其濃度。親和柱重新平衡后重復(fù)上樣和洗脫，測定洗脫的t2毒素濃度。主要目的是測試t2毒素適配體親和柱的重復(fù)使用性

1.配制10ug/ml的t2毒素標(biāo)準(zhǔn)品；

2.取出t2毒素適配體親和柱，打開進(jìn)樣口塞，進(jìn)樣口與注射器針筒連接，注射器接入到氣控操作架上；

3.打開出樣口塞，用10mmol/lpbsph7.4洗滌親和柱3次，每次10毫升，調(diào)節(jié)氣孔操作架氣泵壓力，使液體以3滴/秒的流速流出；

4.取100ul上述配制的t2毒素標(biāo)準(zhǔn)品，總量1ug，加入親和柱柱中，調(diào)節(jié)流量至1-2滴/秒。直至樣品全部流出親和柱；

5.用蒸餾水洗滌純化柱3次，每次5毫升；

6.加入1ml甲醇，收集洗脫產(chǎn)物；

7.洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜hplc檢測；

8.親和柱用超純水洗滌3次，每次10ml，然后用10mmol/lpbsph7.4洗滌親和柱3次，每次10毫升；

9.再次上樣100ult2毒素標(biāo)準(zhǔn)品，總量1ug；

10.按照上述操作洗滌及洗脫，洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜檢測其濃度；

11.再重復(fù)步驟8.9.10三次。檢測洗脫產(chǎn)物的濃度；

12.計(jì)算總共5次的t2毒素適配體親和柱純化的回收率；

高效液相色譜檢測結(jié)果見表4：

從上述結(jié)果可以看出，t2毒素適配體親和柱重復(fù)使用5次后，其結(jié)合能力沒有明顯的降低。

t2毒素適配體序列

5’-ttttttcagatgcacgacttcgagtcttcacctctcgcatgtgtaaacacgcgatgcttgatatacaggatcaagcttctgagctg-3