本發(fā)明屬于茶葉判別技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于手性定量分析技術(shù)的紅茶產(chǎn)地判別方法。

背景技術(shù)：

紅茶歷來是國際茶葉市場的主流產(chǎn)品，約占世界茶葉貿(mào)易量的75%。紅茶產(chǎn)區(qū)分布極廣，尤其在印度、斯里蘭卡和中國南部等地區(qū)紅茶生產(chǎn)在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟占據(jù)重要地位。中國是世界上最早發(fā)明和加工紅茶的國家，紅茶產(chǎn)地更是遍布大江南北，涉及云南、四川、重慶、湖北、湖南、福建、廣東、廣西、海南、江西、浙江、安徽、江蘇、臺灣等14個省、自治區(qū)、直轄市。不同產(chǎn)地的紅茶在風(fēng)味品質(zhì)上有較大的差異，受喜愛程度自然因人而異，價格上亦參差不齊。在利益的驅(qū)使下，有部分不法商家低價收購其它產(chǎn)地的茶葉以次充好，從中謀取巨額利益，給原產(chǎn)地的名優(yōu)紅茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了較大的負(fù)面影響。近年來，各地名優(yōu)紅茶紛紛申請原產(chǎn)地保護，但由于分析技術(shù)上的局限性，目前主要的判定手段主要依靠感官審評技術(shù)。然而，感官審評技術(shù)對評茶員的經(jīng)驗資歷有著極高的要求，且耗時耗力，不適合商業(yè)運作上大批量的樣品分析。另一方面，感官審評技術(shù)雖然可以直觀反映樣品的品質(zhì)特性，但其品質(zhì)特性受審評人員主觀因素干擾較大，難以實現(xiàn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化。因此，急需一種客觀且可操作性強的分析檢測方法來實現(xiàn)紅茶產(chǎn)地的精確判別，以促進標(biāo)準(zhǔn)化管理，健全追溯管理體系，從而保證紅茶產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

茶葉香氣是評價茶葉品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一，其實質(zhì)是成百上千種芳香物質(zhì)以不同濃度組合對人類嗅覺神經(jīng)綜合作用的結(jié)果。由于品種、氣候及環(huán)境等多種因素的綜合影響，不同產(chǎn)地的茶葉在香氣組成上往往也有較大差異。因此，可以考慮利用不同產(chǎn)地紅茶的特征性香氣成分的含量建立相應(yīng)預(yù)測模型，從而通過量化數(shù)據(jù)實現(xiàn)產(chǎn)地判別的目的。然而，由于茶葉香氣化合物繁多復(fù)雜，化學(xué)性質(zhì)各異，全組分香氣物質(zhì)的定性定量方法一直是相關(guān)學(xué)術(shù)領(lǐng)域研究的難點，目前已報道的分析方法雖較成熟，但在實際操作上繁瑣復(fù)雜，費時較長，不適用于大批量茶樣分析。另一方面，由于茶葉的基質(zhì)效應(yīng)，茶葉香氣中存在多種干擾性成分，在很大程度上會影響預(yù)測模型的聚類效果，難以實現(xiàn)將眾多茶樣按產(chǎn)地分類的目的。因此，若能采用關(guān)鍵差異性香氣成分來組建不同產(chǎn)地紅茶的預(yù)測模型，不僅可以大量縮減分析工作量，更可以提高預(yù)測模型的準(zhǔn)確性。

揮發(fā)性萜類化合物是紅茶香氣的關(guān)鍵組成，具有宜人的香氣及較低的香氣閾值，對成茶香氣品質(zhì)有著重要影響。揮發(fā)性萜類化合物往往含有1個甚至多個手性碳原子，存在香氣特性完全不同的對映異構(gòu)體，如S-(+)-芳樟醇具有甜香及橙花香，香氣閾值為7.4 μg?L^-1，R-(-)-芳樟醇具有木香和類似薰衣草的香氣特征，香氣閾值為0.8 μg?L^-1；S-(-)-檸檬烯呈現(xiàn)檸檬香氣，而R-(+)-檸檬烯則具有松脂氣味。鑒于不同產(chǎn)區(qū)的紅茶在香氣品質(zhì)上存在較大差異，其香氣中萜類化合物對映異構(gòu)體比例及含量也很可能會具有一定的地域特征性，非常適合作為茶葉產(chǎn)地判別模型的關(guān)鍵變量。然而，由于過去分析手段的限制及缺乏對茶葉中手性化合物的科學(xué)認(rèn)知，目前還未有基于手性定量分析技術(shù)的茶葉產(chǎn)地判別方法的相關(guān)文獻或?qū)＠麍蟮馈?/p>

偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計分析方法，其原理是對不同處理樣本（如觀測樣本、對照樣本）的特性分別進行訓(xùn)練，產(chǎn)生訓(xùn)練集，并檢驗訓(xùn)練集的可信度。PLS-DA是近年來應(yīng)用實際需要而產(chǎn)生和發(fā)展的一個具有廣泛使用性的新型多元統(tǒng)計分析方法，是多元線性回歸、主成分分析和典型相關(guān)分析的有機結(jié)合。采用該統(tǒng)計方法，在構(gòu)造因素時考慮到了輔助矩陣以代碼形式提供的類成員信息，因此具有高效的預(yù)測及鑒別能力。目前，在茶葉產(chǎn)地鑒別領(lǐng)域還未有用手性定量分析技術(shù)結(jié)合PLS-DA的相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明旨在提供一種客觀、可量化且便捷的紅茶產(chǎn)地判別方法。本發(fā)明采用手性定量分析技術(shù)，僅需查明茶葉香氣中若干種常見手性萜類化合物的含量，通過PLS-DA分析即可實現(xiàn)不同產(chǎn)地紅茶的快速、有效鑒別。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

1）不同產(chǎn)地紅茶中手性萜類化合物的含量測定

收集各不少于5個的不同產(chǎn)地的紅茶樣品，測定芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、α-松油醇、4-萜品醇、檸檬烯及α-紫羅蘭酮對映異構(gòu)體在紅茶中的含量，根據(jù)茶葉產(chǎn)地對茶葉進行分組，依次按列發(fā)布所獲得的萜類化合物對映異構(gòu)體含量，導(dǎo)入EXCEL電子表格中；

2）不同產(chǎn)地紅茶的PLS-DA模型的建立及驗證

將萜類化合物對映異構(gòu)體的含量數(shù)據(jù)導(dǎo)入Simca-p 11.5軟件，選擇校正集樣本，以萜類化合物含量矩陣為自變量，產(chǎn)地分類信息為觀察變量，建立校正集的偏最小二乘法判別分析PLS-DA模型；對已建立的PLS-DA模型進行置換檢驗試驗，驗證模型是否存在“過擬合”現(xiàn)象；將驗證集里的茶葉樣品代入到PLS-DA模型中，檢驗其判別準(zhǔn)確率；

3）未知紅茶樣品的產(chǎn)地預(yù)測

依照步驟1）對未知產(chǎn)地的紅茶樣品中手性萜類化合物進行定量分析，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入已建立的PLS-DA預(yù)測模型中，依照步驟2）代入已建立的紅茶產(chǎn)地判別模型中，計算該茶樣在每個Class中的分類變量值Y_predict，當(dāng)某Class中的Y_predict＞0.5，且偏差＜0.5，則判定該紅茶屬于該Class對應(yīng)的產(chǎn)地。

進一步的，所述步驟1）具體包括以下步驟：

a）手性萜類化合物的定量工作曲線繪制

采用手性氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、4-萜品醇、α-松油醇、檸檬烯及α-紫羅蘭酮等揮發(fā)性萜類化合物標(biāo)準(zhǔn)品的相應(yīng)對映異構(gòu)體，記錄每個化合物的保留時間、特征峰離子及定量離子；配置一系列不同濃度梯度的上述化合物的混合溶液，分別取10 μL于已預(yù)處理過的空白茶樣中，頂空固相微萃取法結(jié)合手性氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)分析空白茶樣中揮發(fā)出的混合標(biāo)準(zhǔn)品；建立各萜類化合物對映異構(gòu)體濃度與定量離子峰面積間的線性方程，從而繪制出芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、4-萜品醇、α-松油醇、檸檬烯及α-紫羅蘭酮對映異構(gòu)體的定量工作曲線；

b）不同產(chǎn)地中紅茶樣品中手性萜類化合物的含量測定

采用與步驟a）相同的頂空固相微萃取條件萃取不同產(chǎn)地紅茶的香氣成分，依照與步驟a）相同的GC-MS方法分析紅茶中的香氣成分；利用步驟a）中記錄的特征峰離子及保留時間定性出不同茶葉中含有的目標(biāo)萜類化合物對映異構(gòu)體，并記錄其定量離子峰面積；將峰面積分別代入到步驟a）建立的工作曲線，從而計算出芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、α-松油醇、4-萜品醇、檸檬烯及α-紫羅蘭酮對映異構(gòu)體在不同產(chǎn)地紅茶中的含量；將獲得的數(shù)據(jù)按產(chǎn)地分類導(dǎo)入EXCEL表。

進一步的，所述步驟2）具體包括以下步驟：

a）將所有茶葉樣品分為兩個子集，大部分樣本用于建立校正集參與建模，且校正集樣本需涵蓋所有的茶葉產(chǎn)地；剩下的小部分樣本用于驗證模型的準(zhǔn)確性，作為驗證集；

b）將含有手性萜類化合物含量的EXCEL數(shù)據(jù)表導(dǎo)入Simca-p 11.5軟件，將校正集里的樣本按產(chǎn)地分類，設(shè)為class 1-n，其中n為產(chǎn)地數(shù)，任意設(shè)定數(shù)字對應(yīng)的產(chǎn)地；

c）將已知的不同產(chǎn)地紅茶的萜類化合物含量矩陣設(shè)為自變量X，產(chǎn)地分類信息設(shè)為觀察變量Y，通過該軟件的自動擬合功能，建立PLS-DA模型；

d）對獲得的PLS-DA模型進行精制，若某樣本不在95%的置信區(qū)間內(nèi)，則說明該樣本代表性不足，應(yīng)舍去該樣本并對校正集進行重新擬合；擬合參數(shù)R²Y及Q²越接近1，說明該模型的預(yù)測能力越強；

e）對已建立校正集的PLS-DA模型進行200次置換檢驗試驗，測試通過累計交叉有效性Q²為負(fù)值則說明該模型無過擬合現(xiàn)象，模型的可靠度高，可進行下一步的驗證集樣本驗證；

f）使用分析軟件里的預(yù)測功能，將驗證集里的茶葉樣品代入到已建立的PLS-DA模型中，軟件自動計算驗證集樣品在已按產(chǎn)地分好的Class中的各分類變量值Y_predict；當(dāng)Y_predict＞0.5，且偏差＜0.5，判定待測樣本屬于該類；當(dāng)Y_predict＜0.5，且偏差＜0.5，判定樣本不屬于該類；當(dāng)偏差＞0.5，表明該分類模型不穩(wěn)定；若驗證集中茶樣的產(chǎn)地正確判別率達(dá)90%以上，證明該PLS-DA分類模型具有較高的預(yù)測準(zhǔn)確度和預(yù)測穩(wěn)定性。

進一步的，所述頂空固相微萃取方法為：準(zhǔn)確稱取樣品1.00 g至250 mL頂空萃取瓶中，加入10.0 mL沸水沖泡，放入50 oC水浴鍋平衡5.0 min，然后插入裝有DVB/CAR/PDMS萃取頭的手動SPME手柄在50 oC水浴條件下頂空萃取，萃取時間為40 min，取出后立即插入GC-MS進樣口中解吸附3.0 min，同時啟動儀器收集數(shù)據(jù)；

所述手性GC-MS分析方法：儀器型號：Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀；氣相條件：CP7500CP-Cyclodextrin為手性色譜柱；進樣口溫度為220 oC，傳輸線溫度為250 oC；進樣量為1.0 μL，分流進樣，分流比為10:1；載氣為高純度氦氣：純度≥99.99％，流速為1.2 mL/min；柱溫箱采用程序升溫：50 oC保持2 min，然后以2 oC/min升到150 oC保持10 min，再以4 oC/min升到180 oC保持5 min；質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量-70 eV；離子源溫度220 oC；質(zhì)量掃描范圍m/z 33-600 u。

本發(fā)明具有以下有益效果：1）在分析方法上首次將手性氣相色譜技術(shù)運用于紅茶的產(chǎn)地判別領(lǐng)域，僅需測定茶葉中數(shù)十種手性揮發(fā)性組分的含量即可建立預(yù)測模型，操作簡便且排除人為因素干擾，客觀反映各紅茶的產(chǎn)地信息；2）目標(biāo)物（手性萜類化合物）的提取方法方便快捷，綠色環(huán)保：僅需1克茶樣和少量純凈水即可完成，避免了珍貴茶葉樣品的浪費，同時對環(huán)境不造成污染；3）建模過程操作簡單，僅需將目標(biāo)茶樣的數(shù)據(jù)信息導(dǎo)入simca-p軟件，通過軟件自動擬合即可生成其特定的分類信息表，避免了人為計算失誤的風(fēng)險；4）該模型預(yù)測能力強，能有效判別出多類（4類以上）紅茶的產(chǎn)地信息。

附圖說明

圖1為不同產(chǎn)地茶葉的PLS-DA聚類效果圖；

圖2為PLS-DA的驗證模型圖；

圖3為驗證集樣本在每個Class中的分類變量值列表圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實例及附圖來對本發(fā)明做進一步的解釋說明。本實例僅用于具體說明該方法，而并非對本發(fā)明的范圍進行限制，任何依照本發(fā)明的教導(dǎo)所做出的改動或改進，均屬于本發(fā)明的保護范圍。

實施例1：廣東英德紅茶、安徽祁門紅茶、云南滇紅及斯里蘭卡紅茶的產(chǎn)地判別：通過對各紅茶中手性萜類化合物的含量進行PLS-DA建模，從而預(yù)測出紅茶的相應(yīng)產(chǎn)地信息。

具體操作步驟：

1）收集廣東英德紅茶、安徽祁門紅茶、云南滇紅及斯里蘭卡錫蘭紅茶各20個。

2）手性萜類化合物定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

購買市售的R-芳樟醇、芳樟醇消旋體、呋喃型芳樟醇氧化物（A、B混合物）、吡喃型芳樟醇氧化物（C、D混合物）、S-4-萜品醇、4-萜品醇消旋體、R-α-松油醇、α-松油醇消旋體、R-檸檬烯、檸檬烯消旋體及α-紫羅蘭酮標(biāo)準(zhǔn)品，對上述標(biāo)準(zhǔn)品進行手性GC-MS分析，記錄保留時間，確定相應(yīng)特征離子峰和定量離子峰。

分析方法如下：儀器型號：Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀（美國Agilent公司）。氣相條件：CP7500CP-Cyclodextrin（50 m×0.25 mm×0.25 μm，美國Agilent公司）為手性色譜柱；進樣口溫度為220 oC，傳輸線溫度為250 oC；進樣量為1.0 μL，分流進樣，分流比為10:1；載氣為高純度氦氣（純度≥99.99％），流速為1.2 mL/min；柱溫箱采用程序升溫：50 oC保持2 min，然后以2 oC/min升到150 oC保持10 min，再以4 oC/min升到180 oC保持5 min。質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子能量-70 eV；離子源溫度220 oC；質(zhì)量掃描范圍m/z 33-600 u。

配置一系列濃度范圍（參考范圍：1 ng/g-1 μg/g，濃度梯度不少于5個）的R-芳樟醇、呋喃型芳樟醇氧化物（A、B混合物）、吡喃型芳樟醇氧化物（C、D混合物）、S-4-萜品醇、R-α-松油醇、R-檸檬烯及α-紫羅蘭酮的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（溶劑為色譜級無水乙醚），分別添加10 μL到已處理過的空白茶樣中（揮發(fā)性物質(zhì)已通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空蒸發(fā)），通過HS-SPME萃取香氣成分后進行手性GC-MS進行分析，建立以上化合物的定量離子峰面積與濃度間的線性方程。使用該分析方法建立的線性方程，線性相關(guān)系數(shù)高達(dá)0.99以上。

在建立了上述工作曲線之后，采用相同萃取條件和GC-MS分析方法對待建模的茶樣進行分析，根據(jù)特征離子峰定性目標(biāo)化合物，將定量離子峰面積帶入相應(yīng)線性方程，計算出目標(biāo)萜類化合物在茶樣中的含量。將獲得的化合物含量數(shù)據(jù)依照茶葉產(chǎn)地逐一排序，導(dǎo)入EXCEL表。

茶樣處理條件：準(zhǔn)確稱取樣品1.00 g至自制的250 mL頂空萃取瓶中，加入10.0 mL沸水沖泡，放入50 oC水浴鍋平衡5.0 min，然后插入裝有DVB/CAR/PDMS萃取頭的手動SPME手柄在50 oC水浴條件下頂空萃取，萃取時間為40 min，取出后立即插入GC-MS進樣口中解吸附3.0 min，同時啟動儀器收集數(shù)據(jù)。

3）四個產(chǎn)地紅茶的PLS-DA模型的建立

將所有茶葉樣品（80個）分為兩個子集，63個樣本用于建立校正集參與建模，包括16個英德紅茶、15個祁門紅茶、16個滇紅及16個錫蘭紅茶；剩下的17個樣本用于驗證模型的準(zhǔn)確性，作為驗證集。

將步驟2）里得到的EXCEL數(shù)據(jù)表導(dǎo)入Simca-p 11.5軟件，將校正集里的樣本按產(chǎn)地分類，所有英德紅茶歸入Class 1，所有滇紅歸入Class 2，所有錫蘭紅茶歸入Class 3，所有祁門紅茶歸入Class 4；選擇PLS-DA分析模式，通過該軟件的自動擬合（Autofit）功能，建立PLS-DA模型，該模型包含5個主成分，且獲得的PLS-DA模型具有較好的模型解釋率和預(yù)測率：R²Y = 0.923, Q² = 0.827；通過得分圖（Score Scatter Plot）發(fā)現(xiàn)所有參與建模的樣本均分布在95%的置信區(qū)間內(nèi)，且不同產(chǎn)地的茶葉均能得到良好的聚類效果（圖1）。

為避免過擬合現(xiàn)象，對已建立的PLS-DA模型進行200次置換檢驗試驗，建立驗證模型，如圖2所示，四個Class的R²Y值構(gòu)成的回歸線截距分別為0.450, 0.433, 0.415, 0.402，Q²Y構(gòu)成的回歸線截距為-0.546, -0.585, -0.547, -0.649，所有通過隨機排序計算得到的R²(cum)和Q²(cum)值均小于原始值，Q²回歸直線與Y軸的截距均小于0。以上的數(shù)據(jù)充分說明了所建立的產(chǎn)地判別模型不存在過擬合現(xiàn)象，模型較為可靠。

打開軟件的預(yù)測功能（Prediction）選項中的Classification，軟件自動生成所有樣本在每個Class內(nèi)的分類變量值Y_predict，發(fā)現(xiàn)所有的茶樣在其歸屬的Class內(nèi)Y_predict＞0.5，且偏差＜0.5，反之在其它Class里Y_predict無限接近于0，說明該模型的回判率高達(dá)100%，進一步說明該模型具有優(yōu)異的預(yù)測能力。

4）已建立PLS-DA判別模型的驗證集驗證

打開預(yù)測功能（Prediction）選項中的Specify功能，將驗證集里的17個樣本代入到PLS-DA模型的觀察變量中；打開軟件的預(yù)測功能（Prediction）選項中的Classification，軟件自動生成所有驗證集樣本在每個Class內(nèi)的分類變量值（Y_predict）；如圖3所示，大部分樣本的Y_predict＞0.5，且偏差＜0.5（顯綠色），而僅有1個樣本即Dianhong-1（滇紅）的Y_predict雖然大于0.5，但其偏差＞0.5，說明其分類不夠準(zhǔn)確（顯橙紅色），由此證明驗證集里的4類紅茶大部分可歸屬至正確的Class中，其準(zhǔn)確率高達(dá)95%，說明該模型具有較高的判別準(zhǔn)確率和判別穩(wěn)定性。

5）未知紅茶樣品的產(chǎn)地預(yù)測

委托專業(yè)人士購買具有代表性的紅茶樣品，且事先不透露其產(chǎn)地信息給操作人員，按其按照說明書步驟1-4進行操作，并預(yù)測其產(chǎn)地歸屬。實驗結(jié)果表明，未知樣本僅在Class 1內(nèi)的Y_predict = 1.004598（>0.5）,偏差為0.108222（<0.5）,因此判定其產(chǎn)地歸屬為廣東英德。經(jīng)購買人證實未知茶樣為英德紅茶，證明該預(yù)測準(zhǔn)確，再一次證明所建模型的準(zhǔn)確性高，具有廣闊的應(yīng)用前景。

綜上所述，采用手性定量分析技術(shù)，僅需獲得芳樟醇、芳樟醇氧化物（A、B、C、D）、4-萜品醇、α-松油醇、檸檬烯及α-紫羅蘭酮9種萜類化合物對映異構(gòu)體的含量數(shù)據(jù)，結(jié)合偏最小二乘法判別分析法即可建立不同產(chǎn)地紅茶的判別模型。本實施例中提到的模型參數(shù)及數(shù)據(jù)處理方法僅適用于以上所述的四個產(chǎn)地的紅茶樣品，若有更多的產(chǎn)地或不同的產(chǎn)地分類，建模思路與本發(fā)明基本一致，可參照本發(fā)明中的判別方法進行建模，所產(chǎn)生的功能未超出本發(fā)明的技術(shù)方案范圍時，均屬于本發(fā)明的保護范圍。