本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，90％以上為移行細(xì)胞癌，膀胱移行細(xì)胞癌(transitionalcellcarcinomaofbladder)多發(fā)生于50-70歲之間，其中80％以上為表淺腫瘤，有10％～20％發(fā)展為浸潤性膀胱癌。目前對膀胱癌診斷和術(shù)后復(fù)查的手段主要有膀胱鏡和尿細(xì)胞學(xué)檢查，膀胱鏡雖準(zhǔn)確，但其是一種侵入性檢查，操作復(fù)雜、費時費力、費用高額，且會增加患者的痛苦，使得很多患者對此方法有抵觸情緒，同時其還難以發(fā)現(xiàn)原位癌或扁平癌。尿細(xì)胞學(xué)檢查雖無創(chuàng)，且特異性較好，但敏感性低，對于分期較低、分化較好的腫瘤，其敏感性僅為30％或更低，而且受診斷醫(yī)師主觀因素的影響較大。因此，尋找一種簡便、無創(chuàng)且能早期診斷膀胱癌的檢測方法具有很大意義。核基質(zhì)蛋白22(NMP-22)是核基質(zhì)的重要組成部分，其與DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及RNA的合成、基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。NMP-22是核有絲分裂裝置蛋白(NuMA)的一個亞單位，NuMA和有絲分裂期間紡錘體的形成有關(guān)，其主要功能為協(xié)調(diào)核有絲分裂期間染色體正確均勻地分配到子代細(xì)胞。因此，NMP-22多分布于有絲分裂較活躍的組織，如上皮細(xì)胞，尤其是尿路上皮細(xì)胞?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞惡變(malignanttransformation)時，核內(nèi)遺傳物質(zhì)在分裂末期分配極度異常，NMP22的合成激增。膀胱癌患者尿液NMP-22含量升高是由于癌細(xì)胞增殖異?；钴S使細(xì)胞內(nèi)NMP-22含量增高，在細(xì)胞凋亡過程中釋放到尿液中所致。NMP-22在尿液中的含量在一定程度上反映了腫瘤細(xì)胞的增殖狀況。因此，尿液中NMP-22含量可作為篩選膀胱癌的一個腫瘤標(biāo)志物，對判斷疾病的進(jìn)展及治療效果評價有重要參考價值。專利文獻(xiàn)CN104330565A在2014年10月24日公開了一種利用抗核基質(zhì)蛋白22抗體快速檢測膀胱癌的免疫層析試紙及其制備方法，該免疫層析試紙包括樣品墊1、結(jié)合墊2、硝酸纖維素膜3、吸水紙4和底板5；硝酸纖維素膜3在所述底板5的中部，在所述硝酸纖維素膜3沿底板的一端依次為結(jié)合墊2、樣品墊1，在所述硝酸纖維素膜3沿底板的另一端為吸水紙4；硝酸纖維素膜3包含包被有抗核基質(zhì)蛋白22抗體的檢測區(qū)和包被有抗IgG抗體的質(zhì)控區(qū)；檢測區(qū)設(shè)有檢測線(T)，質(zhì)控區(qū)設(shè)有質(zhì)控線(C)；結(jié)合墊2上包被有膠體金標(biāo)記的抗核基質(zhì)蛋白22抗體或乳膠標(biāo)記的抗核基質(zhì)蛋白22抗體或膠體硒標(biāo)記的抗核基質(zhì)蛋白22抗體。該免疫層析試紙具有使用簡便、無創(chuàng)，可作為膀胱癌的臨床輔助診斷及病情的檢測的優(yōu)點，但是，該免疫層析試紙的檢測準(zhǔn)確度和重復(fù)性較低，不適合大規(guī)模推廣和應(yīng)用。專利文獻(xiàn)CN104267197A在2014年10月24日公開了一種核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測劑盒及其制備方法，所述核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測劑盒包括：1)NMP22校準(zhǔn)品；2)NMP22單克隆抗體預(yù)包被的固相載體；3)NMP22單克隆抗體的酶標(biāo)記物；4)與所述酶作用的發(fā)光底物液；5)濃縮洗液。該核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測劑盒是一種簡便、無創(chuàng)且能早期診斷膀胱癌的試劑盒。但是，該核基質(zhì)蛋白22化學(xué)發(fā)光免疫檢檢測劑盒的穩(wěn)定性較差，無法滿足臨床的要求。因此，研究和開發(fā)出一種靈敏性高、特異性好和穩(wěn)定性高的膀胱癌的檢測方法仍是當(dāng)前亟需解決的難題。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的膀胱癌檢測試劑盒的不足，本發(fā)明目的在于提供一種核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒，以解決上述問題。本發(fā)明提供了一種核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒，由核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體、辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體、吖啶酯、洗滌液和核基質(zhì)蛋白22校準(zhǔn)品組成。進(jìn)一步地，所述核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體的制備方法為：將核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體加入pH為4.2的檸檬酸鈉緩沖液中制成包被液，所述核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體的添加量是檸檬酸鈉緩沖液體積的0.8-1.2％，將所述包被液加入96孔微孔板中，每孔100μL，放置4℃條件下過夜，甩掉包被液，接著每孔加入300μL封閉液，室溫放置3-5h，甩掉封閉液，室溫除濕干燥24h，即得。進(jìn)一步地，所述封閉液由以下組分組成：檸檬酸鈉緩沖液30-50g/L、十四烷基三甲基氯化銨12-16g/L、綠原酸2-4g/L、葛根素0.6-1.2g/L、氯化鈉4-6g/L和Prclin3000.1-0.3g/L，余量為水。進(jìn)一步地，所述封閉液由以下組分組成：檸檬酸鈉緩沖液45g/L、十四烷基三甲基氯化銨14g/L、綠原酸3g/L、葛根素0.8g/L、氯化鈉5g/L和Prclin3000.2g/L，余量為水。進(jìn)一步地，所述辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體的制備方法為：取10mg辣根過氧化物酶加1ml水中溶解，混勻4-6min后加濃度為0.08mol/L的NaIO4水溶液1ml混合，然后置于冰箱內(nèi)20-30min后，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應(yīng)，反應(yīng)20-30min，接著加入21％NaCl溶液0.3ml，再加1.2ml無水乙醇沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用6ml80％的乙醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去乙醇，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸鈉緩沖液2ml溶解，然后加入2ml羊抗人IgG(內(nèi)含蛋白量20mg左右)，攪拌均勻，置冰箱內(nèi)過夜，次日取出加10mgNaBH4混勻，3h后加10mg飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物，離心，去上清，沉淀用50％飽和硫酸銨洗滌一次，離心，再去上清，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸鈉緩沖液3ml溶解，轉(zhuǎn)入透析袋中用生理鹽水透析除鹽(需換液5次)，如有沉淀需離心除去，上清呈淡棕色即為辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體。進(jìn)一步地，所述吖啶酯的濃度為1-2g/mL。進(jìn)一步地，所述洗滌液由以下組分組成：十四烷基三甲基氯化銨12-16g/L、小檗堿1-3g/L、脫氧膽酸鈉8-12g/L、氯化鈉3-6g/L、氯化鈣5-8g/L和Prclin3000.1-0.3g/L，余量為水。進(jìn)一步地，所述洗滌液由以下組分組成：十四烷基三甲基氯化銨14g/L、小檗堿2g/L、脫氧膽酸鈉10g/L、氯化鈉4g/L、氯化鈣6g/L和Prclin3000.2g/L，余量為水。進(jìn)一步地，所述核基質(zhì)蛋白22校準(zhǔn)品以牛血清蛋白為基質(zhì)，加入核基質(zhì)蛋白22抗原純品配制成。另外，本發(fā)明還提供了所述的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒在檢測核基質(zhì)蛋白22中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的吖啶酯的分子式為C30H26N2O9S，CAS號為194357-64-7；核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體購于上海喬羽生物科技有限公司；綠原酸的CAS號為327-97-9；葛根素的CAS號為3681-99-0；羊抗人IgG購于上海心語生物科技有限公司；血清蛋白的CAS號為9048-46-8；小檗堿的CAS號為2086-83-1。本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的檢測原理是：采用化學(xué)發(fā)光檢測核基質(zhì)蛋白22，采用辣根過氧化物酶對核基質(zhì)蛋白22抗體進(jìn)行標(biāo)記，然后將辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體加入待測的抗原中使之結(jié)合，結(jié)合有辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體的抗原與核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體上的核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體結(jié)合，接著用洗滌液洗板，將固定在固相載體上的包被抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物與未結(jié)合物分離，接著加入化學(xué)底物液進(jìn)行反應(yīng)，然后利用化學(xué)發(fā)光檢測進(jìn)行檢測，從而檢測出核基質(zhì)蛋白22的含量。本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒可以有效、穩(wěn)定地測定膀胱癌患者血液、尿液或唾液中核基質(zhì)蛋白22的含量，是一種較為理想的膀胱癌檢測試劑盒。本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒優(yōu)選的檢測樣品為膀胱癌患者的尿液。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的洗滌液可以有效的減少受檢血液、尿液或唾液中其他物質(zhì)的干擾，可以大大的提高核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的靈敏度和精確度。同時，本發(fā)明提供的封閉液可以有效的提高核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體的穩(wěn)定性，從而可以有效的提高核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的穩(wěn)定性，有利于膀胱癌患者的早期診斷和預(yù)后處理。進(jìn)一步地，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的靈敏度小于0.2ng/ml，可以有效的提高核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的準(zhǔn)確性和精確度。同時，本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒檢測的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)小于5％，說明本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒具有較高的精密度和重復(fù)性。進(jìn)一步地，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒具有較高的穩(wěn)定性，在常溫下放置12個月其靈敏度與剛制備的試劑盒基本一致。另外，本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒在4℃下保存36個月后，試劑盒的靈敏度及線性良好，與剛制備的試劑盒無明顯差別，說明本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒具有較高的穩(wěn)定性。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有以下優(yōu)勢：(1)本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒可以檢測手術(shù)治療后患者或復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移性腫瘤患者人體液的NMP-22的表達(dá)水平，對膀胱癌的臨床診斷具有重要意義；(2)本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒具有靈敏性高、特異性好和穩(wěn)定性高的優(yōu)點，有利于膀胱癌患者的早期診斷和預(yù)后處理。具體實施方式下面將進(jìn)一步的詳細(xì)說明本發(fā)明。需要指出的是，以下說明僅僅是對本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對這些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍以所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。下列實施例中未注明具體試驗條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，分子克隆試驗指南(SambrookJ,etal.2008.MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rdEd.)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例1、一種核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒所述核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的制備1、核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體的制備：將核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體加入pH為4.2的檸檬酸鈉緩沖液中制成包被液，所述核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體的添加量是檸檬酸鈉緩沖液體積的0.8％，將所述包被液加入96孔微孔板中，每孔100μL，放置4℃條件下過夜，甩掉包被液，接著每孔加入300μL封閉液，室溫放置3-5h，甩掉封閉液，室溫除濕干燥24h，即得；所述封閉液由以下成分組成：檸檬酸鈉緩沖液30g/L、十四烷基三甲基氯化銨12g/L、綠原酸2g/L、葛根素0.6-g/L、氯化鈉4g/L和Prclin3000.1g/L，余量為水。2、辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體的制備：取10mg辣根過氧化物酶加1ml水中溶解，混勻4min后加濃度為0.08mol/L的NaIO4水溶液1ml混合，然后置于冰箱內(nèi)20min，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應(yīng)，反應(yīng)20min，接著加入21％NaCl溶液0.3ml，再加1.2ml無水乙醇沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用6ml80％的乙醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去乙醇，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸鈉緩沖液2ml溶解，然后加入2ml羊抗人IgG(內(nèi)含蛋白量20mg左右)，攪拌均勻，置冰箱內(nèi)過夜，次日取出加10mgNaBH4混勻，3h后加10mg飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物，離心，去上清，沉淀用50％飽和硫酸銨洗滌一次，離心，再去上清，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸鈉緩沖液3ml溶解，轉(zhuǎn)入透析袋中用生理鹽水透析除鹽，需換液5次，如有沉淀需離心除去，上清呈淡棕色即為辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體。3、洗滌液的配置：所述洗滌液由以下成分組成：十四烷基三甲基氯化銨12g/L、小檗堿1g/L、脫氧膽酸鈉8g/L、氯化鈉3g/L、氯化鈣5g/L和Prclin3000.1g/L，余量為水。將上述配方中的十四烷基三甲基氯化銨、小檗堿、脫氧膽酸鈉、氯化鈉、氯化鈣和Prclin300加入水中攪拌均勻，即得。4、核基質(zhì)蛋白22校準(zhǔn)品的配置：以牛血清蛋白為基質(zhì)，加入核基質(zhì)蛋白22抗原純品配制成，制備的最終濃度為：0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。5、將核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體、辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體、吖啶酯、洗滌液和核基質(zhì)蛋白22校準(zhǔn)品分別組裝，即得，所述吖啶酯的濃度為1g/mL。實施例2、一種核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒所述核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的制備1、核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體的制備：將核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體加入pH為4.2的檸檬酸鈉緩沖液中制成包被液，所述核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體的添加量是檸檬酸鈉緩沖液體積的1.0％，將所述包被液加入96孔微孔板中，每孔100μL，放置4℃條件下過夜，甩掉包被液，接著每孔加入300μL封閉液，室溫放置3-5h，甩掉封閉液，室溫除濕干燥24h，即得；所述封閉液由以下組分組成：檸檬酸鈉緩沖液45g/L、十四烷基三甲基氯化銨14g/L、綠原酸3g/L、葛根素0.8g/L、氯化鈉5g/L和Prclin3000.2g/L，余量為水。2、辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體的制備：取10mg辣根過氧化物酶加1ml水中溶解，混勻5min后加濃度為0.08mol/L的NaIO4水溶液1ml混合，然后置于冰箱內(nèi)25min，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應(yīng)，反應(yīng)25min，接著加入21％NaCl溶液0.3ml，再加1.2ml無水乙醇沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用6ml80％的乙醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去乙醇，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸鈉緩沖液2ml溶解，然后加入2ml羊抗人IgG(內(nèi)含蛋白量20mg左右)，攪拌均勻，置冰箱內(nèi)過夜，次日取出加10mgNaBH4混勻，3h后加10mg飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物，離心，去上清，沉淀用50％飽和硫酸銨洗滌一次，離心，再去上清，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸鈉緩沖液3ml溶解，轉(zhuǎn)入透析袋中用生理鹽水透析除鹽，需換液5次，如有沉淀需離心除去，上清呈淡棕色即為辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體。3、洗滌液的配置：所述洗滌液由以下成分組成：十四烷基三甲基氯化銨14g/L、小檗堿2g/L、脫氧膽酸鈉10g/L、氯化鈉4g/L、氯化鈣6g/L和Prclin3000.2g/L，余量為水。將上述配方中的十四烷基三甲基氯化銨、小檗堿、脫氧膽酸鈉、氯化鈉、氯化鈣和Prclin300加入水中攪拌均勻，即得。4、核基質(zhì)蛋白22校準(zhǔn)品的配置：以牛血清蛋白為基質(zhì)，加入核基質(zhì)蛋白22抗原純品配制成，制備的最終濃度為：0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。5、將核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體、辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體、吖啶酯、洗滌液和核基質(zhì)蛋白22校準(zhǔn)品分別組裝，即得，所述吖啶酯的濃度為2g/mL。實施例3、一種核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒所述核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的制備1、核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體的制備：將核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體加入pH為4.2的檸檬酸鈉緩沖液中制成包被液，所述核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體的添加量是檸檬酸鈉緩沖液體積的1.2％，將所述包被液加入96孔微孔板中，每孔100μL，放置4℃條件下過夜，甩掉包被液，接著每孔加入300μL封閉液，室溫放置3-5h，甩掉封閉液，室溫除濕干燥24h，即得；所述封閉液由以下組分組成：檸檬酸鈉緩沖液50g/L、十四烷基三甲基氯化銨16g/L、綠原酸4g/L、葛根素1.2g/L、氯化鈉6g/L和Prclin3000.3g/L，余量為水。2、辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體的制備：取10mg辣根過氧化物酶加1ml水中溶解，混勻6min后加濃度為0.08mol/L的NaIO4水溶液1ml混合，然后置于冰箱內(nèi)30min，加0.4mol/L乙二醇溶液0.5ml終止氧化反應(yīng)，反應(yīng)30min，接著加入21％NaCl溶液0.3ml，再加1.2ml無水乙醇沉淀醛化酶，離心去上清，沉淀酶再用6ml80％的乙醇溶液浸泡洗滌一次后，離心傾去乙醇，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸鈉緩沖液2ml溶解，然后加入2ml羊抗人IgG(內(nèi)含蛋白量20mg左右)，攪拌均勻，置冰箱內(nèi)過夜，次日取出加10mgNaBH4混勻，3h后加10mg飽和硫酸銨沉淀酶結(jié)合物，離心，去上清，沉淀用50％飽和硫酸銨洗滌一次，離心，再去上清，沉淀用pH9.6的0.05mol/L碳酸鈉緩沖液3ml溶解，轉(zhuǎn)入透析袋中用生理鹽水透析除鹽，需換液5次，如有沉淀需離心除去，上清呈淡棕色即為辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體。3、洗滌液的配置：所述洗滌液由以下成分組成：十四烷基三甲基氯化銨16g/L、小檗堿3g/L、脫氧膽酸鈉12g/L、氯化鈉6g/L、氯化鈣8g/L和Prclin3000.3g/L，余量為水。將上述配方中的十四烷基三甲基氯化銨、小檗堿、脫氧膽酸鈉、氯化鈉、氯化鈣和Prclin300加入水中攪拌均勻，即得。4、核基質(zhì)蛋白22校準(zhǔn)品的配置：以牛血清蛋白為基質(zhì)，加入核基質(zhì)蛋白22抗原純品配制成，制備的最終濃度為：0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL。5、將核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體、辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體、吖啶酯、洗滌液和核基質(zhì)蛋白22校準(zhǔn)品分別組裝，即得，所述吖啶酯的濃度為1g/mL。對比例1、一種核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒所述核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒制備方法的不同在于，所述封閉液由以下組分組成：檸檬酸鈉緩沖液45g/L、牛血清蛋白14g/L、綠原酸3g/L、葛根素0.8g/L、氯化鈉5g/L和Prclin3000.2g/L，余量為水。其余步驟與實施例2類似。對比例2、一種核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒所述核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒制備方法的不同在于，所述封閉液由以下組分組成：檸檬酸鈉緩沖液45g/L、十四烷基三甲基氯化銨14g/L、綠原酸3.8g/L、氯化鈉5g/L和Prclin3000.2g/L，余量為水。其余步驟與實施例2類似。對比例3、一種核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒所述核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒制備方法的不同在于，所述洗滌液有以下成分組成：吐溫2014g/L、小檗堿2g/L、脫氧膽酸鈉10g/L、氯化鈉4g/L、氯化鈣6g/L和Prclin3000.2g/L，余量為水。其余步驟與實施例2類似。對比例4、一種核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒所述核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒制備方法的不同在于，所述洗滌液有以下成分組成：十四烷基三甲基氯化銨14g/L、脫氧膽酸鈉12g/L、氯化鈉4g/L、氯化鈣6g/L和Prclin3000.2g/L，余量為水。其余步驟與實施例2類似。試驗例一、核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的操作試驗1、將核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒取出，平衡所有檢測試劑和樣本至室溫(18-25℃)；2、取需用量的核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體；3、在所述核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體上每孔依次加入25μL校準(zhǔn)品/待測樣品；4、接著在加有校準(zhǔn)品/待測樣品的核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體上依次加入辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體，每孔100μL，于微量振蕩器上振蕩30s使其混合均勻，在37℃溫育60min；所述辣根過氧化物酶標(biāo)記核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體使用前用酶標(biāo)抗體稀釋液以1∶4000工作濃度稀釋，所述酶標(biāo)抗體稀釋液由磷酸二氫鈉0.3g/L、磷酸氫二鈉30.3g/L、氯化鈉10g/L和水解明膠12g/L、余量為水組成。5、用洗滌液洗核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體5次，將固定在核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體上的包被抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物與未結(jié)合物分離；7、接著在經(jīng)洗滌液洗板后的核基質(zhì)蛋白22單克隆抗體包被的固相載體加入化學(xué)發(fā)光底物液，所述化學(xué)發(fā)光底物液為濃度為1g/mL的吖啶酯溶液，每孔100μL，室溫避光反應(yīng)5min，在5～15min內(nèi)利用化學(xué)發(fā)光檢測儀進(jìn)行檢測；8、使用Log(x)-Log(y)的雙對數(shù)數(shù)據(jù)擬合方式，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，計算測定結(jié)果，即得。試驗例二、核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的靈敏度試驗1、試驗材料：實施例1、實施例2和實施例3制備的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒，人核基質(zhì)蛋白-22ELISA檢測試劑盒(市售試劑盒)，由上海喬羽生物科技有限公司提供。2、試驗方法：采用化學(xué)發(fā)光檢測儀測定實施例1、實施例2和實施例3制備的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的靈敏度，按照人核基質(zhì)蛋白-22ELISA檢測試劑盒的說明書測定人核基質(zhì)蛋白-22ELISA檢測試劑盒的靈敏度。3、試驗結(jié)果試驗結(jié)果如表1所示。表1核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的靈敏度試驗數(shù)據(jù)實施例1實施例2實施例3市售試劑盒檢測范圍0-100ng/ml0-100ng/ml0-100ng/ml0-80ng/ml靈敏度0.2ng/ml0.1ng/ml0.2ng/ml1.2ng/ml由表1可知，本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的靈敏度小于0.2ng/ml，可以有效的提高核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的準(zhǔn)確性和精確度。試驗例二、核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的精密度試驗1、試驗材料：實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒；收集人核基質(zhì)蛋白22臨床檢測高值的人尿液樣本，所述尿液可以是任何市售尿液樣本、或收集自臨床機構(gòu)。2、試驗方法：將人NMP-22臨床檢測高值的人尿液樣品用蒸餾水稀釋濃度為50ng/ml和2.0ng/ml，高濃度值質(zhì)控品濃度為：50ng/ml，低濃度值質(zhì)控品為2.0ng/ml。2.1、批內(nèi)精密度檢測：將高、低濃度值質(zhì)控品分別分裝成10份，采用實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備得到的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒連續(xù)檢測高、低濃度值質(zhì)控品10次，計算批內(nèi)變異系數(shù)。2.2、批間精密度檢測：將高、低濃度值質(zhì)控品分別分裝成10份，放于-20℃冰箱保存，采用實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備得到的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒每天檢測高、低濃度值質(zhì)控品1次，連續(xù)檢測10天，計算批間變異系數(shù)。3、試驗結(jié)果試驗結(jié)果如表2和表3所示。表2核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的批內(nèi)變異系數(shù)(CV％)(n＝10)表3核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的批間變異系數(shù)(CV％)(n＝10)由表2和表3可知，本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒檢測的批內(nèi)和批間的變異系數(shù)小于5％，說明本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒具有較高的精密度和重復(fù)性。試驗例三、核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的穩(wěn)定性試驗1、試驗材料：實施例2、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒。2、試驗方法：2.1、將實施例2、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒在20℃分別放置6個月和12個月后，按照試驗例一中的方法進(jìn)行靈敏度測定；2.2、根據(jù)濃度為：0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，對數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計算R2值。3、試驗結(jié)果：試驗結(jié)果如表4所示。表4核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒的穩(wěn)定性試驗由表4可知，本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒具有較高的穩(wěn)定，在常溫下放置12個月其靈敏度與剛制備的試劑盒基本一致。另外，本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒在4℃下保存36個月后，試劑盒靈敏度及線性良好，與剛制備的試劑盒無明顯差別，說明本發(fā)明提供的核基質(zhì)蛋白22的快速檢測試劑盒具有較高的穩(wěn)定性。本
發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實施方案，其中一個或更多個技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個或多個技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。當(dāng)前第1頁1 2 3