本發(fā)明描述了一種檢測牛血清淀粉樣蛋白A的酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒及其制備方法和用途，用于檢測牛奶中血清淀粉樣蛋白A的濃度，并以此診斷牛隱性乳房炎。屬分析測試領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

乳房炎(Mastitis)是奶牛最常見、最多發(fā)、導致經(jīng)濟損失最嚴重的疾病之一，并危害著人類健康，這是因為乳房炎奶牛的乳汁中往往含有大量病原微生物、毒素或治療后殘留的抗生素，食用后可引起發(fā)熱、嘔吐、腹瀉及過敏等不良反應(yīng)。隨著我國奶牛業(yè)和乳品工業(yè)的發(fā)展及人類對公共衛(wèi)生的重視，奶牛乳房炎的危害已引起人們的廣泛關(guān)注和高度重視。

乳房炎不僅使奶牛產(chǎn)奶量顯著下降而造成嚴重經(jīng)濟損失，還可導致乳汁成分發(fā)生改變，使牛奶的營養(yǎng)價值和食用價值顯著下降。

奶牛乳房炎分為臨床型乳房炎和隱性乳房炎。臨床型乳房炎會導致牛奶分泌大幅度下降，嚴重時奶牛甚至完全不能泌乳。隱性乳房炎發(fā)病率高，作用時間更長，而且長期潛伏在牛群中不易診斷。奶牛日產(chǎn)奶量與隱性乳房炎發(fā)病程度呈顯著負相關(guān)，因此隱性乳房炎實際上比病例數(shù)較少的臨床型乳房炎造成的經(jīng)濟損失更大。

美國國家乳房炎委員會(National Mastitis Council,NMC)1996 年的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示每年全世界約三分之一的奶牛感染乳房炎，其直接經(jīng)濟損失達 20 億美元，而僅加拿大一個國家，奶牛乳房炎造成的直接經(jīng)濟損失就達到了 7 億英鎊。同時，乳房炎被列為淘汰奶牛的主要原因，美國淘汰奶牛的 26.5%是因為患乳房炎，在芬蘭、挪威、瑞典因奶牛乳3房健康問題分別淘汰了奶牛的 35%、19%和 22%。我國目前奶牛存欄數(shù)為 600 萬～700萬頭，主要集中在黑龍江、內(nèi)蒙古及河北等地區(qū)，調(diào)查表明，奶牛乳房炎在我國的發(fā)病率達 70%～80%，每年造成的直接經(jīng)濟損失約為 30 億元人民幣。

目前檢測奶牛隱性乳房炎主要是依靠檢測牛奶中的體細胞數(shù)來進行，即牛奶SCC。牛奶體細胞數(shù)是目前衡量奶牛乳房炎的常用標準。其原理是當奶牛的泌乳系統(tǒng)受到各種細菌的侵襲而發(fā)生感染和損傷時，由于機體的免疫機制，血液中承擔排除感染和修復任務(wù)的白細胞就會穿越毛細血管壁和乳腺泡壁層，進入腺泡腔而進入乳汁中，引起乳汁中體細胞總數(shù)的升高。因此，可通過乳汁 SCC 的變化來判斷是否是隱性乳房炎。

但是牛奶體細胞數(shù)的變化受到很多因素的影響，如年齡、泌乳期、晝夜、擠奶過程、病原菌感染等。導致目前的體細胞檢測不能完全診斷奶牛乳房炎。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，感染、創(chuàng)傷、炎癥等應(yīng)激原作用于動物機體，造成機體穩(wěn)態(tài)失衡，會引起一系列反應(yīng)，如發(fā)熱、負氮平衡、白細胞增多、促腎上腺皮質(zhì)激素和糖皮質(zhì)激素分泌增多、補體系統(tǒng)和凝集系統(tǒng)激活、血清微量元素濃度改變及一些血漿蛋白濃度的改變等。在應(yīng)激刺激下所產(chǎn)生變化的蛋白即為急性期蛋白(Acute Phase Protein,APP)，又叫急性期反應(yīng)物或應(yīng)激敏感蛋白質(zhì)。

在奶牛發(fā)生隱性乳房炎時，急性期蛋白APP濃度會發(fā)生急劇變化。因此急性期蛋白APP作為奶牛乳房炎的生物標記物，成為繼乳汁體細胞數(shù)之后，另一種奶牛乳房炎的診斷標準。

奶牛發(fā)生乳房炎后，在各種致炎因子作用下，肝臟迅速合成 APP，其濃度在血清和乳汁中都會上升，其中最顯著的是血清淀粉樣蛋白A（SAA）。通過分析牛奶中血清淀粉樣蛋白A含量直接反應(yīng)奶牛乳房的炎癥狀態(tài)。

血清淀粉樣蛋白A（SAA）是一種小型的疏水蛋白，分子量約為 9～14kDa。人類 SAA 有 4 種亞型，在急性炎癥或組織損傷的刺激下，血清 SAA1和 SAA2濃度可在 5～6h 內(nèi)迅速升高約 1000 倍，而 SAA4幾乎沒有變化，因此，把 SAA1和 SAA2合稱為 SAA 或急性期 SAA(A-SAA)，而把 SAA4稱為組成性 SAA(C-SAA)。SAA 是淀粉狀蛋白的前體，所以 SAA 和淀粉樣變性病的發(fā)病機理有關(guān)。奶牛發(fā)生急性炎癥時 SAA 升高幅度比發(fā)生慢性炎癥時大；奶牛試驗性曼氏溶血性不動桿菌、呼吸道合胞病毒病和乳房炎，都可以引起 SAA 濃度的升高。

市場上目前有銷售的國外檢測牛血清淀粉樣蛋白A的試劑盒。主要目的是篩查自身免疫性疾病。因為血清淀粉樣蛋白A是一種驗證相關(guān)的急性期蛋白APP，在很多疾病的過程中都有表達。血清淀粉樣蛋白A是一個蛋白家族，人的SAA有4種亞型，而牛的SAA常見有5-8種亞型。主要在血清中表達。SAA在很多疾病過程中都有提高。市場上的SAA檢測試劑盒，采用8種SAA混合抗原抗體，主要是用于檢測血清中的SAA含量，為自身免疫疾病提供參考。

在牛的SAA家族中，只有幾種是與奶牛隱性乳房炎相關(guān)的。其中只要1種是牛的乳腺表達，而不是在血清中表達的。在我們的前期研究中，篩選出了在牛乳腺表達的SAA蛋白，叫乳腺血清淀粉樣蛋白A（M-SAA或者MAA）。S-MAA在奶牛乳房炎的時候，含量會急劇升高。

Gabriele Gerardi [Proprietors of Journal of Dairy Research 2009，411]等詳細研究了M-SAA與奶牛隱性乳房炎的關(guān)系，并且牛奶中SAA的濃度變化來診斷奶牛的隱性乳房炎。S. Jacobsen等[Veterinary Immunology and Immunopathology 104 (2005) 21–31]等研究了M-SAA蛋白的生物學特征，并且以M-SAA濃度變化作為診斷奶牛隱性乳房炎的指標。近年來越來越多的研究表明，急性期蛋白APP是診斷奶牛隱性乳房炎的有效指標，其中奶牛血清淀粉樣蛋白A（SAA）是最有效的參考指標。

目前對于牛奶中血清淀粉樣蛋白A（SAA）的檢測還沒有有效的方法。本發(fā)明描述了一種酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，用于測定牛奶中血清淀粉樣蛋白A的濃度，進而為奶牛隱性乳房炎診斷提供依據(jù)。

在本發(fā)明中，我們根據(jù)牛乳腺血清淀粉樣蛋白A的特異性基因序列，克隆并表達了重組的牛乳腺血清淀粉樣蛋白A（M-SAA）；并制備了牛乳腺血清淀粉樣蛋白A的單克隆抗體；以此為基礎(chǔ)，研制了牛血清淀粉樣蛋白A酶聯(lián)免疫吸附試劑盒。用于診斷奶牛的隱形乳房炎。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒及其制備方法，用于測定牛奶中牛血清淀粉樣蛋白A的濃度，進而為奶牛隱性乳房炎診斷提供依據(jù)

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒，該試劑盒包括：

1)用牛血清淀粉樣蛋白A（SAA）抗體包被的酶標板

2)牛血清淀粉樣蛋白A(SAA)標準品

3)標準品稀釋液

4)牛血清淀粉樣蛋白A(SAA)抗體

5)酶標記的羊抗鼠IgG抗體

6)洗滌液

7)底物

8)顯色劑

9)終止液。

該試劑盒通過下述方法獲得

1.牛血清淀粉樣蛋白A基因（SAA GeneBank ID NM_00181016.3）通過PCR擴增后，克隆到表達載體PET28中，將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21后，通過IPTG誘導表達，得到重組的牛血清淀粉樣蛋白A

2.將重組的牛血清淀粉樣蛋白A(SAA)純化，免疫小鼠，通過細胞融合和篩選后，制備得到SAA的單克隆抗體

3.利用純化的牛血清淀粉樣蛋白A單克隆抗體和重組牛血清淀粉樣蛋白A抗原通過下述方法制備酶聯(lián)免疫試劑盒

1)包被有牛血清淀粉樣蛋白A抗體的酶標板制備

w 包被

將牛血清淀粉樣蛋白A抗體用PH6-8的0.01-0.05M PBS緩沖液稀釋，終濃度為1-50ug/ml，按照每孔100-300ul的量加入到酶標板的微孔中。在37℃孵育1-4小時或者4℃孵育過夜；

w 洗滌

用0.01-0.05M的PBS緩沖液，加入0.1%的Tween20洗滌酶標板3-5次；

w 封閉

在上述酶標板中每孔加入300ul封閉液（10%小牛血清或者3%脫脂奶粉）室溫封閉1-3小時；

w 洗滌

用0.01-0.05M，PH6-8的PBS緩沖液加入0.1%Tween20緩沖液洗滌酶標板3-5次；

w 干燥

在20-37℃干燥5-10小時，使酶標板干燥；

干燥后就得到包被有牛血清淀粉樣蛋白A抗體的酶標板

2)標準品稀釋液配制

配制0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS，調(diào)節(jié)PH至PH7.4

3)牛血清淀粉樣蛋白A標準品配制

將重組表達純化的牛血清淀粉樣蛋白A用0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4溶解，配制終濃度為10ug/ml的牛血清淀粉樣蛋白A標準品

4)牛血清淀粉樣蛋白A抗體配制

牛血清淀粉樣蛋白A單克隆抗體用0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4溶解，配制終濃度為10ng/ml的牛血清淀粉樣蛋白A標準品

5)酶標記的羊抗鼠IgG抗體配制

將HRP標記的羊抗鼠IgG用0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4做1:10000稀釋

6)洗滌液配制

在0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4中加入0.1%的Tween20

7)底物液配制

過氧化氫脲用0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4溶解，終濃度為1mg/ml

8)顯色液配制

四氨基聯(lián)苯胺TMB用0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4溶解，終濃度為0.1mg/ml

使用前底物液和顯色液1:1混合，配制顯色底物

9)終止液配制

2mol/L H2SO4。

該試劑盒使用方法如下:

1.牛血清淀粉樣蛋白A標準品配制

w取6支離心管，編號A、B、C、D、E和F；

w管F中取900μL標準品稀釋液，加入100μL 試劑盒中的牛血清淀粉樣蛋白A標準品（10ug/mL）混勻，配制1ug/ml標準品；

w管E中取500μL標準品稀釋液，加入500μL標準品F，混勻，作1:2稀釋，配制成標準品E；

w管D中取500μL標準品稀釋液，加入500μL標準品E，混勻，作1:2稀釋，配制成標準品D；

w管C中取500μL標準品稀釋液，加入500μL標準品D，混勻，作1:2稀釋，配制成標準品C；

w管B中取500μL標準品稀釋液，加入500μL標準品C，混勻，作1:2稀釋，配制成標準品B；

w管A中取500μL標準品稀釋液，加入500μL標準品B，混勻，作1:2稀釋，配制成標準品A；

w以標準品稀釋液作為標準品0，即空白標準品。共配制成6個濃度標準品系列

2.從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的牛血清淀粉樣蛋白A抗體包被的酶標板板條，裝至微孔板架上。標準品0、A、B、C、D、E和F各2孔，其余各孔為待測樣品，輕輕振蕩微孔板，使內(nèi)容物充分混勻

3.用封板膜將微孔板密封，置37℃溫育60分鐘

4.棄去微孔板反應(yīng)孔內(nèi)液體，每孔加入350μL工作濃度洗滌液，然后將洗滌液棄去。重復洗板共5次，最后拍干

5.每孔加 牛血清淀粉樣蛋白A抗體100μL，用封板膜將微孔板密封，置37℃溫育30分鐘

6.棄去微孔板反應(yīng)孔內(nèi)液體，每孔加入350μL工作濃度洗滌液，然后將洗滌液棄去。重復洗板共5次，最后拍干

7.每孔加入酶標記的羊抗鼠IgG抗體100ul，置37℃溫育30分鐘

8.棄去微孔板反應(yīng)孔內(nèi)液體，每孔加入350μL工作濃度洗滌液，然后將洗滌液棄去。重復洗板共5次，最后拍干

9.每孔加底物緩沖液和顯色劑各50μL，用封板膜將微孔板密封，置室溫（18~30℃）避光溫育30分鐘

10.每孔加終止液50μL，輕輕振蕩微孔板，使內(nèi)容物充分混勻

11.終止反應(yīng)后1小時內(nèi)，用酶標儀在450nm波長處，測定各孔吸光度值，參考波長選擇620-700nm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1.本發(fā)明提供了一種牛血清淀粉樣蛋白A的酶聯(lián)免疫吸附分析檢測方法，能夠快速，定量的測定牛奶中的血清淀粉樣蛋白A的濃度

2.本發(fā)明利用了抗原抗體特異性結(jié)合的原理，檢測特異性好，不受牛奶中基質(zhì)的影響

3.利用牛血清淀粉樣蛋白A含量變化檢測奶牛隱性乳房炎，不受奶牛胎次、年齡、泌乳周期、擠奶過程等影響，結(jié)果相對穩(wěn)定。

附圖

M：蛋白質(zhì)分子量標記

1：牛血清淀粉樣蛋白A重組表達菌液

2：小鼠腹水

3：牛血清淀粉樣蛋白A單克隆抗體

圖1：重組牛血清淀粉樣蛋白A表達圖譜

圖2：牛血清淀粉樣蛋白A單克隆抗體純化圖譜

圖3：牛血清淀粉樣蛋白A酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒標準曲線圖。

具體實施方式

實施例1：重組牛血清淀粉樣蛋白A的重組表達和純化

1.牛血清淀粉樣蛋白A(HP)基因克隆

利用軟件對牛血清淀粉樣蛋白A(SAA)基因進行序列分析（GeneBank ID NM_001040470.2），設(shè)計PCR擴增引物，擴增出SAA基因，并在兩端加入酶切位點NdeI和BamHI.

2.HP基因克隆至表達載體

將擴增的SAA基因雙酶切后，插入表達載體pET28a中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a/SAA。酶切和序列測定鑒定重組質(zhì)粒

3.HP基因誘導表達

將重組質(zhì)粒pET28a/HP轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），篩選陽性克隆。挑取陽性單克隆接種LB kan+培養(yǎng)基，37℃ 200rpm培養(yǎng)過夜。 第二天 按照1%的接種量接種到ZYM-5052培養(yǎng)基中進行自誘導表達。取誘導后的菌液與不含重組質(zhì)粒的菌液做對比，檢測表達情況

ZYM-5052培養(yǎng)基含有 1% N-Z-amine AS, 0.5% 酵母提取物,25 mM Na2HPO4, 25mMKH2po4, 50mM NH4Cl, 5mM NaSO4, 2mM MgSO4, 0.2×微量元素，0.05%葡萄糖，0.5%甘油以及0.2% α-乳糖

4.重組SAA蛋白的純化

重組表達的SAA蛋白采用Ni-瓊脂糖凝膠親和層析純化，用20mM PBS上樣，采用含有20mM和50mM咪唑的PBS洗脫結(jié)合的SAA蛋白

重組表達的SAA蛋白電泳圖譜見圖1。

實施例2：重組牛血清淀粉樣蛋白A單克隆抗體的制備的制備

1.牛血清淀粉樣蛋白A雜交瘤細胞株建立：

用純化的重組HP蛋白免疫BALB/C小鼠，首次免疫用弗氏完全佐劑頸背部和腋下皮下多點注射，加強免疫用弗氏不完全佐劑頸背部皮下、腋下及足墊注射。每隔兩周采血檢測抗體滴度。8周后取小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0做細胞融合。用重組的HP和滅活的LM進行間接ELISA篩選。選擇強陽性細胞繼續(xù)培養(yǎng)，并采用有限稀釋法獲得能分泌抗體的單克隆。篩選得到的單克隆細胞擴增后液氮凍存保種

2.SAA腹水制備和單克隆抗體純化

雜交瘤細胞腹腔注射經(jīng)液體石蠟處理過的BALB/C小鼠，每只約2×10⁶個細胞，2周后收集腹水。腹水5000rpm離心10min去除細胞碎片及脂類。上清過Protein G Hitrap親和柱。收集的抗體用BCA法檢測蛋白濃度，用SDS-PAGE電泳檢測抗體純度

電泳結(jié)果顯示，牛血清淀粉樣蛋白AHP單克隆抗體純度超過95%

牛血清淀粉樣蛋白A單克隆抗體電泳圖譜見圖2。

實施例3：牛血清淀粉樣蛋白A酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的制備

1.包被有牛血清淀粉樣蛋白A抗體的酶標板制備

w 包被

將牛血清淀粉樣蛋白A抗體用PH6-8的0.01-0.05M PBS緩沖液稀釋，終濃度為1-50ug/ml，按照每孔100-300ul的量加入到酶標板的微孔中。在37℃孵育1-4小時或者4℃孵育過夜

w 洗滌

用0.01-0.05M的PBS緩沖液，加入0.1%的Tween20洗滌酶標板3-5次

w 封閉

在上述酶標板中每孔加入300ul封閉液（10%小牛血清或者3%脫脂奶粉）室溫封閉1-3小時

w 洗滌

用0.01-0.05M，PH6-8的PBS緩沖液加入0.1%Tween20緩沖液洗滌酶標板3-5次

w 干燥

在20-37℃干燥5-10小時，使酶標板干燥

干燥后就得到包被有牛血清淀粉樣蛋白A抗體的酶標板

2.標準品稀釋液配制

配制0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS，調(diào)節(jié)PH至PH7.4

3.牛血清淀粉樣蛋白A標準品配制

將重組表達純化的牛血清淀粉樣蛋白A用0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4溶解，配制終濃度為10ug/ml的牛血清淀粉樣蛋白A標準品

4.牛血清淀粉樣蛋白A抗體配制

牛血清淀粉樣蛋白A單克隆抗體用0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4溶解，配制終濃度為10ng/ml的牛血清淀粉樣蛋白A標準品

5.酶標記的羊抗鼠IgG抗體配制

將HRP標記的羊抗鼠IgG用0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4做1:10000稀釋

6.洗滌液配制

在0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4中加入0.1%的Tween20

7.底物液配制

過氧化氫脲用0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4溶解，終濃度為1mg/ml

8.顯色液配制

四氨基聯(lián)苯胺TMB用0.01mol/L的磷酸緩沖液PBS PH7.4溶解，終濃度為0.1mg/ml

使用前底物液和顯色液1:1混合，配制顯色底物

9.終止液配制

2mol/L H2SO4。

實施例四：利用牛血清淀粉樣蛋白A酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒檢測牛奶中的牛血清淀粉樣蛋白A含量

1.牛奶樣本處理

取原奶10ml，3000×g 離心20min。去除上層的乳脂。下層牛奶待檢

2.牛血清淀粉樣蛋白A標準品配制

w 取7支離心管，編號A、B、C、D、E、F和0；

w 管F中取900μL標準品稀釋液，加入100μL 試劑盒中的牛血清淀粉樣蛋白A標準品（10ug/mL）混勻，配制1ug/ml標準品；

w 管E中取500μL標準品稀釋液，加入500μL標準品F，混勻，作1:2稀釋，配制成標準品E；

w 管D中取500μL標準品稀釋液，加入500μL標準品E，混勻，作1:2稀釋，配制成標準品D；

w 管C中取500μL標準品稀釋液，加入500μL標準品D，混勻，作1:2稀釋，配制成標準品C；

w 管B中取500μL標準品稀釋液，加入500μL標準品C，混勻，作1:2稀釋，配制成標準品B；

w 管A中取500μL標準品稀釋液，加入500μL標準品B，混勻，作1:2稀釋，配制成標準品A；

w 以標準品稀釋液作為標準品0，即空白標準品。共配制成6個濃度標準品系列

3.從鋁箔袋中取出所需數(shù)量的牛血清淀粉樣蛋白AHP抗體包被的酶標板板條，裝至微孔板架上。標準品0、A、B、C、D、E和F各2孔，其余各孔為待測樣品，將上述處理后的牛奶樣本加入待檢孔。標準品與待檢奶樣均加入100ul，輕輕振蕩微孔板，使內(nèi)容物充分混勻

4.用封板膜將微孔板密封，置37℃溫育60分鐘

5.棄去微孔板反應(yīng)孔內(nèi)液體，每孔加入350μL工作濃度洗滌液，然后將洗滌液棄去。重復洗板共5次，最后拍干

6.每孔加 牛血清淀粉樣蛋白A抗體100μL，用封板膜將微孔板密封，置37℃溫育30分鐘

7.棄去微孔板反應(yīng)孔內(nèi)液體，每孔加入350μL工作濃度洗滌液，然后將洗滌液棄去。重復洗板共5次，最后拍干

8.每孔加入酶標記的羊抗鼠IgG抗體100ul，置37℃溫育30分鐘

9.棄去微孔板反應(yīng)孔內(nèi)液體，每孔加入350μL工作濃度洗滌液，然后將洗滌液棄去。重復洗板共5次，最后拍干

10.每孔加底物緩沖液和顯色劑各50μL，用封板膜將微孔板密封，置室溫（18~30℃）避光溫育30分鐘

11.每孔加終止液50μL，輕輕振蕩微孔板，使內(nèi)容物充分混勻

12.終止反應(yīng)后1小時內(nèi)，用酶標儀在450nm波長處，測定各孔吸光度值，參考波長選擇620-700nm

檢測結(jié)果顯示，兩個牛奶樣本中牛血清淀粉樣蛋白AHP的含量分別為A：1200ng/ml和B：300ng/ml

試劑盒檢測的標準曲線見圖3。

牛血清淀粉樣蛋白A基因序列，GeneBank ID NM181603.1

1 caccaggagc ctcagcagga gggcacggcc acaggatgaa cctttccacg ggcatcattt

61 tctgcttcct gatcctgggc gtcagcagcc agagatgggg gacattcctc aaggaagctg

121 gtcaaggggc taaagacatg tggagagctt accaagacat gaaagaagcc aactacaggg

181 gtgcagacaa atacttccac gcccgtggaa actatgacgc tgcccgaagg ggacctgggg

241 gtgcctgggc tgctaaagtg atcagtaacg ccagagagac tattcaggga atcacagacc

301 ctctgtttaa gggtatgacc agggaccagg tacgggagga ttcgaaggcc gaccagtttg

361 ccaacgaatg gggccggagc ggcaaagacc ccaaccactt cagacctgct ggcctgcctg

421 acaagtactg agctgcctct ctctctgctc aggagatggg ctgtgagtcc ctaagggcag

481 agacactgac ctagagagtt ctctgtcctc agaaggcagc agatctaata aatgctcaag

541 agatgg

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