本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的試劑盒，屬于檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

正常機(jī)體受到外界病原微生物等的刺激后，通過一系列固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)抵抗感染、行使免疫防御功能。其中，固有免疫是機(jī)體先天獲得的第一道防線，出現(xiàn)早且反應(yīng)迅速，在機(jī)體清除病原體的過程中發(fā)揮重要作用。中性粒細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分。中性粒細(xì)胞在吞噬病原體過程中產(chǎn)生超氧陰離子和其他反應(yīng)性氧復(fù)合物，即“呼吸爆發(fā)”，參與機(jī)體非特異性的抗感染過程。中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能缺陷常見于臨床上的慢性肉芽腫患者，以及其他生理病理或藥物作用導(dǎo)致中性粒細(xì)胞功能缺陷的患者。慢性肉芽腫一種罕見的原發(fā)性免疫缺陷病，患者由于還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶復(fù)合物組分缺陷，不能產(chǎn)生活性氧中間體(reactive oxygen intermediates，ROI)，因此臨床表現(xiàn)反復(fù)細(xì)菌和真菌感染，嚴(yán)重者可危及生命。目前已發(fā)現(xiàn)慢性肉芽腫有2種不同的遺傳方式，即X染色體隱性遺傳(CYBB基因缺陷導(dǎo)致)和常染色體隱性遺傳(CYBA、NCF1、NCF2和NCF4基因缺陷導(dǎo)致)兩種方式。由于該病的臨床表現(xiàn)與其他免疫缺陷類疾病以及感染類疾病十分類似，因此僅通過臨床表現(xiàn)并不能將其與其他病種區(qū)分開來。因此，慢性肉芽腫病臨床上主要是基于體外檢測(cè)中性粒細(xì)胞刺激后消耗氧和產(chǎn)生氧代謝物是否缺陷來診斷的。然而目前，國內(nèi)僅有北京和上海少數(shù)幾家兒童?？漆t(yī)院能夠行中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，絕大多數(shù)醫(yī)院不具備檢測(cè)技術(shù)和條件。大部分疑似病例需要從外地趕至北京上海進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，成本高且不易操作。另外，由于各家醫(yī)院檢測(cè)手段不完全相同，沒有統(tǒng)一的判斷標(biāo)準(zhǔn)。尤其針對(duì)常染色隱性遺傳的患者來說，由于其中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能并非完全喪失，因此實(shí)驗(yàn)偏差很容易影響到臨床醫(yī)師最后的診斷結(jié)果。另外，國內(nèi)市場(chǎng)上僅有一家公司在售相關(guān)試劑盒，但未排除內(nèi)源性過氧化氫酶對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，這將會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定性。因此，研發(fā)、制備穩(wěn)定的中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能檢測(cè)試劑盒將極大地促進(jìn)慢性肉芽腫病的診斷，并可促進(jìn)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能相關(guān)的臨床診斷和基礎(chǔ)研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種穩(wěn)定的用于檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒用于檢測(cè)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的能力，尤其適用于臨床篩查慢性肉芽腫患者，亦可用于其他各種生理病理?xiàng)l件，以及藥物作用對(duì)于中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的影響。本試劑盒不僅限于人類樣本的檢測(cè)，還可用于其他物種，包括小鼠、大鼠、兔、狗、牛、豬等。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明中，我們提供一種用于檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能試劑盒。該試劑盒主要基于二氫羅丹明123(Dihydrorhodamine 123,DHR123)流式細(xì)胞分析法，利用少量的周血全血即可完成檢測(cè)。其原理為：首先在測(cè)試樣本中加入過氧化氫酶以分解內(nèi)源性的過氧化氫，消除樣本間差異，然后加入DHR123。DHR123是一種小分子化合物，可自由進(jìn)入細(xì)胞。再加入佛波酯(Phorbol Myristate Acetate,PMA)溶液，中性粒細(xì)胞在PMA的刺激下可產(chǎn)生過氧化氫等活性氧。DHR123在過氧化氫和超氧陰離子等活性氧的作用下DHR123可生成羅丹明123(rhodamine123,R123)，產(chǎn)生綠色熒光。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)綠色熒光的表達(dá)情況即可判斷中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的能力。本發(fā)明的技術(shù)方案具體介紹如下。

一種用于檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的試劑盒，該試劑盒包括如下組分：PMA溶液、DHR123溶液、過氧化氫酶溶液、平衡液、洗滌液、紅細(xì)胞裂解液和稀釋液。

本發(fā)明中，PMA溶液的濃度是20μg/ml；DHR123溶液的濃度是90μg/ml；過氧化氫酶溶液的濃度是20U/μl。

本發(fā)明中，平衡液為生理鹽水；洗滌液為PBS溶液；稀釋液為PBS溶液。

本發(fā)明中，試劑盒用于檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的方法如下：

第一步，取受試樣本，置于流式細(xì)胞管底部，檢測(cè)分別為靜息組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每管50μl；如果受試樣本為血液樣本，則每管加入1ml 1x紅細(xì)胞裂解液，室溫避光孵育8～15分鐘；然后離心，去除上清，并用洗滌液清洗1-2次，每管加入50μl稀釋液；如果受試樣本為細(xì)胞樣本，則洗滌后直接加入50μl稀釋液；

第二步，向靜息組、對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中分別加入5μl過氧化氫酶；后向靜息組中加入50μl平衡液，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中分別加入50μl DHR123溶液，37℃孵育5分鐘；

第三步，向靜息組及對(duì)照組中分別加入50μl平衡液，實(shí)驗(yàn)組中加入50μl PMA溶液，37℃孵育15分鐘后立即進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)；

第四步，將上述靜息組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，圈出中性粒細(xì)胞，檢測(cè)綠色熒光的表達(dá)情況，記錄每組的平均幾何熒光強(qiáng)度；

第五步，計(jì)算刺激指數(shù)SI，可利用如下公式：SI＝實(shí)驗(yàn)組平均幾何熒光強(qiáng)度/對(duì)照組平均幾何熒光強(qiáng)度；

第六步，判斷受試樣本中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能強(qiáng)弱，分為如下3種情況：

1)利用對(duì)于人類慢性肉芽腫患者的臨床檢驗(yàn)，SI的正常參考值如下：

a.正常值：85.2-264.6；

b.X連鎖慢性肉芽腫?。?.9-3.2，部分可>4.5；

c.常染色體慢性肉芽腫病：3.5-52.1；根據(jù)正常參考值判定受試者中性粒呼吸爆發(fā)功能缺陷與否。

利用本發(fā)明的試劑盒用于臨床篩查慢性肉芽腫患者的結(jié)果分為如下幾種：

①在正常健康人中，中性細(xì)胞受PMA刺激后可產(chǎn)生活性氧，DHR123在活性氧的作用下生成具有綠色熒光的羅丹明123，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)可見幾乎全部的中性粒細(xì)胞均帶有綠色熒光，中性粒細(xì)胞峰值明顯右移；

②在X染色隱性遺傳CYBB基因突變導(dǎo)致的慢性肉芽腫患者中，中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的能力完全喪失，DHR123無法轉(zhuǎn)化成羅丹明123，因此中性粒細(xì)胞峰值無位移；

③在X染色隱性遺傳CYBB基因突變攜帶者中，由于只有一條染色體基因缺陷，另一條染色基因正常，因此檢測(cè)結(jié)果會(huì)出現(xiàn)雙峰，即一部分中性粒細(xì)胞峰值有明顯位移，而另一部分中性粒細(xì)胞峰值無位移；

④在常染色隱性遺傳基因突變導(dǎo)致的慢性肉芽腫患者中,中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧的能力缺陷，DHR123無法或只能部分轉(zhuǎn)化成R123，因此中性粒細(xì)胞峰值無位移或者僅有較少位移。

2)對(duì)于其他各種生理病理?xiàng)l件，以及藥物作用下中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能改變的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，可對(duì)比對(duì)照組的SI值進(jìn)行判斷。

3)對(duì)于其他物種中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的檢測(cè)，可參照對(duì)照組SI值進(jìn)行判斷。

本發(fā)明的試劑盒是用于檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的試劑盒，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1)需血量少。利用本試劑盒檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能，僅需少量樣本即可完成檢測(cè)過程。

2)操作簡(jiǎn)單，僅需按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行簡(jiǎn)單操作即可。無需特別的實(shí)驗(yàn)技巧，可操作性強(qiáng)。按照產(chǎn)品說明進(jìn)行操作，僅需1小時(shí)即可完成整個(gè)檢測(cè)過程。

3)成本低，推廣性強(qiáng)。因本試劑盒內(nèi)包含的試劑造價(jià)低，因此試劑盒成本低，適用于各經(jīng)濟(jì)階層的患者使用。

4)重復(fù)性好。流式檢測(cè)法可直觀真實(shí)地反應(yīng)中性粒細(xì)胞受到刺激后產(chǎn)生活性氧的情況，不受操作者主觀判斷影響，結(jié)果可重復(fù)性強(qiáng)。

5)去除樣本間差異，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為精確。本試劑盒加入過氧化氫酶去除樣本內(nèi)源性過氧化氫對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，去除了樣本間的差異，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為精確。

6)檢測(cè)結(jié)果清晰、特異性強(qiáng)，易于分析。能夠?qū)χ行粤＜?xì)胞產(chǎn)生活性氧的能力進(jìn)行定性和定量分析。對(duì)于慢性肉嚴(yán)重患兒的臨床診斷，可大致區(qū)分其的不同遺傳類型。

本試劑盒可用于檢測(cè)受試者中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能，尤其用于慢性肉芽腫病的臨床篩查；亦可用于其他生理病理?xiàng)l件或藥物作用下中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能改變的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。除人類樣本外，還可用于其他物種中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的檢測(cè)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明基于DHR123流式細(xì)胞分析法檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的原理圖示。

圖2為本試劑盒操作說明示意圖。

圖3是慢性肉芽腫病篩查的檢測(cè)結(jié)果圖示，即DHR123流式峰圖。

具體實(shí)施方式

以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限定。

實(shí)施例1

圖1為本發(fā)明基于DHR123流式細(xì)胞分析法檢測(cè)中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能的原理圖示。

通過本試劑盒可對(duì)于檢測(cè)受試者中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能進(jìn)行檢測(cè)，以此判定受試者是否為慢性肉芽腫患者。通常需要獲取待診患兒的外周血全血作為實(shí)驗(yàn)組，其父母的外周血全血作為對(duì)照組進(jìn)行檢測(cè)。

患者發(fā)生突變的X染色體通常是由母親的1條X染色體遺傳而來，少數(shù)為新發(fā)突變?；純旱母赣H因只有1條X染色體，如果其父親沒有慢性肉芽腫病相關(guān)的臨床癥狀，則默認(rèn)其為健康對(duì)照。如果待查患兒中興細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能缺如或僅余少量功能，刺激指數(shù)遠(yuǎn)低于正常值；且其母親中性粒細(xì)胞流式圖顯示雙峰，則可判定患兒為X染色體隱性遺傳慢性肉芽腫病。可繼續(xù)行基因檢測(cè)CYBB基因突變進(jìn)一步明確致病基因突變。

如果患兒中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能完全缺如或僅余少量功能，刺激指數(shù)遠(yuǎn)低于正常值；而其母親中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能正常，通過本實(shí)驗(yàn)只可判斷患者是否患慢性肉芽腫，而無法判定其遺傳方式為X染色體隱性遺傳或者常染色體隱性遺傳慢性肉芽腫病。需行基因檢測(cè)相關(guān)致病基因突變進(jìn)一步明確其類型。

圖2為實(shí)施例1的具體操作示意圖，具體步驟如下：

第一步，裂解紅細(xì)胞，制備樣本。取就診患兒及對(duì)照組外周血全血置于流式細(xì)胞管底部，每人分3管，分別為靜息組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組50μl。分別向每管中加入1ml 1x紅細(xì)胞裂解液，室溫避光孵育10分鐘。然后離心，去除上清，并用洗滌液清洗1-2次。每管加入50μl稀釋液。

第二步，加入過氧化氫酶分解內(nèi)源性過氧化氫。再加入DHR123，使其擴(kuò)散進(jìn)入中性粒細(xì)胞內(nèi)。取就診患兒及對(duì)照組外周血全血置于流式細(xì)胞管底部，每人分3管，分別為靜息組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組50μl。向每管中分別加入5μl過氧化氫酶，以分解樣本內(nèi)源性過氧化氫酶，消除樣本間差異。再向靜息組加入50μl平衡液，對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組中分別加入50μl DHR123溶液，37度孵育5分鐘，使DHR123自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。

第三步，PMA刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過氧化氫等活性氧，DHR123在活性氧的作用下生成R123。向靜息組及對(duì)照組中分別加入50μl平衡液，實(shí)驗(yàn)組中加入50μl PMA溶液，37度孵育15分鐘。健康人中性粒細(xì)胞在PMA的刺激下可產(chǎn)生大量活性氧，DHR123在活性氧的作用下生成帶有綠色熒光的R123；而慢性肉芽腫患者不能產(chǎn)生或較少產(chǎn)生活性氧，因此不能將DHR123轉(zhuǎn)化成R123，或者僅能將少量的DHR123轉(zhuǎn)化成R123。

第四步，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)R123的轉(zhuǎn)化率。將上述靜息組、對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組分別利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。圈出中性粒細(xì)胞，檢測(cè)綠色熒光的表達(dá)情況，記錄每組的平均幾何熒光強(qiáng)度。

第五步，計(jì)算刺激指數(shù)SI，判斷中性粒細(xì)胞呼吸爆發(fā)功能強(qiáng)弱，指導(dǎo)慢性肉芽腫的臨床診斷。利用如下公式進(jìn)行計(jì)算：SI＝實(shí)驗(yàn)組平均幾何熒光強(qiáng)度/對(duì)照組平均幾何熒光強(qiáng)度?？筛鶕?jù)如下SI的正常參考值指導(dǎo)慢性肉芽腫的診斷：1)正常值：85.2-264.6；2)X連鎖慢性肉芽腫?。?.9-3.2，部分>4.5；3)常染色體慢性肉芽腫?。?.5-52.1。根據(jù)正常參考值判定受試者中性粒呼吸爆發(fā)功能缺陷與否。

圖2是實(shí)施例1的試劑盒操作說明示意圖。圖3為檢測(cè)結(jié)果圖示DHR123流式峰圖。通常情況下，慢性肉芽腫患者外周全血經(jīng)PMA刺激后，中性粒細(xì)胞柱狀圖沒有向右偏移或者僅有少量偏移；健康對(duì)照中性粒細(xì)胞柱狀圖明顯向右偏移；CYBB基因突變攜帶者，即患兒母親中性粒細(xì)胞柱狀圖有兩個(gè)峰值，其中一個(gè)峰值沒有向右或僅有少量偏移，另一個(gè)峰值明顯向右偏移。