本發(fā)明涉及一種在臨床上指導美托諾爾等高血壓個體化用藥的adrb11165c>g基因多態(tài)性檢測的電化學傳感器的制備方法及應用，尤其是基于金屬有機框架包裹血紅素的非標記型生物傳感器，用于檢測adrb11165c>g基因多態(tài)性，屬于電化學檢測領域。

背景技術：

在過去十年中，鑒定疾病特定基因的改變使得靶向治療得到了迅猛發(fā)展。在高血壓治療中，通過使用美托洛爾及其類似藥物靶向攜帶adrb1突變基因使其治療效果得到了顯著提高，具有更高功效和更少副作用的聯(lián)合治療的其它藥物已處于臨床試驗中，因此，對患者常規(guī)地篩選是否攜帶有該基因的突變以確定他們是否可以受益于這種類型的治療。adrb1是β1-腎上腺素能受體基因，已知其為高血壓β受體阻滯劑的靶基因。adrb1體細胞突變，arg389gly（rs1801253，c.1165c>g）存在于68.6-80.5％的高血壓中，arg389gly的高血壓患者比攜帶純合arg389arg的人群需要更大的劑量，因此，需要適用于該基因型檢測的靈敏方法。

現(xiàn)有檢測adrb1突變的方法依賴于dna測序和聚合酶鏈反應（pcr）等。dna測序昂貴的檢測費用以及緩慢的檢測周期（2-3周）使其不能作為臨床常規(guī)檢測手段。pcr容易受到來自生物樣品復雜組分的干擾，同時需要樣品的預處理和來自大體積樣品的核酸純化過程。因此，迫切需要一種更為準確并能夠在血清或血液中直接檢測adrb1突變的方法。近年來，電化學dna傳感器這一萬能的檢測平臺由于其靈敏度高，成本低廉，快速和檢測樣品量少等優(yōu)勢在生物標志物的檢測方面得到了迅猛發(fā)展。

血紅素是一種眾所周知的天然金屬卟啉化物，具有類似過氧化物酶樣活性。然而，血紅素作為催化劑常常面臨催化活性低，在中性和堿性水性緩沖液中穩(wěn)定性差等問題。為了突破這些瓶頸，發(fā)展作為血紅素的支持基質以獲得具有強催化活性和高穩(wěn)定性的仿生催化劑是一種理想的方式。fe-mil-88nh2金屬有機框架由于其高比表面積，可調孔徑和暴露的活性位點，是一種新型的主體基質材料，可用于血紅素的固載，發(fā)展具有高催化活性和長催化壽命的固態(tài)催化劑。一些研究者將血紅素包裹在fe-mil-88nh2中構建電化學或化學發(fā)光傳感器用于蛋白質的檢測。

然而，到目前為止，fe-mil-88nh2金屬有機框架包裹血紅素構建電化學dna傳感器很少有報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于高血壓個體化用藥基因adrb1-1165c>g檢測的電化學傳感器制備方法，用于通過使用pt/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺作為信號擴增平臺的超敏檢測adrb1突變基因，鉑納米粒子、氯高鐵血紅素、cu²⁺的協(xié)同作用不僅能增加對h2o2的電催化活性，而且能提高捕獲探針的有效固定，大大擴展了檢測范圍，同時驗證了其臨床實際應用的可行性。

為達到目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種用于高血壓個體化用藥基因adrb1-1165c>g檢測的電化學傳感器制備方法，其特征是包括以下步驟：

(1)鉑納米粒子/血紅素@金屬有機框架/銅離子（pt/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺）納米復合材料的制備；

(2)使用pt/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺作為納米復合材料信號擴增平臺，建立電化學dna生物傳感器；

(3)應用步驟（2）得到的電化學dna生物傳感器對基因adrb1-1165c>g進行檢測。

本發(fā)明中，上述步驟（1）“鉑納米粒子/血紅素@金屬有機框架/銅離子（pt/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺）納米復合材料的制備；”，包括以下步驟：

(1.1)hemin@fe-mil-88nh2納米復合材料的制備：

把0.187g的六水三氯化鐵（fecl3?6h2o）、0.226g的血紅素和0.126g的二氨基對苯二甲酸溶于15ml二甲基亞砜（dmf）中，混合溶液置于硅樹脂中120℃油浴4h；然后加入3.45mmol抗壞血酸，加熱15min；逐漸冷卻至室溫，離心，用二甲基亞砜、乙醇、去離子水依次清洗，離心后所得納米材料沉淀物置于真空干燥箱中干燥過夜，得到金屬有機框架包裹的血紅素納米復合材料hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺；

(1.2)pt/hemin@fe-mil-88nh2納米復合材料的制備：

通過采用硼氫化鈉還原的方法合成鉑納米粒子功能化的hemin@fe-mil-88nh2；首先，用1ml質量百分比濃度1％的氯鉑酸(h2ptcl6)加入到1ml濃度為1mg/ml的hemin@fe-mil-88nh2溶液中，超聲20min；然后把2ml濃度為0.1m的硼氫化鈉(nabh4)溶液逐滴加入上述混合溶液中，400rpm攪拌30min；混合溶液離心，水洗三次，鉑納米粒子通過pt-n鍵連接結合于hemin@fe-mil-88nh2表面，得到pt/hemin@fe-mil-88nh2納米復合材料；

(1.3)pt/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺復合材料的制備：

首先，把1ml濃度為2mg/ml的pt/hemin@fe-mil-88nh2納米復合材料溶液分散于10ml濃度為2mg/ml的硝酸銅（cu(no3)2）水溶液中，室溫攪拌24h，使銅離子吸附于pt/hemin@fe-mil-88nh2納米復合材料表面；所得雜合物離心，水洗3次以除去未結合的cu²⁺，得到pt/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺納米復合材料。

本發(fā)明中，上述步驟（2）“使用pt/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺作為納米復合材料信號擴增平臺，建立電化學dna生物傳感器”，其特征在于，括以下步驟：

(2.1)分別依次用0.3mm和0.05mm的氧化鋁（al2o3）粉末將電極拋光成鏡面，然后分別按超純水、無水乙醇、超純水的順序超聲電極各5min，室溫干燥備用；

(2.2)將6ml濃度為2mg/ml的pt/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺納米復合材料溶液滴加在電極表面，室溫干燥；

(2.3)將10ml濃度為1μm序列表中的seqidno：1所示dna片段捕獲探針溶液滴加至電極表面，4℃孵育12h；

(2.4)用清洗緩沖液將孵育后的電極沖洗干凈后，滴加6μl濃度為1.0mm己硫醇（ht）室溫孵育30min，得到電化學dna生物傳感器；其中，所述清洗緩沖液的組分組成：濃度為10mm的na2hpo4、濃度為2mm的kh2po4、濃度為37mm的nacl、濃度為2.7mm的kcl、其余是去離子水；ph為7.4。

本發(fā)明中，上述步驟（3）“應用電化學dna生物傳感器對基因adrb1-1165c>g進行檢測”，其特征在于包括以下步驟：

(3.1)用清洗緩沖液將孵育后的電極沖洗干凈后將濃度依次從1fm、10fm、100fm、1pm、10pm的目標dna片段溶液（所述dna見序列表中的seqidno：2所示）滴加于同一批次構建的不同電極表面，37℃雜交2h；

(3.2)將孵育后的電極用清洗緩沖液沖洗干凈后置于氮氣中干燥；

(3.3)將電極置于7ml磷酸鹽緩沖溶液中進行表征,待背景電流穩(wěn)定之后，20μl，1.2moll-1的h2o2加入上述磷酸鹽緩沖溶液中，在－0.7v電位下i–t曲線記錄其電流值；其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的組分組成：濃度為0.1m的na2hpo4、濃度為0.1m的kh2po4、濃度為0.1m的kcl、其余是去離子水；

(3.4)根據(jù)所得峰電流與目標dna片段溶液（所述dna見序列表中的seqidno：2所示）濃度呈線性關系，繪制標準曲線。

有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明突出的特點是：

(1)為了提高傳感器的檢測限，引入具有良好生物相容性的鉑納米粒子（ptnps）用于協(xié)同催化h2o2。由于鉑/血紅素@fe-mil-88nh2納米復合材料大的表面積，高電導率和優(yōu)異的吸附能力，其表面氨基官能化可用于cu²⁺吸附，可進一步促進過氧化氫的氧化還原?；趐t/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺的協(xié)同效應，獲得具有多重信號放大的；將鉑納米粒子，血紅素，銅離子引入到電化學dna生物傳感器的制備中，構建了具有多重級聯(lián)催化信號放大性能的納米復合材料用于傳感界面修飾，不僅提高了生物分子的固載量，而且提高了電化學dna生物傳感器的靈敏度和生物相容性；

(2)本方法對adrb1基因進行檢測，不需要對樣品核酸進行標記及pcr放大處理；

(3)本方法制備的電化學dna生物傳感器可為臨床根據(jù)不同病人基因型調整美托洛爾用藥劑量；

(4)使用完全相同的納米材料和修飾方法，利用捕獲探針，信號探針與目標dna的特異性識別，只需通過改變探針的核酸序列即可實現(xiàn)多種疾病(如腫瘤)個體化用藥基因的特異性，高靈敏檢測，另外，此方法簡便，快速，便于實現(xiàn)商品化，從而推進轉化醫(yī)學的發(fā)展。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的電化學dna生物傳感器的構建示意圖。

圖2為本發(fā)明的pt/hemin@fe-mil-88nh2納米復合材料的場發(fā)射掃描電鏡圖、能量衍射光電子光譜圖及x射線光電子能譜分析圖。

圖3為本發(fā)明的電化學dna生物傳感器在檢測adrb1-1165c>g基因多態(tài)性時得到的i-t曲線與濃度的線性關系，以及傳感器的特異性與重現(xiàn)性。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發(fā)明進行進一步闡述，應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

實施例１

結合圖1所示，進一步描述本發(fā)明的實施方式如下：

步驟1.0.187g的六水三氯化鐵（fecl3?6h2o）、0.226g的血紅素和0.126g的二氨基對苯二甲酸溶于15ml二甲基亞砜（dmf）中，混合溶液置于硅樹脂中120℃油浴4h；然后3.45mmol抗壞血酸加入上述溶液中，加熱15min；逐漸冷卻至室溫，離心，dmf、乙醇、去離子水依次清洗，沉淀物置于真空干燥箱中干燥過夜，得到金屬有機框架包裹的血紅素（hemin@fe-mil-88nh2）納米復合材料；

步驟2.在合成好1ml的hemin@fe-mil-88nh2（1mg/ml）溶液中加入1ml質量百分比濃度為1％的氯鉑酸(h2ptcl6)，劇烈超聲20min；然后把2ml濃度為0.1m硼氫化鈉(nabh4)溶液逐滴加入上述混合溶液中，400rpm攪拌30min；混合溶液離心，水洗三次，鉑納米粒子可通過pt-n鍵連接結合于hemin@fe-mil-88nh2表面，得到鉑納米粒子功能化的hemin@fe-mil-88nh2（pt/hemin@fe-mil-88nh2）；

步驟3.將1ml，2mg/mlpt/hemin@fe-mil-88nh2分散于10ml,2mg/mlcu(no3)2水溶液中，室溫攪拌24h，使銅離子吸附于pt/hemin@fe-mil-88nh2表面；所得雜合物離心，水洗多次，得到pt/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺納米復合材料；

從圖2a、2bpt/hemin@fe-mil-88nh2的場發(fā)射掃描電鏡圖可見許多亮點樣結構分布于hemin@fe-mil-88nh2表面，此為鉑納米粒子，表明鉑納米粒子已成功修飾于hemin@fe-mil-88nh2表面；圖2c為pt/hemin@fe-mil-88nh2的能量衍射光電子光譜圖，從圖可見除了c、n、o、fe元素峰以外明顯可見pt元素峰，同樣表明鉑納米粒子已成功修飾成功于hemin@fe-mil-88nh2的表面；圖2d、2e、2e為pt/hemin@fe-mil-88nh2的x射線光電子能譜分析圖，從圖可見pt4f、c1s、n1s、o1s和fe2p特征峰，進一步說明pt/hemin@fe-mil-88nh2已成功合成；

步驟4.分別用0.3mm和0.05mm的氧化鋁（al2o3）粉末將電極拋光成鏡面，然后分別按超純水、無水乙醇、超純水的順序超聲電極各5min，室溫干燥備用；

步驟5.將6ml濃度為2mg/mlpt/hemin@fe-mil-88nh2/cu²⁺滴加在電極表面，室溫干燥；

步驟6.將10ml濃度為1μm序列表中的seqidno：1所示dna片段捕獲探針溶液滴加至電極表面，4℃孵育12h；

步驟7.用清洗緩沖液將孵育后的電極沖洗干凈后滴加6μl濃度為1.0mm己硫醇（ht）室溫孵育30min，得到電化學dna生物傳感器；其中，所述清洗緩沖液的組分組成：濃度為10mm的na2hpo4、濃度為2mm的kh2po4、濃度為37mm的nacl、濃度為2.7mm的kcl、其余是去離子水；ph為7.4；

步驟8.將本發(fā)明上述傳感器于4℃保存，間斷檢測傳感器電流響應，儲存28天后電流響應仍為初始電流的91.17%,表面?zhèn)鞲衅骶哂辛己玫姆€(wěn)定性；本發(fā)明取同一批次制備的dna生物傳感器5支，在相同條件下對0.1、10、和1000fm的adrb1-1165c>g基因dna片段分別進行測定，每一濃度測定5次，結果響應電流的相對標準偏差少于4.11%；同時，取不同批次制備的dna生物傳感器3支，在相同條件下對0.1、10、和1000fm的adrb1-1165c>g基因dna片段分別進行測定，每一濃度測定5次，結果響應電流的相對標準偏差少于4.33%,說明傳感器批內(nèi)及批間差異小，傳感器重現(xiàn)性良好；

步驟9.用清洗緩沖液將孵育后的電極沖洗干凈后將不同濃度（濃度依次為1fm、10fm、100fm、1pm、10pm）的目標dna片段溶液（所述dna片段見序列表中的seqidno：2所示）滴加于電極表面，37℃雜交2h；

步驟10將孵育后的電極用清洗緩沖液沖洗干凈后置于氮氣中干燥；

步驟11.將電極置于7ml磷酸鹽緩沖溶液中進行表征，待背景電流穩(wěn)定之后，加入20μl濃度為1.2mol/l的h2o2加入上述磷酸鹽緩沖溶液中，在0.7v電位下i–t曲線記錄其電流值；其中，所述磷酸鹽緩沖溶液的組分組成：濃度為0.1m的na2hpo4、濃度為0.1m的kh2po4、濃度為0.1m的kcl、其余是去離子水；

步驟12.根據(jù)所得峰電流與adrb1-1165c>g基因的dna片段溶液（所述dna見序列表中的seqidno：2所示）濃度呈線性關系，繪制工作曲線；測定結果表明adrb1-1165c>g基因dna片段濃度在1fm-10nm范圍內(nèi)成線性關系，線性相關系數(shù)為0.998，檢測限位0.33fm；

步驟13.將本發(fā)明上述傳感器用于檢測目標核酸序列（序列表中的seqidno：2所示）、錯配堿基（序列表中的seqidno：3、4、5所示）及隨機序列（序列表中的seqidno：6所示），結果錯配堿基電流響應相對于目標核酸序列顯得微不足道，說明傳感器的特異性好，可以很好區(qū)分目標序列且可排除空白血漿基質干擾；

從圖3a可見傳感器的電流響應值隨著待測目標基因濃度的增加而減小，且具有良好的線性相關性（圖3b）；從3c可見傳感器對adrb1-1165c>g目標基因（adrb1）進行檢測時，電流響應值遠遠大于單堿基錯配（sbm）、雙堿基錯配（dbm）、三堿基錯配（tbm）、隨機序列（random）以及空白血漿（blank），說明傳感器的選擇性良好；從圖3d可見，傳感器批內(nèi)（intraday）、批間（interday）差異很小，說明傳感器的重現(xiàn)性佳，可以很好用于目標物質分析。

從圖3可以看出，以傳感器對空白血漿的測量電流響i0應值為基線，然后采用傳感器對含有基因片段的待測血漿進行檢測；若待測血漿中含有adrb1-1165c>g目標dna片段，則傳感器的電流響應值i1會較空白血漿的電流響應值i0明顯升高，且i0和i1兩則電流響應值間會存在明顯統(tǒng)計學差異；若待測血漿中不含有adrb1-1165c>g目標序列（此時可能是單堿基錯配、雙堿基錯配、三堿基錯配，隨機序列或血漿中其他物質），則傳感器的電流響應值i1會與空白血漿的電流響應值i0無明顯變化，且i0和i1兩則電流響應值間不存在統(tǒng)計學差異。電化學傳感器測量結果直觀如圖3c所示，即adrb1-1165c>g患者比未突變?nèi)巳盒枰蟮膭┝俊?/p>

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出的是，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提條件下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明中，所述的濃度符號代表的含義如下：

m：mol/l（摩爾/升）；

mm：mmol/l（毫摩爾/升）；

μm：μmol/l（微摩爾/升）；

nm：nmol/l（納摩爾/升）；

fm：fmol/l（飛摩爾/升）；

pm：pmol/l（皮摩爾/升）。

序列表

<110>十堰市太和醫(yī)院

<120>一種用于高血壓個體化用藥基因adrb1-1165c>g檢測的電化學傳感器制備方法

<160>6

<210>1

<211>12

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設計，以用作與生物素結合作為捕獲探針

<400>1

gaagtggcagca12

<210>2

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設計，以用作靶基因序列

<400>2

tgctgccacttcgtcaccaaccgggcctac30

<210>3

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設計，以用作隨機序列

<400>3

catccatcgtatgtcaccaaccgggcctac30

<210>4

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設計，以用作與靶基因相對應的單堿基錯配序列

<400>4

tgctgcgacttcgtcaccaaccgggcctac30

<210>5

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設計，以用作與靶基因相對應的雙堿基錯配序列

<400>5

tcctgcgacttcgtcaccaaccgggcctac30

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>根據(jù)大小和極性而設計，以用作與靶基因相對應的三堿基錯配序列

<400>6

tcctgcgacttggtcaccaaccgggcctac30