本發(fā)明涉及實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)領(lǐng)域中的一種分析試劑盒及其檢測(cè)方法，具體涉及一種用于快速測(cè)定葡萄糖氧化酶活性的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD)，其系統(tǒng)命名為β－D－葡萄糖氧化還原酶(EC1.1.3.4)，它能高度專一性地催化β－D－葡萄糖與氧反應(yīng)，使葡萄糖氧化成為葡萄糖酸和過氧化氫。該酶廣泛分布于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)。1928年Muller首先在黑曲霉的無(wú)細(xì)胞提取液中發(fā)現(xiàn)葡萄糖氧化酶。1960年Kusai等、1964年P(guān)azurp和Swoboddas分別從青霉素和黑曲霉中提純葡萄糖氧化酶。1995年P(guān)etruccioli等用青霉素的突變株生產(chǎn)出葡萄糖氧化酶。我國(guó)自1986年開始研究葡萄糖氧化酶的制備提純工藝,1998年正式投入生產(chǎn)。1999年農(nóng)業(yè)部將其定為12種允許使用的飼料酶制劑添加劑之一。

葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成過氧化氫(H₂O₂)，H₂O₂在過氧化物酶催化下可將4-氨基安替比林和苯酚氧化縮合生成粉紅色醌亞胺，基本反應(yīng)如下:

測(cè)定時(shí)，在第一步的反應(yīng)中，葡萄糖底物要求相對(duì)葡萄糖氧化酶絕對(duì)過量，從而催化反應(yīng)為準(zhǔn)一級(jí)反應(yīng)，反應(yīng)速率與加入的酶量成正比，而與底物濃度無(wú)關(guān)。第二步的反應(yīng)目的是精確地測(cè)定第一步反應(yīng)所釋放的H₂O₂的量，這一步反應(yīng)需要過氧化物酶相對(duì)H₂O₂絕對(duì)過量，使生成的H₂O₂迅速參加反應(yīng)，以達(dá)到實(shí)時(shí)測(cè)定第一步反應(yīng)速率的目的。反應(yīng)液顏色的深度與過氧化物酶催化產(chǎn)生的醌亞胺的量成正比，而醌亞胺的的生成量與H₂O₂生成量成正比，H₂O₂生成量則與反應(yīng)液中葡萄糖氧化酶的活力成正比。

如何將上述的測(cè)定原理通過對(duì)吸收波長(zhǎng)，緩沖液類型、pH值，反應(yīng)時(shí)間等進(jìn)行優(yōu)化，制造出一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便的葡萄糖氧化酶活性快速測(cè)定試劑盒是技術(shù)人員要解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問題是提供一種快速測(cè)定葡萄糖氧化酶活性的檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，旨在解決上述問題。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種葡萄糖氧化酶活性快速測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟；

將液體酶液通過1000～3000RCF離心10～20min，所獲得的上清液用緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋；

吸取1.0mL磷酸鹽緩沖液，置于37℃水浴保溫5～10min；

吸取1.0mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液，置于37℃水浴保溫5～10min；

吸取磷酸鹽緩沖液20.0mL、苯酚溶液2.0mL、4-氨基安替比林溶液1.0mL、過氧化物酶溶液1.0mL和葡萄糖底物溶液6.0mL，總計(jì)30.0mL混勻作為測(cè)定試劑，取混合液適量置于37℃水浴保溫5～10min；

取一干凈比色杯，吸取3.0mL經(jīng)過37℃水浴保溫的測(cè)定試劑加入比色杯中，將比色杯放入分光光度計(jì)中，在波長(zhǎng)500nm處調(diào)零，隨后向比色杯中加入0.1mL經(jīng)過37℃水浴保溫的待測(cè)酶液，加入比色杯中同時(shí)計(jì)時(shí)，并立即吹吸使之混合均勻，以后每隔1min記錄吸光值，連續(xù)記錄10min；

按照公式計(jì)算酶稀釋液中葡萄糖氧化酶的活力：

公式中，X_D：酶稀釋液中葡萄糖氧化酶的活力，單位為U/mL；ΔA₅₀₀：一定時(shí)間內(nèi)在波長(zhǎng)500nm處溶液吸光值變化；Δt：吸光值變化對(duì)應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間，單位為min；1：比色皿厚度，單位為cm；12.9：生成顯色物醌亞胺的毫摩爾吸光系數(shù)，單位為L(zhǎng)·mmol^-1.cm^-1；1/2：每1mol過氧化氫生成醌亞胺物質(zhì)的量；V_總：反應(yīng)混合液總體積，單位為mL；：V_酶酶溶液的體積，單位為mL；

按照公式計(jì)算葡萄糖氧化酶樣品的酶活力，固體樣品單位為酶活性單位每克(U/g)，其計(jì)算公式為：液體樣品單位酶活性單位每毫升(U/mL)其計(jì)算公式為： 公式中，X：葡萄糖氧化酶樣品的酶活力，單位為U/g(或U/mL)；Df：所取酶樣品全部稀釋到合適濃度對(duì)應(yīng)的緩沖液體積，單位為mL；m：稱取的固體酶樣品質(zhì)量，單位為g；V：量取的液體酶樣品體積，單位為mL。

一種葡萄糖氧化酶活性快速測(cè)定試劑盒，期特征在于，包括R1、R2、R3、R4和R5試劑，各試劑組分與配比為：

R1：緩沖液100-200mmol/L；

R2：葡萄糖水溶液1000mmol/L；

R3：過氧化物酶溶液125KU/L；

R4：4-氨基安替比林溶液4mg/mL(19.68mmol//L)；

R5：苯酚溶液1.5mg/mL(15.9mmol//L)；

緩沖液pH5.0-7.0，

所述的緩沖液可以為但不限于磷酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、McIlvaine緩沖液，其pH為5.0-7.0。試劑盒還進(jìn)一步含有非離子表面活性劑，其中非離子表面活性劑可以是吐溫系列、TritonX非離子表面活性劑，用量可以是0.01-1％，主要起到增溶、澄清作用。

附圖說明

圖1為酶活測(cè)定線性范圍回歸直線

圖2為酶活測(cè)定線性范圍回歸直線

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

本實(shí)施例中的一種葡萄糖氧化酶快速定量檢測(cè)試劑盒為五種試劑，包括R1、R2、R3、R4和R5試劑，各試劑組分與配比為：

R1試劑：pH6.0磷酸鹽緩沖液100mmol/L；

R2試劑：葡萄糖水溶液1000mmol/L；

R3試劑：過氧化物酶溶液0.5mg/L；

R4試劑：4-氨基安替比林溶液4mg/mL；

R5試劑：苯酚溶液1.5mg/mL；

上述試劑溶解后，分裝入瓶，制成液體五試劑，直接按特定比例混合即可使用。

實(shí)施例2

利用實(shí)施例1中的葡萄糖氧化酶快速定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)發(fā)酵液中葡萄糖氧化酶的活性，具體操作步驟如下：

1)樣品的制備

將發(fā)酵液通過2000RCF離心10min，所獲得的上清液既是，然后取上清液用緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋；

2)吸取1.0mL磷酸鹽緩沖液，置于37℃水浴保溫5min；

3)吸取1.0mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液，置于37℃水浴保溫5min；

4)吸取磷酸鹽緩沖液20.0mL、苯酚溶液2.0mL、4-氨基安替比林溶液1.0mL、過氧化物酶溶液1.0mL和葡萄糖底物溶液6.0mL，總計(jì)30.0mL混勻作為測(cè)定試劑，取混合液適量置于37℃水浴保溫5min；

5)取一干凈比色杯，吸取3.0mL測(cè)定試劑(經(jīng)過37℃水浴保溫)加入比色杯中，將比色杯放入分光光度計(jì)中，在波長(zhǎng)500nm處調(diào)零；

6)隨后向比色杯中加入0.1mL待測(cè)酶液(經(jīng)過37℃水浴保溫)，加入比色杯中同時(shí)計(jì)時(shí)，并立即吹吸使之混合均勻，以后每隔1min記錄吸光值，連續(xù)記錄10min；根據(jù)公式

和公式進(jìn)行計(jì)算葡萄糖氧化酶的活性。

實(shí)施例3

利用實(shí)施例1中的葡萄糖氧化酶快速定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)純酶溶液葡萄糖氧化酶的活性，具體操作步驟如下：

1)樣品制備：將酶樣品稱取試樣兩份，精確至0.001g，置于100mL容量瓶中，加入約40mL磷酸鹽緩沖液，在電磁振蕩器或恒溫振蕩器震蕩30min，或者用磁力攪拌器攪拌30min，取出用磷酸鹽緩沖液定容并搖勻，取搖勻的貯存液上離心機(jī)以4000r/min離心10min，然后取上清液用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。液體樣品可以直接用磷酸鹽緩沖液進(jìn)行稀釋、定容；

2)吸取1.0mL磷酸鹽緩沖液，置于37℃水浴保溫5min；

3)吸取1.0mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液，置于37℃水浴保溫5min；

4)吸取磷酸鹽緩沖液20.0mL、苯酚溶液2.0mL、4-氨基安替比林溶液1.0mL、過氧化物酶溶液1.0mL和葡萄糖底物溶液6.0mL，總計(jì)30.0mL混勻作為測(cè)定試劑，取混合液適量置于37℃水浴保溫5min；

5)取一干凈比色杯，吸取3.0mL測(cè)定試劑(經(jīng)過37℃水浴保溫)加入比色杯中，將比色杯放入分光光度計(jì)中，在波長(zhǎng)500nm處調(diào)零；

6)隨后向比色杯中加入0.1mL待測(cè)酶液(經(jīng)過37℃水浴保溫)，加入比色杯中同時(shí)計(jì)時(shí)，并立即吹吸使之混合均勻，以后每隔1min記錄吸光值，連續(xù)記錄10min；

7)固體樣品單位為酶活性單位每克(U/g)，按公式和公式進(jìn)行計(jì)算；

液體樣品單位酶活性單位每毫升(U/mL)，按公式和公式進(jìn)行計(jì)算。

酶活力單位U定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘使1μmol葡萄糖氧化為葡萄糖酸和H₂O₂所需要的酶量，定義為一個(gè)酶活力單位。

實(shí)施例4

利用實(shí)施例1中的葡萄糖氧化酶快速定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)葡萄糖氧化酶純酶溶液稀釋液的活性，結(jié)果如下：

將葡萄糖氧化酶純酶制劑溶解于pH7.0磷酸鹽緩沖液中，適當(dāng)稀釋得到酶液A(0.66U)，再進(jìn)一步進(jìn)行梯度稀釋，按照連續(xù)分光光度法連續(xù)測(cè)定1-10min的吸光度變化。每個(gè)濃度重復(fù)兩次，取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸光度的平均值進(jìn)行線性回歸分析，利用回歸分析所得直線斜率計(jì)算酶活力。結(jié)果如表1所示。

表1吸光值變化速率回歸分析與檢驗(yàn)

從表1中可以看出，酶稀釋液在不同的濃度下的線性相關(guān)系數(shù)均較高，基本呈隨酶液濃度增大而減小趨勢(shì)，主要原因是隨著酶活增大，底物對(duì)于酶活不再絕對(duì)過量，反應(yīng)對(duì)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)有所偏離。p值均小于0.01，因此在各個(gè)濃度下10min內(nèi)吸光值的變化均為嚴(yán)格的線性變化，因此只從吸光度隨時(shí)間變化難以判斷酶活測(cè)定線性范圍，需要進(jìn)一步分析。

利用所得回歸直線的斜率計(jì)算出酶活，以酶活對(duì)相對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸分析，并對(duì)相對(duì)酶液A濃度0.1～0.5的范圍結(jié)果作圖，見說明書附圖1。

表2酶活測(cè)定線性范圍回歸分析與檢驗(yàn)

從表2可以看出，在相對(duì)酶液A的濃度為0.1～0.5的范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)與R²值最大，因此在這個(gè)濃度范圍內(nèi)酶活測(cè)定值與濃度呈嚴(yán)格的線性關(guān)系。濃度范圍的上限增加后，雖然均有很小的p值，但是從相關(guān)系數(shù)上看，從0.1～0.5的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系更加嚴(yán)格，說明書附圖1也印證了這一點(diǎn)，因此可以確定0.055～0.207U/mL在該測(cè)定方法的線性范圍內(nèi)。實(shí)際應(yīng)用中，可以用每分鐘吸光值變化的大小來方便地判定酶液濃度是否在線性范圍內(nèi)，從表1可看出對(duì)應(yīng)的每分鐘吸光值變化為0.011～0.042。

由于用線性回歸的方法計(jì)算ΔA/Δt比較麻煩，降低了連續(xù)分光光度法的實(shí)用性，因此嘗試對(duì)線性范圍內(nèi)的點(diǎn)采取兩點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算。分別選取第一組(2min和6min)、第二組(2min和8min)和第三組(2min和10min)兩組吸光值進(jìn)行分析，結(jié)果如表3、表4和表5所示。

表3兩點(diǎn)法和標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果比較(第一組)

表4兩點(diǎn)法和標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果比較(第二組)

表5兩點(diǎn)法和標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果比較(第三組)

經(jīng)過分析，在線性范圍內(nèi)的各濃度點(diǎn)，取第三組的吸光值用兩點(diǎn)法得到的酶活與標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)得的酶活相當(dāng)接近，最大相對(duì)誤差僅為0.85％，第二組測(cè)得的酶活值相對(duì)誤差最大不超過1.36％，可以替代標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定值。第一組測(cè)得的酶活值相對(duì)誤差最大不超過3.70％，對(duì)于要求不甚嚴(yán)格的分析也可以接受，并且更加快捷。因此，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)分光光度法，兩點(diǎn)法更加實(shí)用。

選取不同來源的3種葡萄糖氧化酶樣品，適當(dāng)稀釋后4000rpm/min離心10min，取上清液測(cè)定酶活力。記錄1～10min的吸光值，每分鐘記錄一次。通過公式(1)可以看出，在計(jì)算酶活力是不需要時(shí)間點(diǎn)和吸光值嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系，只需要一個(gè)時(shí)間段的吸光值變化數(shù)據(jù)，且ΔA/Δt在方法允許的線性范圍內(nèi)即可。取2～10min時(shí)的吸光值進(jìn)行線性回歸分析，同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算酶活力，并選擇2min和10min時(shí)的吸光值用兩點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算，如表6所示。

表6樣品酶活測(cè)定吸光值變化速率回歸分析與酶活計(jì)算

表6表明樣品酶活測(cè)定吸光值在2～10min線性關(guān)系良好，并且標(biāo)準(zhǔn)方法與兩點(diǎn)法結(jié)果高度一致，可以直接使用兩點(diǎn)法測(cè)定，后續(xù)工作可以以此進(jìn)行。

實(shí)施例5

利用實(shí)施例1中的葡萄糖氧化酶快速定量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)純酶溶液葡萄糖氧化酶的活性，結(jié)果如下：

將葡萄糖氧化酶純酶制劑溶解于pH6.0磷酸鹽緩沖液中，適當(dāng)稀釋得到酶液酶液B(0.59U)，再進(jìn)一步進(jìn)行梯度稀釋，按照連續(xù)分光光度法連續(xù)測(cè)定1-10min的吸光度變化。每個(gè)濃度重復(fù)兩次，取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)吸光度的平均值進(jìn)行線性回歸分析，利用回歸分析所得直線斜率計(jì)算酶活力。結(jié)果如表7所示。

表7吸光值變化速率回歸分析與檢驗(yàn)

在不同的濃度下的線性相關(guān)系數(shù)均較高，基本呈隨酶液濃度增大而減小趨勢(shì)，主要原因是隨著酶活增大，底物對(duì)于酶活不再絕對(duì)過量，反應(yīng)對(duì)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)有所偏離。p值均小于0.01，因此在各個(gè)濃度下10min內(nèi)吸光值的變化均為嚴(yán)格的線性變化，因此只從吸光度隨時(shí)間變化難以判斷酶活測(cè)定線性范圍，需要進(jìn)一步分析。

利用所得回歸曲線的斜率計(jì)算出酶活，以酶活對(duì)相對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸分析，并對(duì)相對(duì)酶液B濃度0.1～0.5的范圍結(jié)果作圖。

表8酶活測(cè)定線性范圍回歸分析與檢驗(yàn)

從表8可以看出，在相對(duì)酶液B的濃度為0.1～0.5的范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)與R²值最大，因此在這個(gè)濃度范圍內(nèi)酶活測(cè)定值與濃度呈嚴(yán)格的線性關(guān)系。濃度范圍的上限增加后，雖然均有很小的p值，但是從相關(guān)系數(shù)上看，從0.1～0.5的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系更加嚴(yán)格，說明書附圖2也印證了這一點(diǎn)，因此可以確定0.050～0.209U/mL在該測(cè)定方法的線性范圍內(nèi)。實(shí)際應(yīng)用中，可以用每分鐘吸光值變化的大小來方便地判定酶液濃度是否在線性范圍內(nèi)，從表7可看出上述范圍對(duì)應(yīng)的每分鐘吸光值變化約為0.010～0.042。

由于用線性回歸的方法計(jì)算ΔA/Δt比較麻煩，降低了連續(xù)分光光度法的實(shí)用性，因此嘗試對(duì)線性范圍內(nèi)的點(diǎn)采取兩點(diǎn)法進(jìn)行計(jì)算。分別選取第一組(2min和6min)、第二組(2min和8min)和第三組(2min和10min)兩組吸光值進(jìn)行分析，結(jié)果如表9、表10和表11所示。

表9兩點(diǎn)法和標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果比較(第一組)

表10兩點(diǎn)法和標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果比較(第二組)

表11兩點(diǎn)法和標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定結(jié)果比較(第三組)

經(jīng)過分析，在線性范圍內(nèi)的各濃度點(diǎn)，取第二組的吸光值用兩點(diǎn)法得到的酶活與標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)得的酶活相當(dāng)接近，最大相對(duì)誤差僅為1.68％，第三組測(cè)得的酶活值相對(duì)誤差最大不超過2.15％，可以替代標(biāo)準(zhǔn)方法的測(cè)定值。第一組測(cè)得的酶活值相對(duì)誤差最大不超過8.32％，對(duì)于要求不甚嚴(yán)格的分析也可以接受，并且更加快捷。因此，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的連續(xù)分光光度法，兩點(diǎn)法更加實(shí)用。

選取不同來源的3種葡萄糖氧化酶樣品，適當(dāng)稀釋后4000rpm/min離心10min，取上清液測(cè)定酶活力。記錄1～10min的吸光值，每分鐘記錄一次。通過公式可以看出，在計(jì)算酶活力是不需要時(shí)間點(diǎn)和吸光值嚴(yán)格的對(duì)應(yīng)關(guān)系，只需要一個(gè)時(shí)間段的吸光值變化數(shù)據(jù)，且ΔA/Δt在方法允許的線性范圍內(nèi)即可。取2～8min時(shí)的吸光值進(jìn)行線性回歸分析，同時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算酶活力，并選擇2min和8min時(shí)的吸光值進(jìn)行計(jì)算，如表12所示。

表12樣品酶活測(cè)定吸光值變化速率回歸分析與酶活計(jì)算

表12表明樣品酶活測(cè)定吸光值變化，在2～8min線性關(guān)系良好，并且標(biāo)準(zhǔn)方法與兩點(diǎn)法結(jié)果高度一致，可以直接使用兩點(diǎn)法測(cè)定。